檢測小麥中頂芒山羊草2m、3m、6m和7m染色體的特異分子標記、試劑盒及方法
【專利摘要】本發明涉及分子生物學領域，特別涉及檢測小麥中頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的特異分子標記，分別如序列表中SEQ ID No.1和?18所示的DNA堿基序列。將待檢染色體樣品與特異分子標記組合物或者放入試劑盒中進行擴增。在檢測或輔助檢測小麥是否含有頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體。本發明對涉及頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的小麥?頂芒山羊草遠緣雜交新種質的篩選與鑒定提供了有效的檢測手段；對以染色體片段的方式向小麥轉移頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體上的優異基因提供了檢測方法，具有積極的產業化價值。
【專利說明】
檢測小麥中頂苦山羊草2M、3M、6M和7M染色體的特異分子標 巧、試劑盒及方法
技術領域
[0001] 本發明設及分子生物學領域，特別設及檢測小麥中頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色 體的特異分子標記，還設及含有此特異分子標記的試劑盒，及檢測小麥中頂芒山羊草2M、 3M、6M和7M染色體的方法。
【背景技術】
[0002] 頂芒山羊草(Aegilops comosa，化= 2x=14,基因組匪），高抗小麥條誘病、葉誘 病、桿誘病和白粉病等多種病害(Friebe B,Jiang JM,Raupp WJ,et al.Qiaracterization of wheat-alien translocations conferring resistance to diseases and pests: current status .Euphytica,1996,91:59-87;Gi11 BS,Sharma HC,Raupp WJ,et al.Evaluation of Aegilops species for resistance to wheat powdery mildew, wheat leaf rust,Hessian fly and greenbug.Plant Dis,1985,69:314-316)，是小麥育 種的優異基因源。自上個世紀60年代開始，英國的Riley課題組、Miller課題組和中國的董 玉琢課題組分別開展了頂芒山羊草與小麥的遠緣雜交工作，除此之外，未見其他的系統開 展小麥-頂芒山羊草遠緣雜交工作的研究。上述Ξ個課題組均將頂芒山羊草種質轉移給了 小麥，分別獲得了一批小麥-頂芒山羊草遠緣雜交種質資源。
[0003] 獲得小麥遠緣雜交種質資源之后，從分子、細胞和生物化學等水平上對其精確鑒 定是染色體工程育種非常重要的前期工作。在小麥中頂芒山羊草染色體鑒定方面，Friebe 等建立了頂芒山羊草染色體標準C分帶，然而不同來源的頂芒山羊草染色體帶紋還有差異 (Friebe等，Standard karyotypes of Aegilops uniaristata,Ae.mutica,Ae.comosa subspecies comosa and heldreichii(Poaceae) .Plant Systematics and Evolution, 1996，202:199-210}。化suda等和翁躍進等分別建立頂芒山羊草2M染色體、1M-7M染色體限 制性長度多態性（RFLP)標記{Nasuda等，Shuctural rearrangement in chromosome 2M of Aegilops comosa has prevented the utilization of the Compair and related wheat-Ae.comosa translocations in wheat improvement.Theor Appl Genet,1998,96: 780-785。翁躍進等，利用RFLP分子標記鑒定小麥-頂芒山羊草異代換系，遺傳學報，1997，24 (3) : 248-254。翁躍進等，小麥Μ染色體組的RFLP標記，農業生物技術學報，1997,5(3):211- 215) } sMolna / r等建立了頂芒山羊草染色體的流式細胞儀分煉方法{Molna^ r等 .Chromosome Isolation by flow sorting in Aegilops umbellulata and Ae.comosa and their allotetraploid hybrids Ae.biuncialis and Ae.geniculata.PLoS ONE, 2011，6(ll):e27708}。
[0004] 上述鑒定頂芒山羊草染色體的方法中，染色體C分帶操作程序費時費力，所用吉姆 薩染液質量、處理溫度與時間等不同容易造成結果重復性差;RFLP設及放射性元素使用且 耗時較長;流式細胞儀昂貴且操作步驟繁瑣；因而，建立檢測小麥中頂芒山羊草染色體的廣 譜和簡易實驗方法非常有必要。
[0005] 鑒于前述研究的不足，我們建立了頂芒山羊草染色體細胞遺傳學標記（國家發明 專利申請號：201610301879.2,實審中），該方法可W從細胞遺傳學水平上對小麥中頂芒山 羊草染色體進行有效鑒定。然而，分子生物學水平的鑒定方法還非常缺乏。

【發明內容】

[0006] 為了解決目前現有技術中沒有頂芒山羊草染色體PC財示記的問題，本發明提供了 一種能夠快捷、有效、簡便地鑒定待測樣本中是否含有頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的 特異分子標記。
[0007] 本申請還提供了含有上述特異分子標記的試劑盒。
[000引本發明的另一個目的是提供一種小麥中頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的分子 檢測方法，將建立的分子標記應用于小麥-頂芒山羊草雜交后代的篩選與鑒定工作。
[0009] 本發明是通過W下步驟得到的：
[0010] 我們的前期實驗發現，頂芒山羊草2M和7M染色體上分別含有抗小麥條誘病和白粉 病新基因，3M和6M染色體導入小麥后在特定生態環境下可分別顯著提高小麥分葉力和千粒 重，因此，本發明從分子水平上建立了可W有效識別小麥中頂芒山羊草(2M、3M、6M和7M)染 色體的鑒定方法，對設及頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的小麥-頂芒山羊草雜交后代的 鑒定結果顯示，本研究建立的分子檢測方法可W廣泛應用于設及頂芒山羊草2M、3M、6M和7M 染色體的小麥-頂芒山羊草育種新種質的篩選與鑒定工作。
[0011] (1)W頂芒山羊草、中國春-頂芒山羊草雙二倍體、中國春、小麥品種濟麥22和濟南 17為材料，設計并篩選染色體第二、Ξ、六和屯同源群化UG引物。從中篩選能在頂芒山羊草 和中國春-頂芒山羊草雙二倍體中擴增出額外多態性條帶的引物(相比中國春、小麥品種濟 麥22和濟南17)。
[0012] (2)用上述篩選出的引物，擴增中國春-頂芒山羊草雙二倍體、中國春、中國春-卵 穗山羊草IMS附加系、中國春-頂芒山羊草2M附加系、中國春-頂芒山羊草3M附加系、中國春- 頂芒山羊草4M附加系、中國春-頂芒山羊草5M附加系、中國春-頂芒山羊草6M附加系、中國 春-頂芒山羊草6M(6A)代換系和中國春-頂芒山羊草7M附加系，將上述所獲來自頂芒山羊草 的額外多態性條帶（相比中國春、小麥品種濟麥22和濟南17)定位在1M-7M某條或某幾條染 色體上。
[0013] (3)用上述篩選出的引物，對相應附加系/小麥雜交后代進行擴增，驗證多態性標 記的應用可行性。
[0014] 檢測小麥中頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的特異分子標記，為頂芒山羊草2M、 3M、6M和7M染色體的特異分子標記組成的特異分子標記組合物，其中頂芒山羊草2M染色體 的特異分子標記為CD913720-PLUG或CK171581-PLUG;頂芒山羊草3M染色體的特異分子標記 為CD491237-PLUG或CK207576-PLUG;頂芒山羊草6M染色體的特異分子標記為CK168221- 化UG或CK206466-PLUG;頂芒山羊草7M染色體的特異分子標記為CK214770-PLUG或 CK203272-PLUG；
[0015] 所述標記〔0913720斗1^6對應引物由序列表中沈9 10齡.1和沈9 10齡.2所示的 兩條單鏈DNA組成；
[0016] 所述標記〇(171581斗1^6對應引物由序列表中沈9 10齡.3和沈9 10齡.4所示的 兩條單鏈DM組成；
[0017] 所述標記〔0491237斗1^6對應引物由序列表中沈9 10齡.5和沈9 10齡.6所示的 兩條單鏈DNA組成；
[0018] 所述標記0(207576斗1^6對應引物由序列表中沈9 10齡.7和沈9 10齡.8所示的 兩條單鏈DNA組成；
[0019] 所述標記〇(168221斗〇]6對應引物由序列表中569 10齡.9和沈9 10齡.10所示 的兩條單鏈DNA組成；
[0020] 所述標記0(206466斗1^6對應引物由序列表中569 10齡.11和沈9 10齡.12所示 的兩條單鏈DNA組成；
[0021] 所述標記0(214770斗1^6對應引物由序列表中569 10齡.13和沈9 10齡.14所示 的兩條單鏈DNA組成；
[0022] 所述標記0(203272斗1^6對應引物由序列表中569 10齡.15和沈9 10齡.16所示 的兩條單鏈DNA組成。
[0023] 檢測小麥中頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的試劑盒，含有上述頂芒山羊草2M、 3M、6M和7M染色體的特異分子標記組成的特異分子標記組合物。
[0024] 檢測小麥中頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的方法，將待檢染色體樣品與特異分 子標記組合物或者放入試劑盒中進行擴增，擴增產物使用電泳檢測。
[0025] 若擴增產物中含有90化P或66化P多態性條帶，則待檢染色體樣品中含有頂芒山羊 草2M染色體；
[00%]若擴增產物中含有780bp或1700bp多態性條帶，則待檢染色體樣品中含有頂芒山 羊草3M染色體；
[0027] 若擴增產物中含有71化P或65化P多態性條帶，則待檢染色體樣品中含有頂芒山羊 草6M染色體；
[0028] 若擴增產物中含有1200bp或770bp多態性條帶，則待檢染色體樣品中含有頂芒山 羊草7M染色體。
[00巧]優選擴增反應體系為15化，包括25ng/化的樣品DNA lyL，5U/yL Taq DNA polymerase 0.15^，200μΜ的dNTPs，含Mgh的lOXPCR buffer 1.扣L，10yM的上、下游引物 各化L，用無菌雙蒸饋水補充反應體系至15化。
[0030] 優選2M、3M、6M和7M染色體的特異分子標記的比例為1:1:1:1。
[0031] 優選擴增程序為:94°C預變性3min，隨后35個循環:94°C變性45S，57 °C退火45S，72 。(:延伸2min，最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0032] 所述的特異分子標記或者所述的試劑盒在小麥育種中的應用。
[0033] 所述的特異分子標記或者所述的試劑盒在檢測或輔助檢測小麥是否含有頂芒山 羊草2M、3M、6M和7M染色體中的應用。
[0034] 本發明的有益效果：
[0035] (1)本發明建立了頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體標記，提供了檢測小麥背景中 頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的新方法；
[0036] (2)本發明建立的染色體特異分子標記，對設及頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體 的小麥-頂芒山羊草遠緣雜交新種質的篩選與鑒定提供了有效的檢測手段；
[0037] (3)本發明建立的染色體特異分子標記，對W染色體片段的方式向小麥轉移頂芒 山羊草2M、3M、6M和7M染色體上的優異基因（如小麥條誘病和白粉病抗病基因等）提供了檢 測方法，具有積極的產業化價值。
【附圖說明】
[0038] 圖 1.引物CD913720(A)、CK171581(B)、CD491237(C)、CK207576(D)、CK16822UE)、 CK206466(F)、CK214770(G)和CK203272化）的擴增結果；
[0039] 注:Μ為Marker,分子量大小依次為 200069、100069、75化9、50化9、25069和10化口， A-H中泳道1-5分別代表頂芒山羊草、中國春-頂芒山羊草雙二倍體、中國春、小麥品種濟麥 22和濟南17;
[0040] 圖2.引物CD913720(A)、CK171581(B)、CD491237(C)、CK207576(D)、CK16822UE)、 CK206466(F)、CK214770(G)和CK203272化）的擴增結果；
[0041 ]注:Μ為Marker,分子量大小依次為 200069、100069、75化9、50化9、25069和10化口， A-H中泳道1-10分別代表中國春-頂芒山羊草雙二倍體、中國春、中國春-卵穗山羊草IMS附 加系、中國春-頂芒山羊草2M附加系、中國春-頂芒山羊草3M附加系、中國春-頂芒山羊草4M 附加系、中國春-頂芒山羊草5M附加系、中國春-頂芒山羊草6M附加系、中國春-頂芒山羊草 6M( 6A)代換系和中國春-頂芒山羊草7M附加系；
[0042] 圖3.引物CD913720(A)、CK171581(B)、CD491237(C)、CK207576(D)、CK16822UE)、 CK206466(F)、CK214770(G)和CK203272化）的擴增結果；
[0043] 注:Μ為 Marker，分子量大小依次為 2000bp、lOOObp、750bp、500bp、250bp 和 lOObp，A 中泳道1-24分別代表頂芒山羊草、中國春-頂芒山羊草2M附加系、中國春、中國春-頂芒山羊 草2M附加系/中國春雜交后代P1-P21;B中泳道1-24分別代表頂芒山羊草、中國春-頂芒山羊 草2M附加系、中國春、中國春-頂芒山羊草3M附加系/中國春雜交后代P22-P42;C中泳道1-24 分別代表頂芒山羊草、中國春-頂芒山羊草3M附加系、中國春、中國春-頂芒山羊草3M附加 系/中國春雜交后代q1-q21;D中泳道1-24分別代表頂芒山羊草、中國春-頂芒山羊草3M附加 系、中國春、中國春-頂芒山羊草2M附加系/中國春雜交后代Q22-Q42;E中泳道1-24分別代表 頂芒山羊草、中國春-頂芒山羊草6M附加系、中國春、中國春-頂芒山羊草6M附加系/中國春 雜交后代R1-R21;F中泳道1-24分別代表頂芒山羊草、中國春-頂芒山羊草6M附加系、中國 春、中國春-頂芒山羊草6M附加系/中國春雜交后代R22-R42;G中泳道1-24分別代表頂芒山 羊草、中國春-頂芒山羊草7M附加系、中國春、中國春-頂芒山羊草7M附加系/中國春雜交后 代S1-S21;H中泳道1-24分別代表頂芒山羊草、中國春-頂芒山羊草7M附加系、中國春、中國 春-頂芒山羊草7M附加系/中國春雜交后代S22-S42。
【具體實施方式】
[0044] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明：
[0045] 實驗材料
[0046] 所用化UG引物根據小麥EST定位工程網化ttp : //wheat. pw . usda . gov/NSF/ data.html)提交的EST序列設計，引物合成由成都瑞信生物公司完成。
[0047] 頂芒山羊草(TA1967)和中國春-卵穗山羊草IMS附加系（TA7655)由美國堪薩斯州 立大學小麥基因組學與遺傳資源中屯、Raupp 1博±提供，公眾可從美國堪薩斯州立大學小 麥遺傳與基因組資源中屯、化ttp://www. k-state. edu/wgrc/)有償獲得，該生物材料只為重 復本發明的相關實驗所用，不作其它用途使用。小麥中國春(CS)由電子科技大學生命科學 與技術學院李光蓉教授提供。小麥品種濟南17和濟麥22由專利
【申請人】所在小麥遺傳育種團 隊自主育成。中國春、濟南17和濟麥22的種子，公眾可從山東省農業科學院作物研究所獲 得，該生物材料只為重復本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。中國春-頂芒山 羊草雙二倍體(XX039)為中國春與頂芒山羊草雜交，雜種Fi經加倍獲得，公眾可從山東省農 業科學院作物研究所獲得，該生物材料只為重復本發明的相關實驗所用，不可作為其它用 途使用。中國春-頂芒山羊草2M附加系、中國春-頂芒山羊草3M附加系、中國春-頂芒山羊草 4M附加系、中國春-頂芒山羊草5M附加系、中國春-頂芒山羊草6M附加系、中國春-頂芒山羊 草6M(6A)代換系和中國春-頂芒山羊草7M附加系由英國約翰英納斯中屯、的Reader SM教授 提供，公眾可從英國約翰英納斯中屯、化ttps: //www. jiC. ac. uk/germplasm/)無償獲得，該 生物材料只為重復本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。P1-P41是中國春-頂芒 山羊草2M附加系/中國春雜交F2后代材料;Q1-Q41是中國春-頂芒山羊草3M附加系/中國春 雜交F2后代材料;R1-R41是中國春-頂芒山羊草6M附加系/中國春雜交F2后代材料;S1-S41是 中國春-頂芒山羊草7M附加系/中國春雜交F2后代材料。
[004引實驗方法
[00例化UG引物擴增反應體系為15化，包括25ngAiL的模板DNA lyL，5UAiL Taq DNA polymerase(申能博彩公司）0.1 化L，200yM的dNTPs(博奧公司），含Mg2+的lOXPCR buffer 1.化L(申能博彩公司），10μΜ的上、下游引物各化L，用無菌雙蒸饋水補充反應體系至15化。 [0化0] PCR反應在BI0-RAD PCR擴增儀上進行，擴增程序為:94°C預變性3min，隨后35個循 環:94°C變性45S，57°C退火45S，72°C延伸2min，最后72°C延伸10min，4°C保存。擴增產物進 行2%的瓊脂凝膠上電泳，電泳緩沖液為1 X TAE。擴增產物lOul在150V恒壓下電泳約25min， 然后用lug/血的漠化乙錠溶液進行染色30min，最后在GDS-Gel Dol 2000紫外凝膠成像系 統下掃描照像。
[0化1]實施例1
[0052] W頂芒山羊草、中國春-頂芒山羊草雙二倍體、中國春、小麥品種濟麥22和濟南17 為材料，設計和篩選染色體第二、Ξ、六和屯同源群化UG引物41對、84對、53對和73對，擴增 產物分別用限制性內切酶化ell I和TaqI進行酶切，將來自同一引物的PCR擴增產物(未酶 切、化elll酶切和化ql酶切Ξ種情況)進行瓊脂糖凝膠電泳，結果發現染色體第二同源群的 CD913720(圖 1A)和 CK171581(圖 1B)、染色體第 Ξ 同源群的 CD491237(圖 1C)和 CK207576(圖 1D)、染色體第六同源群的CK16822U圖1E)和CK206466(圖1F)、染色體第屯同源群的 CK214770(圖1G)和CK203272(圖1H)能在頂芒山羊草和中國春-頂芒山羊草雙二倍體中擴增 出額外多態性條帶，運些多態性條帶大小分別為900bp、660bp、780bp、1700bp、710bp、 650bp、1200bp和770bp(圖1A-H中箭頭所示），但是，小麥對照中國春、濟麥22和濟南17均擴 增不出運些條帶，說明運些多態性條帶來自頂芒山羊草。上述8對引物的序列、所在小麥染 色體位置和多態性標記長度等信息見表1。
[0053] 表1.頂芒山羊草染色體特異分子標記信息
[0化4]
[0化5] 實施例2
[0056] 截至目前，由于未見有中國春-頂芒山羊草1M附加系被創制的報道，而頂芒山羊草 Μ染色體是卵穗山羊草的Mg染色體的供體，在物種多倍體化和進化過程中可能發生了染色 體部分重組或變異，導致卵穗山羊草中來自于頂芒山羊草的染色體與頂芒山羊草Μ染色體 稍有不同，因此，用Mg表示W示區別。因此，在沒有中國春-頂芒山羊草1Μ附加系的情況下， 可W用中國春-卵穗山羊草IMS附加系做標記定位。
[0057] 為了將上述來自頂芒山羊草的多態性條帶定位在頂芒山羊草1M-7M中的某條或某 幾條染色體上，用上述篩選出的8對PLUG引物對中國春-頂芒山羊草雙二倍體、中國春、中國 春-卵穗山羊草IMS附加系、中國春-頂芒山羊草2M附加系、中國春-頂芒山羊草3M附加系、中 國春-頂芒山羊草4M附加系、中國春-頂芒山羊草5M附加系、中國春-頂芒山羊草6M附加系、 中國春-頂芒山羊草6M(6A)代換系和中國春-頂芒山羊草7M附加系進行擴增，分別獲得如下 結果：
[0化引引物CD913720和CK171581可W在中國春-頂芒山羊草雙二倍體和中國春-頂芒山 羊草2M附加系中分別擴增出分子量約為90化P (圖2A)和66化P (圖2B)的特異多態性條帶，但 是，中國春和另外6個附加系（lMg、3M-7M)未擴增出相應條帶，說明運兩條多態性條帶是頂 芒山羊草2M染色體特異分子標記，記為CD913720-PLUG和CK171581-PLUG(表1)。
[0化9] 引物CD491237和CK207576可W在中國春-頂芒山羊草雙二倍體和中國春-頂芒山 羊草3M附加系中分別擴增出分子量約為780bp(圖2C)和1700bp(圖2D)的特異多態性條帶， 但是，中國春和另外6個附加系（lMg、2M、4M-7M)未擴增出相應條帶，說明運兩條多態性條帶 是頂芒山羊草3M染色體特異分子標記，記為CD491237-PLUG和CK207576-PLUG(表1)。
[0060] 引物CK168221和CK206466可W在中國春-頂芒山羊草雙二倍體和中國春-頂芒山 羊草6M附加系中分別擴增出分子量約為71化P (圖沈)和65化P (圖2F)的特異多態性條帶，但 是，中國春和另夕F6個附加系（lMg、3M-5M和7M巧擴增出相應條帶，說明運兩條多態性條帶 是頂芒山羊草6M染色體特異分子標記，記為CK168221-PLUG和CK206466-PLUG(表1)。
[0061 ] 引物CK214770和CK203272可W在中國春-頂芒山羊草雙二倍體和中國春-頂芒山 羊草7M附加系中分別擴增出分子量約為1200bp(圖2G)和770bp(圖2H)的特異多態性條帶， 但是，中國春和另外6個附加系（lMg、3M-6M)未擴增出相應條帶，說明運兩條多態性條帶是 頂芒山羊草7M染色體特異分子標記，記為CK214770-PLUG和CK203272-PLUG(表1)。
[0062] 實施例3
[0063] 為了驗證上述8個標記的實用性，用上述篩選出的8對引物分別對4個群體進行了 擴增，驗證標記的實用性。
[0064] 其中，用染色體第二同源群的CD913720和CK171581對中國春-頂芒山羊草2M附加 系/中國春雜交F2后代材料P1-P42進行了擴增，結果顯示，CD913720和CK171581均能在小 麥-頂芒山羊草雙二倍體、小麥-頂芒山羊草2M附加系、P2-P6、P16-P20、P25、P26、P28、P31、 ?32、口36、口39、口40和口42擴增出多態性標記〔0913720斗016和0(171581斗1^6，而在中國春和 ?1、口7斗15、口21斗24、口27、口29、口30、口33斗35、口37、口38和口41中沒有擴增出相應多態性條帶 (表2)。其中，CD913720對P1-P21的擴增結果如圖3A所示，CK171581對P22-P42的擴增結果如 圖3B所示。
[0065] 用染色體第Ξ同源群的CD491237和CK207576對中國春-頂芒山羊草3M附加系/中 國春雜交F2后代材料Q1-Q41進行了擴增，結果顯示，CD491237和CK207576均能在小麥-頂芒 山羊草雙二倍體、小麥-頂芒山羊草3M附加系、91、94-96、911、912、914、915、920、921、923- 927、931、933、934和938-40擴增出多態性標記〔0491237斗〇16和〇(207576斗〇]6，而在中國 春和 92、93、97-910、913、916-919、922、928-30、932、935-37、9"和942中沒有擴增出相應多 態性條帶(表3)。其中，CD491237對Q1-Q21的擴增結果如圖3C所示，CK207576對Q22-Q42的擴 增結果如圖3D所示。
[0066] 用染色體第六同源群的CK168221和CK206466對中國春-頂芒山羊草6M附加系/中 國春雜交F2后代材料R1-R41進行了擴增，結果顯示，CK168221和CK206466均能在小麥-頂芒 山羊草雙二倍體、小麥-頂芒山羊草6M附加系、則、1?2、1?5、1?6、1?8、1?13、1?14、1?19、1?20、1?27- 1?29、1?1、1?5-1?37和1?41擴增出多態性標記〇(168221斗〇]6和〇(206466斗1^6，而在中國春和 1?、1?4、1?7、1?9-1?12、1?15-1?18、1?21-1?26、1?30、1?32-1?34、1?38-1?40和1?42中沒有擴增出相應多態 性條帶（表4)。其中，CK168221對R1-R21的擴增結果如圖3E所示，CK206466對R22-R42的擴增 結果如圖3F所示。
[0067] 用染色體第屯同源群的CK214770和CK203272對中國春-頂芒山羊草7M附加系/中 國春雜交F2后代材料S1-S41進行了擴增，結果顯示，CK214770和CK203272均能在小麥-頂芒 山羊草雙二倍體、小麥-頂芒山羊草7M附加系、S1-S3、S8、S10-S15、S18、S19、S22、S23、S25、 S28、S30和S37-S40擴增出多態性標記CK214770-PLUG和CK203272-PLUG，而在中國春和54- 87、59、516、517、520、521、524、526、527、529、531-536、541和542中沒有擴增出相應多態性 條帶（表5)。其中，CK214770對S1-S21的擴增結果如圖3G所示，CK203272對S22-S42的擴增結 果如圖3印巧不。
[0068] W上引物均可W在相應雜交后代材料中擴增出相應分子標記，說明本發明建立的 染色體特異分子標記可W對小麥-頂芒山羊草設及2M、3M、6M和7M染色體的雜交后代進行有 效篩選與初步鑒定，因此，在種質資源篩選與小麥育種中具有實用價值。
[0069] 表2.頂芒山羊草2M染色體特異分子標記CD913720-PLUG、CK171581-PLUG對雜交后 代群體的分子檢測情況
[0070]
[0072] 表3.頂芒山羊草3M染色體特異分子標記CD491237-PLUG、CK207576-PLUG對雜交后 代群體的分子檢測情況
[0071]
[0073]
[00巧]表4.頂芒山羊草6M染色體特異分子標記CK168221-PLUG、CK206466-PLUG對雜交后 代群體的分子檢測情況
[0074]
[0076]
[0077]
[0078] 表5.頂芒山羊草7M染色體特異分子標記CK214770-PLUG、CK203272-PLUG對雜交后 代群體的分子檢測情況
[0079]
[0080] 上述實施例1、2、3中針對頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的特異分子標記分別進 行了試驗，證實特異分子標記可W用于對頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體進行鑒別。而本 發明的目的，是提供一種頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的特異分子標記的組合物，運種 組合物可W對待檢樣品中的頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體同時進行檢測，并且從上述實 施例1、2、3記載的內容可W看出，檢測結果之間不會相互干擾，檢測快速、方便、準確，對育 種工作具有非常實用的推廣價值。為了使擴增過程、結果更加容易判斷，頂芒山羊草2M、3M、 6M和7M染色體的特異分子標記的摩爾比為1:1:1:1。
[0081]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受實施例的限 審IJ，其它任何未背離本發明的精神實質與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應為 等效替換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 檢測小麥中頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的特異分子標記，為頂芒山羊草2M、3M、 6M和7M染色體的特異分子標記組成的特異分子標記組合物，其特征在于頂芒山羊草2M染色 體的特異分子標記為CD913720-PLUG或CK171581-PLUG;頂芒山羊草3M染色體的特異分子標 記為CD491237-PLUG或CK207576-PLUG;頂芒山羊草6M染色體的特異分子標記為CK168221-PLUG或CK206466-PLUG;頂芒山羊草7M染色體的特異分子標記為CK214770-PLUG或 CK203272-PLUG； 所述標記CD913720-PLUG對應引物由序列表中SEQIDNo.l和SEQIDNo.2所示的兩條 單鏈DNA組成； 所述標記CK171581-PLUG對應引物由序列表中SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的兩條 單鏈DNA組成； 所述標記CD491237-PLUG對應引物由序列表中SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的兩條 單鏈DNA組成； 所述標記CK207576-PLUG對應引物由序列表中SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示的兩條 單鏈DNA組成； 所述標記CK168221-PLUG對應引物由序列表中SEQIDNo.9和SEQIDNo.lO所示的兩 條單鏈DNA組成； 所述標記CK206466-PLUG對應引物由序列表中SEQIDNo.ll和SEQIDNo.l2所示的兩 條單鏈DNA組成； 所述標記CK214770-PLUG對應引物由序列表中SEQIDNo.l3和SEQIDNo.l4所示的兩 條單鏈DNA組成； 所述標記CK203272-PLUG對應引物由序列表中SEQIDNo.l5和SEQIDNo.l6所示的兩 條單鏈DNA組成。2. 檢測小麥中頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的試劑盒，其特征在于含有上述權利要 求1中的頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的特異分子標記組成的特異分子標記組合物。3. 檢測小麥中頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體的方法，其特征在于將待檢染色體樣品 與權利要求1中的特異分子標記組合物或者放入權利要求2中的試劑盒中進行擴增，擴增產 物使用電泳檢測。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于 若擴增產物中含有900bp或660bp多態性條帶，則待檢染色體樣品中含有頂芒山羊草2M 染色體； 若擴增產物中含有780bp或1700bp多態性條帶，則待檢染色體樣品中含有頂芒山羊草 3M染色體； 若擴增產物中含有710bp或650bp多態性條帶，則待檢染色體樣品中含有頂芒山羊草6M 染色體； 若擴增產物中含有12〇〇bp或770bp多態性條帶，則待檢染色體樣品中含有頂芒山羊草 7M染色體。5. 根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于 擴增反應體系為 15 yL，包括25 ng/yL的樣品DNA lyL，5 U/yL fag DNA polymerase 0.15yL，200 μΜ的dNTPs，含Mg2+的 10X PCR buffer 1.5 yL，10 μΜ的上、下游引物各 1 yL， 用無菌雙蒸餾水補充反應體系至15yL。6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于2M、3M、6M和7M染色體的特異分子標記的摩 爾比為7. 根據權利要求3-5中任一項所述的方法，其特征在于：擴增程序為：94 °C預變性3 min，隨后35個循環：94 °C變性45 S，57 °C退火45 S，72 °C延伸2 min，最后72 °C延伸10 min，4 °C保存。8. -種權利要求1所述的特異分子標記或者權利要求2所述的試劑盒在小麥育種中的 應用。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于權利要求1所述的特異分子標記或者權利要 求2所述的試劑盒在檢測或輔助檢測小麥是否含有頂芒山羊草2M、3M、6M和7M染色體中的應 用。
【文檔編號】C12N15/11GK106011299SQ201610629389
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月2日
【發明人】劉成, 宮文萍, 韓冉, 劉建軍, 李豪圣, 宋健民, 劉愛峰, 曹新有, 程敦公, 李根英, 楚秀生, 黃承彥, 趙振東
【申請人】山東省農業科學院作物研究所