可用于制備vii型新城疫疫苗的病毒株及其編碼基因的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種可用于制備Ⅶ型新城疫疫苗的病毒株及其編碼基因。該病毒株位保藏號是CCTCC NO:V201548、名稱為雞七型新城疫病毒(Genotype VII Newcastle disease virus)VII NDV/CB?ND02的病毒株，保藏號是CCTCC NO:V201555、名稱為雞七型新城疫病毒VII NDV/CB?ND04的病毒株，或保藏號是CCTCC NO:V201556、名稱為雞七型新城疫病毒VII NDV/CB?ND06的病毒株。該病毒株能夠有效提高宿主對新城疫病毒的免疫力、在禽類體內產生抗體免疫持續力，適于研發和制備新城疫疫苗，也可用于制造滅活或減毒型疫苗。CCTCC NO：V203 CCTCC NO:V203 CCTCC NO:V203
【專利說明】
可用于制備VI I型新城疫疫苗的病毒株及其編碼基因
技術領域
[0001] 本發明涉及生物工程領域，特別是免疫學領域，具體涉及一種可用于制備w型新 城疫疫苗的病毒株及其編碼基因。
【背景技術】
[0002] 研究報告指出：新城疫(Newcastle disease，ND)是各型禽病中最常見的一種惡性 傳染病，自1926年新城疫被發現以來，已傳播至世界上大部分國家，此新城疫在各地區的流 行不大相同。
[0003] 雞新城疫，1926年首先發現于印度尼西亞，不久又在英國新城發現，之后世界各國 均有流行記載。新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一種急性傳染病，1926年首次爆發 于印度尼西亞和英國的新城，故名新城疫病毒(Alexander DJ，1982)。它屬于副粘病毒科 (Paramyxoviridae)，聰腺炎病毒屬(Rubulavirus)家族的成員（Rima BK et al.，1995)，屬 于禽類第一型副黏液病毒。其新城疫病毒的基因組為一條單股負鏈RNA，包含約15kb堿基， 六個主要結構蛋白：3 ' -NP-P-M-F-HN-L-5 '。
[0004] 近年來，由于禽類副黏液病毒(Avian Paramyxovirus，APMV)時常被發現于許多種 類的家禽、信鴿等禽類間；當感染此種病毒時，經常對于禽鳥造成各種不同的臨床癥狀，例 如，造成禽類呼吸、消化和神經系統的障礙等。由于各類型新城疫病毒的毒性強弱差異大， 所以新城疫發生率、致病癥狀、病變征候、及致死率等亦都隨著病毒類型不同而明顯差異。 雖然輕微時病征不顯著，然而嚴重時則會導致死亡，因而晚近已引起世界各國特別地關注、 重視并且不斷進行此類病原群相關的研究及調查。
[0005] 根據感染能力和感染后所引起的臨床癥狀的嚴重性差別，新城疫病毒可分為強毒 (velogenic)、中毒(mesogenic)和弱毒（lentogenic)三類(AlexanderD J，1997) dNDV強毒 株感染力很強，通常以引起強烈性感染為特征;而NDV弱毒株的感染力和致病力很弱，一般 無急性感染病癥，事實上，包括La Sota等在內的多株弱毒NDV通常在生產上被用做活毒疫 苗。
[0006] 然而，因為新城疫的強毒力型病毒感染的死亡率高，對養雞業危害嚴重。尚無有效 治療藥物，只能依靠嚴格消毒、隔離，活毒疫苗和滅活疫苗的協同使用預防接種。目前防止 新城疫的疫苗主要使用LaSota和Hitchner B1兩種弱毒株疫苗或其滅活毒株疫苗，并且這 兩株病毒作為疫苗毒株已經應用了幾十年。LaSota和Hitchner B1兩病毒株都屬于基因 II 型，而當前流行亞洲地區的病毒株主要是基因 VII型NDV。因此，上述兩種疫苗不能在臨床應 用上提供堅強的免疫保護，此狀況也可以解釋了新城疫依舊在一些地區爆發流行的原因。
[0007] 此外，基于現有疫苗質量問題、免疫接種方式方法、免疫程序、雞場飼養管理水平、 雞群抗體水平良莠不齊的現狀，使新城疫免疫失敗屢見不鮮。可以當作一個好的疫苗候選 的病毒株需同時具有毒力弱、和遺傳穩定性好的特點，而目前國內外分尚到的新城疫病毒 普遍存在強毒株的裂解位點、效價低和容易發生變異等缺點。大部分新城疫病毒的F蛋白裂 解位點序列為強毒特征，但對雞的致病力較弱，推測這種毒力的差異可能由于病毒的復制 能力的差異而引起。為解決這一難題，有賴于對本地區流行的毒株的流行特點、變異特點進 行研究以及篩選分離出合適的優勢疫苗的病毒株，以使新城疫的防控進一步具有針對性和 有效性。
[0008] 因此，各界莫不期待以及殷切期盼開發出一種能夠解決免疫力反應低、感染力弱、 防疫效果持續力弱等的傳統技術的缺陷的w型新城疫疫苗的病毒株。

【發明內容】

[0009] 有鑒于此，本發明人等經由潛心研究及尋找用于解決傳統技術缺陷的各種可能方 案，進而篩選出一種不但能夠克服上述現有技術的缺陷，而且不會危害飼養環境及禽類健 康、且具有能夠有效提高宿主對新城疫病毒的免疫力反應、對宿主的感染力在安全范圍內、 產生抗體免疫持續力長等功效、以及能夠制成具有長效防治新城疫效能的疫苗的新穎的適 用于W型新城疫疫苗的病毒株，至此完成本發明。
[0010] 具體而言，本發明的目的在于提供一種可用于制備W型新城疫疫苗的病毒株，所 述的病毒株為保藏號是CCTCC N0:V201548、名稱為雞七型新城疫病毒（Genotype VII Newcastle disease virus)VII NDV/CB-ND02的病毒株，保藏號是CCTCC N0:V201555、名稱 為雞七型新城疫病毒（Genotype VII Newcastle disease virus)VII NDV/CB-ND04的病毒 株，或保藏號是CCTCC N0:V201556、名稱為雞七型新城疫病毒(Genotype VII Newcastle disease virus)VII NDV/CB-ND06的病毒株，這三株病毒株于2015年12月23日保藏于位于 中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心。
[0011] 在某些具體實施例中，本發明進一步提供了一種可用于制備W型新城疫疫苗的病 毒株，其中所述病毒株具有F。蛋白的編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:1~SEQ ID N0:3,分別 依次對應雞七型新城疫病毒VII NDV/CB-ND02、雞七型新城疫病毒VII NDV/CB-ND04、雞七 型新城疫病毒VII NDV/CB-ND06。
[0012] 在某些具體實施例中，本發明進一步提供了一種可用于制備W型新城疫疫苗的病 毒株，其中所述病毒株具有HN蛋白的編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:4~SEQ ID N0:6,分別 依次對應雞七型新城疫病毒VII NDV/CB-ND02、雞七型新城疫病毒VII NDV/CB-ND04、雞七 型新城疫病毒VII NDV/CB-ND06。
[0013] 具體而言，根據本發明，在某些具體實施例中，本發明進一步提供了一種可用于制 備W型新城疫疫苗的病毒株，其中所述病毒株具有P蛋白的編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:7 ~SEQ ID N0:9,分別依次對應雞七型新城疫病毒VII NDV/CB-ND02、雞七型新城疫病毒VII NDV/CB-ND04、雞七型新城疫病毒VII NDV/CB-ND06。
[0014] 另外，在某些具體實施例中，本發明進一步提供了一種可用于制備W型新城疫疫 苗的病毒株，其中所述病毒株具有Fo蛋白的切割點氨基酸序列（112~117)為SEQ ID N0: 12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0 :15中的任一種。
[0015] 再者，在某些具體實施例中，本發明進一步提供了一種可用于制備VII型新城疫疫 苗的病毒株，其中所述病毒株感染SPF雞胚的平均致死時間在20~40小時;經過弱化后，所 述病毒株的平均致死時間超過60小時。
[0016] 進一步，在某些具體實施例中，本發明提供了一種可用于制備W型新城疫疫苗的 病毒株，其中所述病毒株感染SPF雞只的腦內致病性指數的平均數值在1.7~2;經過弱化 后，所述病毒株的腦內致病性指數的平均數值在0.4以下。
[0017] 其中，在某些具體實施例中，本發明進一步提供了一種可用于制備W型新城疫疫 苗的病毒株，其中所述病毒株為感染雞胚胎培養、動物接種、或組織培養中的至少一種。
[0018] 根據某些具體實施例，本發明進一步提供了一種可用于制備W型新城疫疫苗的病 毒株，其中所述病毒株為感染Vero細胞、BHK-21細胞、或MDCK細胞中的至少一種。
[0019] 進而，根據某些具體實施例，本發明進一步提供了一種可用于制備W型新城疫疫 苗的病毒株，其中所述病毒株的核苷酸序列，而所述核苷酸序列中一個或多個核苷酸可進 一步被其他的核苷酸所置換。
[0020] 此外，本發明的另一個目的在于提供一種免疫原性組合物。根據某些具體實施例， 本發明進一步提供了一種可用于制備W型新城疫疫苗的病毒株，更進一步可以用于一種免 疫原性組合物，其所述免疫原性組合物可以包含在藥學上可接受的載體。
[0021] 再者，根據某些具體實施例，本發明進一步提供了一種可用于制備W型新城疫疫 苗的病毒株，更進一步可以用于制備一種疫苗組合物，其所述疫苗組合物可以包含在藥學 上可接受的載體。
[0022] 根據某些具體實施例，本發明提供了一種可用于制備W型新城疫疫苗的病毒株， 更進一步可以用于制備一種疫苗組合物，所述疫苗組合物為單價疫苗組合物。
[0023] 根據某些具體實施例，本發明提供了一種可用于制備W型新城疫疫苗的病毒株， 更進一步可以用于制備一種疫苗組合物，其所述疫苗組合物為多價疫苗組合物。
[0024]下文將對于本說明書中所使用的特定用語或名詞進行描述性的說明；然而，下列 說明僅為例示性說明，意圖并非用于限制本發明說明書及申請專利范圍。除非本說明書另 有定義以外，在本文中所用的科學與技術詞匯的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知 識者所理解與慣用的意義相同。
[0025] 在本文中，所謂"適用于W型新城疫疫苗的病毒株"指的是病毒株能夠用來引起宿 主免疫反應的特異性抗原，其包括但不限于全病毒、表面血球凝集抗原（hemagglutinin surface antigen)、表面神經胺酸酶抗原（neuraminidase surface antigen)、及內部核白 衣抗原（internal nucleocapsid antigen)、或衍生物等。
[0026] 本文術語中關于禽類VII基因型新城疫感染的''預防"指的是抑制禽類VII基因型 新城疫病毒株復制、抑制禽類VII基因型新城疫病毒株傳播、或預防禽類VII基因型新城疫 病毒株在其宿主中生長、以及緩和禽類VII基因型新城疫病毒株感染引起的疾病或病癥的 癥狀。本發明方法具有多方面的技術效果，例如可有效的預防以及降低禽類呼吸道及神經 系統的損害。
[0027] 本文術語的''禽類VII基因型新城疫滅活疫苗"意指用于預防因若感染禽類第VII 基因型新城疫病毒株引起的病癥或疾病的疫苗。禽類VII基因型新城疫滅活疫苗可包括任 何有效治療或預防禽類經禽類VII基因型新城疫感染的疫苗。優選地，本發明方法使用的病 毒株疫苗為禽類VII基因型新城疫滅活疫苗。
[0028] 本文術語的 ''動物"意指所有非人類動物，包括哺乳動物。
[0029] 本文術語的''禽類"意指小雞、雞、火雞、鴨、母雞、雌雞、閹雞、土雞、公雞、山雞及禽 類屬的成員。
[0030]優選地，本發明方法施用于非人類的哺乳動物;最優選地為禽類。
[0031] 本文術語的''病毒株疫苗"意指適用于作為疫苗的滅活全部滅活或部分滅活的禽 類VII基因型新城疫病毒株，可以為雞胚尿囊及/或細胞制劑。
[0032] 本文術語的''有效量"意指于投用后可充分引起禽類免疫反應的禽類VII基因型新 城疫滅活疫苗量。免疫反應包含(而未限制)先天誘發的、細胞的及/或體液免疫反應。
[0033] 在本文中，對于用以界定本發明范圍的數值與參數，本質上不可避免地含有因個 別測試方法所致的標準偏差，因而大多是以約略的數量值來表示，然而中具體實施例中則 盡可能精確呈現的相關數值。在本文中，「約」通常視本領域技術人員的考慮而定，一般系指 代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，例如，所述實際數值為在一特定數值或 范圍的 ±10%、±5%、±1%、或 ±0.5% 以內。
[0034]本發明于自野外田間采樣分離出一種適用于W型新城疫疫苗的病毒株。
[0035] 具體而言，本發明提供一種可用于制備W型新城疫疫苗的新城疫病毒株，所述病 毒株的生物保藏號為￥201548、￥201555、￥201556，命名為08-勵02、08-勵04、08-勵06。
[0036] 根據某些具體實施例，本發明的可用于制備W型新城疫疫苗的新城疫病毒株，所 述病毒株可用于制備疫苗，編碼F。蛋白的核苷酸序列的長度并未特別加以限定，只要是在 不違背或脫離本發明精神以及能夠達到引起宿主免疫反應效果的范圍內即可。舉例來說， 對于可用于制備W型新城疫疫苗的新城疫病毒株而言，所述編碼F。蛋白的核苷酸序列可以 是例如第1個核苷酸至約第900個核苷酸的范圍；在某些具體實施例中，優選為約20個核苷 酸至約第800個核苷酸的范圍；更優選為在約50個核苷酸至約第700個核苷酸的范圍；特別 優選為在約60個核苷酸至約第600個核苷酸的范圍；最優選為在約100個核苷酸至約第500 個核苷酸的范圍。
[0037] 根據某些具體實施例，本發明的可用于制備W型新城疫疫苗的病毒株，可用于制 備疫苗，編碼HN蛋白的核苷酸序列的長度并未特別加以限定，只要是在不違背或脫離本發 明精神以及能夠達到引起宿主免疫反應效果的范圍內即可。舉例來說，對于可用于制備W 型新城疫疫苗的病毒株而言，所述編碼HN蛋白的核苷酸序列可以是例如第1個核苷酸至約 第900個核苷酸的范圍；在某些具體實施例中，優選為約20個核苷酸至約第800個核苷酸的 范圍；更優選為在約50個核苷酸至約第700個核苷酸的范圍；特別優選為在約60個核苷酸至 約第600個核苷酸的范圍；最優選為在約100個核苷酸至約第500個核苷酸的范圍。
[0038] 根據某些具體實施例，本發明的可用于制備W型新城疫疫苗的病毒株，用于制備 疫苗，編碼P蛋白的核苷酸序列的長度并未特別加以限定，只要是在不違背或脫離本發明精 神以及能夠達到引起宿主免疫反應效果的范圍內即可。舉例來說，對于用于制備W型新城 疫疫苗的病毒株而言，所述P蛋白的核苷酸序列可以是例如第1個核苷酸至約第1188個核苷 酸的范圍；在某些具體實施例中，較優選為約20個核苷酸至約第1100個核苷酸的范圍；更優 選為在約50個核苷酸至約第900個核苷酸的范圍;特別優選為在約60個核苷酸至約第850個 核苷酸的范圍；最優選為在約100個核苷酸至約第800個核苷酸的范圍。
[0039] 根據某些具體實施例，本發明的用于制備W型新城疫疫苗的新城疫病毒株，其具 有Fo蛋白的切割點氨基酸序列并未特別加以限定，只要是在不違背或脫離本發明之精神， 以及能夠達到引起宿主致病力的Fo蛋白的切割點氨基酸序列即可。舉例來說，對于可用于 制備W型新城疫疫苗的病毒株而言，所述病毒株具有Fo蛋白的切割點氨基酸序列，例如可 以是 112RRQKRFm、112RRQRRFm、112KRQKRF m、或112KRQRRFm至少其中一種；在某些具體實施 例中，較優選為112RRQKRFm、112RRQRRFn V12KRQKRFm、或112KRQRRFm至少其中一種;更優選 為 112RRQKRFnV12RRQRRFm、或 112KRQKRFm 至少其中一種；特別優選為 112RRQKRFm、或 112RRQRRF117〇
[0040] 根據某些具體實施例，本發明的用于制備W型新城疫疫苗的新城疫病毒株，其宿 主平均死亡時間(MDT)的病原性鑒定的效果并未特別加以限定，只要是在不違背或脫離本 發明精神以及能夠達到引起宿主平均死亡時間的范圍內即可。舉例來說，對于可用于制備 W型新城疫疫苗的病毒株而言，所述病毒株使宿主平均死亡時間，例如可以是約1個小時至 約120個小時的范圍；在某些具體實施例中，較優選為約5個小時至約110個小時的范圍；更 優選為在約10個小時至約90個小時的范圍；特別優選為在約20個小時至約80個小時的范 圍；最優選為在約30個小時至約60個小時的范圍。
[0041] 具體而言，根據本發明提供一種用于制備W型新城疫疫苗的病毒株，所述病毒株 經過弱化后，其所述病毒株的平均致死時間超過60小時。
[0042] 根據某些具體實施例，本發明的用于制備W型新城疫疫苗的病毒株，其宿主腦內 致病性指數(ICPI)的病原性鑒定的效果并未特別加以限定，只要是在不違背或脫離本發明 之精神以及能夠達到引起宿主大腦內接種致病性指數的范圍內即可。舉例來說，對于可用 于制備W型新城疫疫苗的病毒株而言，所述病毒株使宿主大腦內接種致病性指數，例如可 以是平均值約0至約2的范圍；在某些具體實施例中，較優選為平均值約0.5至約1.99的范 圍；更優選為平均值約0.6至約1.95的范圍；特別優選為平均值約0.7至約1.9的范圍；最優 選為平均值約〇. 9至約1.85的范圍。
[0043] 具體而言，本發明提供一種用于制備W型新城疫疫苗的病毒株，所述病毒株經過 弱化后，其所述病毒株的腦內致病性指數的平均數值在0.4以下。
[0044]其中，在某些具體實施例中，本發明的用于制備W型新城疫疫苗的新城疫病毒株， 其中所述病毒株感染培養方式并未特別加以限定，只要是在不違背或脫離本發明之精神即 可。舉例來說，例如可以是雞胚胎培養、動物接種、或組織培養。根據本發明的某些具體實施 例，所述病毒株系用為感染培養方式例如可以是自雞胚胎培養、動物接種、或組織培養中的 至少一種;適用于本發明的可用于制備W型新城疫疫苗的病毒株較優選的感染培養方式是 使用雞胚胎培養、動物接種、或組織培養;更優選的感染培養方式是雞胚胎培養、或組織培 養;特別優選為雞胚胎培養。
[0045] 本發明的用于制備W型新城疫疫苗的新城疫病毒株，其感染細胞種類并未特別加 以限定，只要是在不違背或脫離本發明之精神即可。舉例來說，例如可以是Vero細胞、BHK-21細胞、或MDCK細胞。根據本發明的某些具體實施例，所述感染細胞種類的細胞株來源例如 可以是Vero細胞、BHK-21細胞、或MDCK細胞中的至少一種;本發明的可用于制備W型新城疫 疫苗的新城疫病毒株的感染細胞種類較優選使用來源為Vero細胞、BHK-21細胞、或MDCK細 胞;更優選使用來源為Vero細胞、或BHK-21細胞;特別優選使用來源為Vero細胞。
[0046] 具體而言，本發明提供一種用于制備W型新城疫疫苗的新城疫病毒株，其中所述 新城疫病毒株的核苷酸序列，而所述核苷酸序列中一或多個核苷酸可進一步被其他的核苷 酸所置換。
[0047] 此外，具體而言，根據本發明之一可以提供一種用于制備W型新城疫疫苗的新城 疫病毒株，更進一步提供了 一種免疫原性組合物，其包含在藥學上可接受的載體。
[0048] 另外，具體而言，本發明提供一種用于制備VII型新城疫疫苗的新城疫病毒株，更進 一步提供了一種疫苗組合物，其包含在藥學上可接受的載體。
[0049] 再者，具體而言，本發明提供一種用于制備W型新城疫疫苗的新城疫病毒株，更進 一步提供了一種疫苗組合物，其為單價疫苗組合物。
[0050] 另外，具體而言，本發明提供一種用于制備w型新城疫疫苗的新城疫病毒株，更進 一步提供了一種疫苗組合物，其為多價疫苗組合物。
【附圖說明】
[0051] 圖1概略顯示了在本發明的一具體實施例中之W型新城病疫苗病毒株的采集步驟 之流程圖： 在該圖1中，步驟S1:表示自感染新城疫(NDV)的家禽飼養場采集病毒株之步驟； 步驟S2:表示將在步驟1所采集到的病毒株于SPF雞胚尿囊胚中培養之步驟； 步驟S3:表示觀測感染細胞有無出現病毒斑點之步驟； 步驟S4:表示量測感染雞胚之平均致死時間之步驟； 步驟S5:表示量測感染雞胚之腦內致病性指數之步驟； 步驟S6:表示對于S1步驟采集到的W型新城病疫苗病毒株進行其F〇蛋白、HN蛋白及P蛋 白的核苷酸定序之步驟； W:表示檢體VI~V5; Y:表示病毒株 CB-ND01、CB-ND02、CB-ND03、CB-ND04、CB-ND06。
【具體實施方式】
[0052]以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明 的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。以 下，進一步列舉實施例來說明本發明之病毒株之分離與篩選方法。 實施例1~5 《野外田間病例米集病毒株》
[0053]首先，依照如圖1所示之W型新城病疫苗之病毒株的采集步驟，自曾感染新城疫 (NVD)的家禽類飼養場，從已感染雞只的肺、氣管、腸、及腦部采集組織病理樣本，共采集5個 樣本，每個樣本各10克重。于室溫，將所述5個組織病理樣本分別置放于含有2 %胎牛血清的 MEM培養基（modified minimal essential medium)中，以組織研磨機（homogenizer)充分 磨碎;分別取其懸浮液，接著以1，500rpm離心15分鐘后，再以0.2μπι濾膜過濾;取其上淸液做 為待檢樣本VI-V5。《雞胚尿囊腔培養病毒株》
[0054] 接著，取50ml所述待檢樣本V1-V5接種在9日齡無特定病源（specific pathogen free;SPF)的雞胚尿囊腔中，然后放置于37°C的孵卵器中培養，繼續培養7日并觀察每日雞 胚死亡的情況。對于死亡的雞胚進行病理解剖并收集尿囊腔中的液體做為病毒株樣本，編 碼CB-ND01、CB-ND02、CB-ND03、CB-ND04、CB-ND06。 《含有新城疫病毒的感染待檢樣本有產生病毒斑點》
[0055] 首先，用病毒株樣本分別和Vero細胞株(綠猴腎細胞，ATCC:CCL81)在6孔培養盤中 一起培養，于含有10%胎牛血淸(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培養基(Dulbecco's modified Eagle medium)(5毫升/孔）、5%C〇2及37°C的培養環境下培養。
[0056] 使上述細胞，長到細胞密度(confluence)達到約80 %左右，成單層Vero細胞后。將 上述單層Vero細胞去除原先的培養基，以磷酸緩沖溶液(phosphate-buffered saline ; PBS，pH= 7.2)淸洗一次后，每孔加入0.5ml含病毒株樣本的培養液，進行培養液稀釋，倍數 分別為101倍、1〇 2倍、1〇3倍、1〇4倍、1〇5倍、1〇6倍，最后一孔為〇. 5ml細胞培養液對照組。
[0057] 把培養盤放置于5 % 0)2及37 °C的環境下培養，作用一個小時；在作用期間每15分 鐘輕搖培養盤，讓含病毒株樣本的培養液可以均勻覆蓋細胞層。
[0058]繼而，移除含病毒株樣本的培養液，每孔加入4ml含1 %瓊脂(agar)的維持培養液， 放置于5%0)2及37°(：的培養環境下培養，培養后經過48小時，挑選培養細胞中有因病毒感 染而產生明顯CPE，且于每個孔加入0.5ml濃度為0.1 %的中性紅溶液，再以錫箱紙包住，置 于5%?)2及37°(：的培養環境下培養，培養至隔夜后，進行觀察病毒斑點產生的狀況。
[0059]根據本發明之實施例1~實施例5的NDV的病毒株樣本在感染細胞后，有無產生CPE 結果，統計如《表1》所示。
實施例6~10 《新城疫疫病毒的鑒定》 1.平均致死時間（Mean death time，MDT)
[0061] 在室溫下，從以PBS稀釋106倍、107倍、108倍、109倍的含有實施例1~實施例5的病 毒株樣本CB-ND01~CB-ND06的稀釋液中，各取0. lml，分別接種于5個9~10日齡SPF雞胚，然 后放置于37°C的孵卵器中培養，以每日2次的頻率實施照蛋檢查，記錄雞胚死亡時間，總計 連續實施7日，并計算最小致死劑量(the minimum lethal dose，MDT)。
[0062] 實施例6~實施例10的NDV的MDT鑒定結果記載于表3。
[0063] 表 3
[0064] 根據表3的實施例6至實施例10的CB-ND02、CB-ND04、CB-ND06新城疫病毒株的MDT 試驗結果，可以確認的MDT皆在44小時至48小時之間，因而CB-ND02、CB-ND04、CB-ND06三株 病毒株為強毒株，而且可以確認本發明的病毒株的病毒力價明顯優于目前市售疫苗的病毒 株，例如，BC病毒株(MDT:62小時）、LaSota病毒株(MDT:90小時）等。
[0065] 另一方面，實施例1的CB-ND01、實施例3的CB-ND03之MDT都超過120小時以上，因而 CB-ND01、CB-ND03 為弱病毒株。 《腦內致病性指數》（Intracerebral pathogenicity index; ICPI)
[0066] 首先，要測量出1單位（1HAU)的抗原最高稀釋倍數仍有血球凝集作用的為HA效價； 先在U型平盤每孔加入50yL HI緩沖液(3.25g KH2P〇4、10.8g Na2HP〇4、170g NaCl、D3W加至2， OOOmL)〇
[0067] 第一孔加入待測血清病毒抗原50μ1，與生理鹽水充分混合后吸取25μ1注入第二孔 中，如此進行二倍連續稀釋，最后一孔棄置25μ1混合液。
[0068] 最后每孔加50yL 1%雞紅血球液(cRBC)，并于室溫作用30分鐘后判讀；以抗原最 高稀釋倍數仍有血球凝集作用的為其HA效價，此即為1單位（1HAU)之抗原最高稀釋倍數仍 有血球凝集作用的為HA效價。
[0069]抽取病毒株樣本且HA效價高于16者，以生理鹽水稀釋10倍，在于每組10只，1日齡 SPF雞腦內接種，每只0.05ml，接種后每24小時觀察一次，連續觀察8日，正常雞記錄值為0， 病雞1，死亡雞2，ICPI即為全部8日內每日每只雞的平均數值。 實施例11~15
[0070] 實施例6~實施例10NDV的ICPI鑒定結果記載于表4。
[0072] 根據表4的實施例11~實施例15之CB-ND02、CB-ND04、CB-ND06新城疫病毒株的 I CP I試驗結果，可以確認I CP I的平均數值皆在1.7至1.8之間，因而CB-ND0 2、CB-ND04、CB-ND06之三株病毒株為強毒株，而且可以確認本發明之病毒株的毒價明顯優于目前市售疫苗 的病毒株，例如，BC病毒株(ICPI :0.25)、LaSota病毒株(ICPI :0.5)等。
[0073] 另一方面，實施例11的CB-ND01、實施例13的CB-ND03的ICPI都在0.3以下，因而CB- ND01、CB-ND03為弱病毒株。 實施例16~20 《新城疫病毒之定序》
[0074]首先，要對本發明的新城疫病毒株提取RNA，但為避免RNase污染實驗器具及消化 病毒R N A而影響結果，所有使用于接觸R N A的溶液均以焦碳酸二乙酯 (diethylpyrocarbonate，DEPC)處理過的蒸餾水配制。其他塑料性材料經高壓滅菌后，也應 置于操作RNA病毒專用的特定保存處，以避免與操作非RNA的材料混用。
[0075]再來，把上述從尿囊腔中收集到的感染待檢樣品V1-V5,取250yL尿囊液與750yL TriZole (Invi trogen)混合靜置5分鐘，加入200yL氯仿（chlorof orm)混合至乳糜狀，于室溫 靜置10分鐘后再以13,000rpm，4°C離心10分鐘，取上層水液約500yL至新的離心管，加入等 量異丙醇（丨8<^1'<^3]1〇1)均勾混合，于4 <€以13,000印1]1離心10分鐘后倒棄上層液，加入11111^ 70%酒精洗去鹽類，再以4°C 13，OOOrpm離心10分鐘，倒棄上層液，將沉淀物置50-60°C烘箱 烘干，以DEPC處理過的水50yL懸浮沉淀物，感染樣本(II~15)。
[0076]再者，將感染樣本（I1~15)先和Vero細胞株在含有2 %胎牛血淸的DMEM培養基中 一起培養，再利用市售購得的核醣核苷酸(RNA)提取試劑盒(QIAamp viral RNA mini kit， Qiagen Inc.，Santa Clara，CA)，將感染樣本(II~15)中的RNA，自感染細胞株中提取出來 作為感染病毒的RNA樣本(R1~R5)。
[0077]以RNA樣本(R1~R5)為模板，利用一般實驗室已知常用的反轉錄-聚合酶鏈反應 (Reverse Transcription-PCR，簡稱RT-PCR)技術，將病毒全長基因復制成若干片段后，以 進行第一股cDNA合成。
[0078] 隨后進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction;PCR)，利用表5中的引子 序列SEQ ID NO: 10、SEQ ID N0:11當作聚合酶連鎖反應之引物，及配合反應條件為先加熱 94°C、5分鐘，破壞反應混合液中所存在的蛋白酶，再進行35個循環反應。每個反應為94°C、1 分鐘的變性反應，55 °C、1分鐘的煉合反應(退火反應），72 °C、每1Kb使用1分鐘的DNA合成反 應。經35個循環反應后，再作用72°C、10分鐘，將PCR合成產物的兩端補齊，其反應結束后，其 可以得到目標基因之F蛋白的產物。
[0079] PCR反應后。取5yL在1 %瓊脂糖(agarose)膠片中電泳，分析PCR產物中DNA片段大 小見《表6》。
實施例21~25
[0082]接下來，將上面實施例16~實施例20后的產物放置在冰上，取45yL PCR產物于1% 瓊脂糖膠片中進行電泳。完成電泳后的膠體置于含5yg/mL EB(ethidium bromide)染色液 內，浸泡5分鐘，再以二次蒸餾水褪染10分鐘。
[0083]在波長320nm紫外燈下，以手術刀片切下所述特定DNA片段的膠片。放入已預先秤 重的微量離心管，再秤其總重量，計算膠片重量。
[0084]利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（agarose gel extractionkit，VI0GENE Gel Extraction System)，自瓊脂糖凝膠體中回收DNA。首先于裝有膠體的微量離心管中加入 0.5mL buffer GEX。置于60°C水浴10分鐘，每隔2分鐘反轉離心管，使GEX均勻懸浮于溶液 中。將凝膠回收柱子(Gel extraction column)套入收集管，將溶解的膠及GEX混合液加入 column 13000rpm離心30秒，去除濾液；加入0 · 5mL洗滌緩沖液（Washing Buff er)于 13000rpm離心30秒，棄除濾過液體；再加入0.7mL洗滌緩沖液（Washing Buffer)，于 13000rpm離心30秒后棄除過濾液;將柱子(column)放入一新的收集管，加入30yL經DEPC處 理過的二次蒸餾水，靜置1分鐘后13000rpm離心2分鐘，收集濾過液達到本發明新城疫病毒 株遺傳物質的純化，直接進行新城疫病毒株的F〇蛋白切割點氨基酸序列、及全基因核苷酸 序列分析(用全自動分析儀），結果記載表7及表8。
[0086]表7顯示了實施例21~實施例25的NDV Fo蛋白的切割點氨基酸序列的分析結果。 根據表7所述的Fo蛋白切割點氨基酸序列數據，可以確認實施例22的CB-ND02、實施例24的 CB-ND04、實施例26的CB-ND06為強毒株;而且可以確認本發明的病毒株具有強病毒株F〇蛋 白切割點氨基酸序列，明顯不同于目前市售疫苗之病毒株，例如，BC病毒株( mGRQGRLm)、 LaSota 病毒株（112GRQGRL117)等。
[0087] 另外，可以確認實施例21的CB-ND01、實施例23的CB-ND03為弱毒株。
[0088] 因此，CB-ND02、CB-ND04、CB-ND06的新城疫強毒株具有由Q隔開的兩對堿性氨基 酸，且容易被宿主的蛋白水解酶(f ur in)識別和裂解;而CB-ND01、CB-ND03的新城疫弱毒株 不具有由Q隔開的兩對堿性氨基酸，而以非活性前體Fo蛋白的形式傳遞到子代，不易被宿主 的蛋白水解酶(furin)識別和裂解，感染活性降低或喪失。
[0089] 綜上，實施例1~實施例25例示的本發明的可用于制備W型新城疫疫苗的新城疫 病毒株 CB-ND01、CB-ND02、CB-ND03、CB-ND04、CB-ND06 中，CB-ND02、CB-ND04、CB-ND06 為強病 毒株;CB-ND01、CB-ND03為弱病毒株。
[0090] 從而，可以確認本發明的新城疫病毒株與市售疫苗的病毒株相比，MDT的感染效果 強50%，且ICPI的平均數值高出接近2倍效果。本發明的禽類VII基因型病毒株能夠明顯地 引起雞只的免疫反應，進而可以開發為具有對抗VII基因型新城疫感染的疫苗及其相關應 用。 【生物材料保藏】
[0091]將本發明該病毒株保藏于中國典型培養物保藏中心（China Center For Type Culture Collection，CCTCC)，保藏日為2015年 12月23 日；CB-ND02病毒株的保藏號為CCTCC 如：￥201548,08-_04病毒株的保藏號為￥201555、08-_06病毒株的保藏號為0：1'0^〇: V201556。
[0092]綜上所述，本發明的內容已經以如上的實施例舉例說明，然而本發明并非僅限定 于此等實施方式而已。本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和 范圍內，當可再進行各種的更動與修飾;例如，將前述實施例中所例示的各技術內容加以組 合或變更而成為新的實施方式，此等實施方式也當然視為本發明所屬內容。因此，本案所欲 保護的范圍也包括前述的申請專利范圍及其所界定的范圍。
【主權項】
1. 一種可用于制備νπ型新城疫疫苗的病毒株，其特征在于，所述的病毒株為保藏號是 CCTCC N0:V201548、名稱為雞七型新城疫病毒（Genotype VII Newcastle disease virus) VII NDV/CB-ND02的病毒株，保藏號是CCTCC N0:V201555、名稱為雞七型新城疫病毒 (Genotype VII Newcastle disease virus)VII NDV/CB-ND04的病毒株，或保藏號是CCTCC N0:V201556、名稱為雞七型新城疫病毒（Genotype VII Newcastle disease virus)VII NDV/CB-ND06的病毒株，這三株病毒株于2015年12月23日保藏于位于中國武漢武漢大學的 中國典型培養物保藏中心。2. 根據權利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述的病毒株具有Fo蛋白，Fo蛋白的編 碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1~SEQ ID N0:3。3. 根據權利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述病毒株具有HN蛋白，HN蛋白的編碼 基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:4~SEQ ID N0:6。4. 根據權利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述病毒株具有P蛋白，P蛋白的編碼基 因的核苷酸序列為SEQ ID N0:7~SEQ ID N0:9。5. 根據權利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述病毒株具有Fo蛋白的切割點氨基酸 序列，即第 112~117位氨基酸為SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15中的任一種。6. 根據權利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述病毒株感染SPF雞胚的平均致死時 間在20~50小時;經過弱化后，所述病毒株的平均致死時間超過60小時。7. 根據權利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述病毒株感染SPF雞只的腦內致病性 指數的平均數值在1.7~2;經過弱化后，所述新城疫病毒株的腦內致病性指數的平均數值 在0.4以下。8. 根據權利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述病毒株是用以感染雞胚胎培養、動 物接種、或組織培養中至少一種。9. 根據權利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述病毒株是用以感染Vero細胞、BHK-21細胞、或MDCK細胞中的至少一種。10. 根據權利要求2至4中任一項所述的病毒株，其特征在于，所述病毒株的核苷酸序列 中一或多個核苷酸可進一步被其他的核苷酸所置換。
【文檔編號】C12N7/00GK105886477SQ201610339704
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月20日
【發明人】林建宏
【申請人】國年實業有限公司