一種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的引物、試劑盒及其方法
【專利摘要】本發明公開了一種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的引物、試劑盒及其方法，該引物包括Vp1?B1基因分子標記的2條正向引物和1條反向引物，TaPHS1基因分子標記的1條正向引物和1條反向引物，PM19?A1基因分子標記的1條正向引物和1條反向引物，通過兩次PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳實現的。第一次PCR反應中用三對引物對全部待測材料進行檢測，第二次PCR反應中用一對引物對第一次PCR反應中不能很好區分的材料進行檢測。綜合兩次PCR可明確鑒定全部主效休眠等位基因，利用含有多對引物組合的第一次PCR反應可明確鑒定三個主效休眠位點的強休眠等位基因。本發明為小麥品種資源和育種群體后代休眠等位基因的有效鑒定和選擇提供一種簡單、快速和準確的方法。
【專利說明】
-種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的引物、試劑盒及其 方法
技術領域
[0001] 本發明屬于植物分子標記技術領域，具體設及一種通量鑒定小麥種子主效休眠基 因的引物、試劑盒及其方法。
【背景技術】
[0002] 穗發芽(Pre-harvest sprouting,簡稱PHS)是指收獲前遇到陰雨天氣時巧粒在穗 上發芽的現象，是一種世界性的氣候農業災害。穗發芽不僅降低產量而且嚴重劣化巧粒品 質和種用價值。我國長江中下游、西南冬麥區和東北春麥區是穗發芽危害頻繁和嚴重的地 區，黃淮和北部冬麥區也時有發生，受穗發芽危害的麥區約占全國小麥總面積的83%，對小 麥的優質、高產生產極為不利。選育和推廣抗穗發芽小麥品種是解決運一問題的最有效途 徑。
[0003] 穗發芽是受遺傳基因控制和環境因素影響的復雜數量性狀。巧粒休眠特性是影響 小麥穗發芽抗性的主要遺傳因素。國內外學者利用不同的遺傳分析群體，在2B、2D、3A、3B、 30、44、48、40和70等染色體上定位出了多個控制小麥巧粒休眠的9化位點(數量性狀遺傳位 點），并建立了與基因位點連鎖的分子標記。近年來的研究表明，位于染色體3化、3AS和4AL 的3個QTL位點是控制巧粒休眠的主效基因，與小麥種質資源的穗發芽性狀密切相關。染色 體3化上的種子特異性的轉錄因子化1-B1，在促進種子成熟和維持胚休眠方面發揮重要作 用。目前已報道化1-B1基因位點的突變類型（等位基因）有6個，編號分別為化1-Bla~化1- Blaf。該基因等位變異與小麥種子休眠關系緊密，攜有化1-Bla的品種休眠性最差，表現穗 發芽敏感；攜有Vpl-Blb和Vpl-Blf的品種休眠性強，表現抗穗發芽。位于染色體3AS上的 化PHS1基因具有促進種子休眠的作用，該基因內含子3區域發生的單堿基突變導致功能缺 失的翻譯蛋白，含有該突變等位基因的品種巧粒休眠性降低，表現易穗發芽。目前報道的 化PHS1等位基因有2個，分別控制種子的強、弱休眠特性。位于染色體4AL的PM19-A1基因編 碼受脫落酸ΑΒΑ誘導的質膜蛋白19,是種子休眠的正向調控因子，有些品種在該基因啟動子 區發生18bp核巧酸片段的缺失，導致種子休眠性降低、易穗發芽;含有該18bp核巧酸片段的 等位基因的品種則休眠性強、抗穗發芽。
[0004] 研究表明，在多季節、多環境條件下，上述主效基因能解釋絕大部分的小麥種子休 眠變異和穗發芽表型變異。通過聚合優良抗性基因的分子育種手段提高種子休眠性，培育 抗穗發芽品種，是降低小麥穗發芽危害的最有效途徑。目前，能用于穗發芽抗性分子標記輔 助選擇的有效標記較少。近年來，有學者針對不同的休眠等位基因設計了與之緊密連鎖的 功能分子標記，但對每一種等位基因的檢測都需要采用一對不同的標記引物和一次PCR反 應。對于多基因控制性狀的分子標記鑒定，運些標記檢測方法均存在步驟繁瑣，費時費力， 且費用成本高等缺點，特別不適合大規模小麥種質資源和育種分離群體后代的鑒定工作， 很難在科學研究或育種實踐中普遍應用。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種簡單、快速、準確地通量鑒定Ξ 個小麥種子主效休眠基因的引物、試劑盒及其檢測方法。
[0006] 本發明的目的通過W下技術方案來實現:一種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的 引物，所述小麥種子主校休眠基因為化1-B1基因、TaP服1基因和PM19-A1基因；其中，
[0007] 所述化1-B1基因的分子標記引物包括2條正向引物和1條反向引物，正向引物1序 列如沈9 10齡.1所示：5'-4〔4了4了64了66644了〇：6-3'，正向引物2序列如569 10齡.2所示： 5'-TCTGATACCATATATACTTGC-3'，反向引物序列如SEQIDNo.3所示：5'- TCTCACCAGTGTTCTCTA-3'；
[000引所述化P服1基因的分子標記引物包括1條正向引物和1條反向引物，正向引物序列 如569 10齡.4所示：5'-6644〔464了6〔44圳44464-3'，反向引物序列如569 10齡.5所示： 5'-AGGATGTGAGACCAGTTGAC-3'；
[0009] 所述PM19-A1基因的分子標記引物包括1條正向引物和1條反向引物，正向引物序 列如569 10齡.6所示：5'-〔6了6466了66刊641'1'〔6-3'，反向引物序列如沈9 10齡.7所示： 5 '-TGGTGAAGTGGAGTGTAGT-3 '。
[0010] 上述的引物在通量鑒定小麥種子主效休眠基因的應用。
[0011] -種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的試劑盒，包含如權利要求1所述的引物。
[0012] 一種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的試劑盒，它還包括Buffer、MgCl2、dNTP和 Taq 酶。
[0013] 上述試劑盒在通量鑒定小麥種子主效休眠基因的應用。
[0014] 上述引物通量鑒定小麥種子休眠基因的方法，它包括W下步驟：
[001引 S1.使用化1-B1基因的分子標記正向引物1和反向引物、TaPHSl基因的分子標記引 物和PM19-A1基因的分子標記引物形成的引物組合，對小麥DNA進行PCR擴增，并將擴增產物 進行瓊脂糖凝膠電泳并染色鑒定等位基因，其中，1224bp擴增條帶鑒定為化PHS1位點的弱 休眠等位基因，強休眠等位基因沒有擴增條帶;4846口、6776口、45抓口、6146口的擴增條帶分別 鑒定為化1-B1位點的等位基因化1-Bla、化1-B化、化1-Bld和化1-Blf，其中化1-B化和化1- Blf為強休眠等位基因，Vpl-Bla為弱休眠等位基因；195bp和177bp的擴增條帶分別鑒定為 PM19-A1位點的強休眠等位基因和弱休眠等位基因；
[0016] S2.使用化1-B1基因的分子標記正向引物2和反向引物進行PCR擴增檢測，并將擴 增產物進行凝膠電泳并染色鑒定等位基因，其中，有擴增條帶的鑒定為等位基化1-Ble，沒 有擴增條帶的為等位基因化1-Blc。
[0017] 本發明具有W下優點:本發明中設計的引物組合，在第一次PCR反應中可W鑒別Ξ 個主效休眠位點的強休眠等位基因，對于第一次PCR反應不能很好鑒別的等位基因化1-Blc 和化1-Ble，通過第二次PCR反應十分容易區分。所W綜合兩次PCR結果，可W明確地鑒定Ξ 個主效休眠位點的全部休眠等位基因。實驗結果經測序驗證，本發明鑒定主效休眠等位基 因結果可靠、重復性好，為小麥品種資源休眠等位基因的有效鑒定和選擇提供一種簡單、快 速和準確地通量鑒定Ξ個小麥主效休眠等位基因的引物、試劑盒及其檢測方法，解決了傳 統分子標記技術在數量性狀多基因檢測過程中存在的操作繁瑣、時間長和費用成本高的難 題。
【附圖說明】
[0018] 圖1為主效休眠等位基因在第一次PCR反應中的擴增片段凝膠電泳圖；圖中，字母a ~f分別代表等位基因化1-Bla~化為標準分子量D2000;
[0019] 圖2為等位基因化1-Blc和化1-Ble在第二次PCR反應中的擴增片段凝膠電泳圖；圖 中，Μ為標準分子量D2000;
[0020] 圖3為部分四川小麥品種主效休眠等位基因的第一次PCR鑒定圖；圖中，泳道1~15 表示供試小麥品種，Μ為標準分子量D2000;
[0021] 圖4為部分四川小麥品種主效休眠等位基因的第二次PCR鑒定圖；圖中，泳道12~ 15表示與第一次PCR對應的供試品種，e代表等位基因化l-Ble，M為標準分子量D2000。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合附圖及實施例對本發明做進一步的描述，本發明的保護范圍不局限于W 下所述。
[0023] 實施例1 :DNA的提取及PCR引物設計
[0024] (l)DNA的提取及檢測
[0025] 采用CTAB方法提取小麥種子總DNA，利用紫外分光光度計檢測DNA的質量和濃度。
[0026] (2)PCR引物設計
[0027] 分析比較等位基因序列的突變特征，針對基因擴增區域，采用Prime巧生物學軟件 設計基因特異性分子標記引物，保證引物間連續互補不超過4bpW防止發生交叉錯配，引物 序列見表1。第一次PCR反應采用化1-B1基因正向引物1、反向引物，TaPHSl基因正、反向引物 對和PM19-A1基因正、反向引物對組成的引物組合。第一次PCR實質是多重PCR，是在傳統PCR 原理的基礎上進行改進壌即在同一反應體系中加入多對特異性引物撰對多個DNA模板或同 一模板的不同區域擴增出多個目的DNA片段。第二次PCR為普通PCR，采用化1-B1基因正向引 物2和反向引物形成的引物對對目的基因進行PCR擴增，不同等位基因的預期擴增目的片段 大小見表2。
[002引表1:PCR引物序列
[0033] 注:表中-表示沒有擴增產物;/表示未進行PCR反應。
[0034] 實施例2 :PCR體系的建立及測序驗證
[0035] 進一步優化PCR反應體系和熱循環條件，利用實施例1的引物組合對含有不同等位 基因的小麥材料進行PCR擴增及檢測：
[0036] 第一次（多重)PCR反應體系總體積為20ul，包括1XPCR Buffer(Mg^hee)、2.5mM MgCl2、300uM dNTP、2U的Taq酶和400ng的模板DNA，PHS1基因上下游引物分別為lOpmol， VP1-B1基因上下游引物分別為12pmol，PM19-Al基因上下游引物分別為2pmol。
[0037] 第一次（多重)PCR擴增條件為:95°C預變性5min，95°C變性30S，62°C退火30S，72°C 延伸lmin，10個循環。94°C變性30S，56°C退火30S，72°C延伸lmin，30個循環，最后72°C延伸 10min〇
[003 引第二次PCR反應體系總體積為20ul，包括lXPCRBuffer(Mg2卞ree)、1.5mMMgCl2、 200uM dNTP、0.抓的化q酶和l(K)ng的模板DNA，上下游引物分別為5pmol。
[0039] 第二次PCR擴增條件為：95 °C預變性5min，94°C變性30S，55 °C退火30S，72°C延伸 30S，30個循環，最后72°C延伸lOmin。
[0040] 第一次(多重)PCR產物用3.5 %的瓊脂糖凝膠電泳0.5-化，第二次PCR產物用1.5 % 的瓊脂糖凝膠電泳0.化，EB染色后用凝膠成像系統觀察并拍照。每個等位基因材料均能擴 出唯一一條清晰的帶，結果見圖1、圖2。由圖1可知，第一次（多重)PCR反應可W明確地鑒定 VPl-Bla(484bp)、P1-B化（677bp)、VP1-Bld(459bp)、VP1-Blf(614bp)，VP1-Blc(4(nbp)和 VPl-Ble(40化p)擴增片段相近，在第一個PCR反應檢測中不能很好區分。TaPHSl位點的強休 眠等位基因無擴增條帶，弱休眠等位基因產生1224bp擴增片段。PM19-A1位點的強、弱休眠 等位基因則分別產生19化P和177bp的擴增條帶;在第二次PCR反應中用一對引物對第一次 PCR反應中不能很好區分的材料進行檢測，第二次PCR反應可W明確地區分VPl-Blc(無擴增 產物)和VPl-Ble(237bp)，結果如圖2所示。
[0041] 進一步利用相應的引物對上述擴增片段直接測序，測序結果分別與GeneBank中對 應的VP1-B1、TaP服巧日PM19-A1等位基因序列進行比對分析，證明每個等位基因的特異性擴 增片段與預期結果吻合。所W，綜合兩次PCR的結果，能夠明確地鑒定Ξ個休眠主效位點的 全部等位基因類型。尤其是利用第一次（多重)PCR可W-次性鑒定Ξ個位點的強休眠等位 基因，可W作為抗穗發芽育種過程中強休眠等位的分子標記輔助選擇技術，加快優良抗性 基因在小麥遺傳背景中的快速聚合。
[0042] 實施例3:四川育成小麥品種主效休眠等位基因的鑒定
[0043] 利用本發明的分子標記，鑒定98份四川小麥育成品種在Ξ個主效休眠位點的等位 基因組成。DNA提取及分子標記PCR檢測方法同實施例1和實施例2。結果如圖3、圖4所示，圖3 表示利用第一次（多重)PCR對其中15份供試材料主效休眠基因的鑒定結果，對于泳道12~ 15檢測材料中不能分辨的VPl-Ble和VPl-Blc等位基因，繼續利用第二次PCR進行鑒別，結果 表明均為等位基因 VPl-Ble，如圖4所示。實驗數據表明，98份四川小麥育成品種在VP1-B1位 點存在5種等位基因類型。其中，64份材料含有￥口1-816，頻率為65.3%，21份材料含有￥口1- Blc，頻率為21.4%，12份材料含有VPl-Bla，頻率為12.2%，含有￥?1-8化和￥?1-81(1的材料 均只有1份，未檢測到強休眠等位基因 VPl-Blf。可見，四川小麥在VP1-B1位點的強休眠等位 基因頻率極低，在抗穗發芽育種中應加強VPl-Blb和VPl-Blf強休眠等位基因的利用。四川 小麥品種在化PHS1位點出現巧巾等位基因，即強休眠等位基因和弱休眠等位基因，頻率分別 為98 %和2 %。四川小麥品種在PM19-A1位點出現巧巾等位基因，即強休眠等位基因和弱休眠 等位基因，頻率分別為3%和97%。上述檢測結果表明，四川小麥抗穗發芽育種應加強對 VP1-B1和PM19-A1位點的種子強休眠基因的引進和利用，本發明建立的強休眠主效等位基 因特異性分子標記及檢測方法為小麥抗穗發芽分子育種提供了強有力技術手段。
【主權項】
1. 一種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的引物，其特征在于，所述小麥種子主校休眠 基因為Vpl-Bl基因、TaPHSl基因和PM19-A1基因；其中， 所述Vpl-Bl基因的分子標記引物包括2條正向引物和1條反向引物，正向引物1序列如 SEQ ID No. 1所示，正向引物2序列如SEQ ID No. 2所示，反向引物序列如SEQ ID No. 3所 示； 所述TaPHSl基因的分子標記引物包括1條正向引物和1條反向引物，正向引物序列如 SEQ ID No. 4所示，反向引物序列如SEQ ID No. 5所示； 所述PM19-A1基因的分子標記引物包括1條正向引物和1條反向引物，正向引物序列如 SEQ ID No. 6所示，反向引物序列如SEQ ID No. 7所示。2. 如權利要求1所述的引物在通量鑒定小麥種子主效休眠基因的應用。3. -種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的試劑盒，其特征在于，包含如權利要求1所述 的引物。4. 如權利要求3所述的一種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的試劑盒，其特征在于，它 還包括 BufTer、MgCl2、dNTP 和 Taq 酶。5. 如權利要求3或4所述的試劑盒在通量鑒定小麥種子主效休眠基因的應用。6. 如權利要求1所述的引物通量鑒定小麥種子主效休眠基因的方法，其特征在于，它包 括以下步驟：51. 使用Vpl-Bl基因的分子標記正向引物1和反向引物、TaPHSl基因的分子標記引物 和PM19-A1基因的分子標記引物形成的引物組合，對小麥DNA進行PCR擴增，并將擴增產物進 行瓊脂糖凝膠電泳并染色鑒定等位基因，其中，1224 bp擴增條帶鑒定為TaPHSl位點的弱休 眠等位基因，強休眠等位基因沒有擴增條帶;484 bp、677 bp、459 bp、614 bp的擴增條帶分 別鑒定為Vpl-Bl位點的等位基因 Vpl-Bla、Vpl-Blb、Vpl-Bld和Vpl-Blf，其中Vpl-Blb和 Vpl-Blf為強休眠等位基因，Vpl-Bla為弱休眠等位基因；195 bp和177bp的擴增條帶分別鑒 定為PM19-A1位點的強休眠等位基因和弱休眠等位基因；52. 使用Vpl-Bl基因的分子標記正向引物2和反向引物進行PCR擴增檢測，并將擴增產 物進行凝膠電泳并染色鑒定等位基因，其中，有擴增條帶的鑒定為等位基Vpl-Ble，沒有擴 增條帶的為等位基因 Vpl-Blc。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011301SQ201610632831
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月3日
【發明人】陳靜, 王威, 徐登安, 張紫晉
【申請人】中國科學院成都生物研究所