一種調控皮狀絲孢酵母b3發酵形態的方法
【專利摘要】本發明提供了一種調控皮狀絲孢酵母B3發酵形態的方法，屬于生物工程領域，所涉及的菌株保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO.M 2010076，已在專利ZL201010210264.1中公開。本發明針對所述菌株的特點確定影響其細胞形態轉換的關鍵因子為氮源濃度及培養基pH。將酵母型或菌絲型的細胞接種到發酵培養基中，通過控制氮源濃度及培養基pH，可穩定調控其發酵形態。堿性環境，低氮源濃度；呈菌絲型生長的發酵工藝是：酸性環境，高氮源濃度。本發明的優點在于可使發酵過程中細胞形態均一，為皮狀絲孢酵母B3形態代謝工程研究提供理論依據。本發明設計的促使菌體呈酵母型生長的發酵方法工藝簡單，能為皮狀絲孢酵母B3高密度發酵產微生物油脂降低生產成本。
【專利說明】
一種調控皮狀絲孢酵母B3發酵形態的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及微生物發酵形態調控，屬于生物工程領域。更具體地，即一株產微生物 油脂菌株一一皮狀絲孢酵母B3的發酵形態調控方法。
【背景技術】
[0002] 菌體發酵形態調控作為微生物發酵調控的重要內容，對于提高真菌在工業發酵中 的生產水平具有重要作用，受到高度重視。以菌絲型生長的真菌會形成分散菌絲體 (Dispersed mycelium)、球狀菌絲體(Pellet)和團族狀菌絲體(Clump or Flock)等三種集 結形態，不管哪種形態，都會對發酵液的流體學性質、營養物質攝取和氧氣傳遞帶來影響。 隨著細胞菌絲的增多，真菌細胞間更容易發生結團現象，從而使發酵液的粘度不斷增加，進 一步阻礙細胞對營養物質的攝取和氧氣的傳遞，最終影響菌體的生長和產物的生成。為此， 研究人員根據真菌生長的特性，通過優化培養基的成分以及組成來控制絲狀真菌形態。如 Christiansen等研究了不同葡萄糖糖濃度下黑曲霉(Aspergillus niger)菌絲體的生長情 況，發現在不同糖濃度下，菌絲體的分支情況會有所區別。Liao等則全面考察了接種孢子濃 度，葡萄糖、尿素、磷酸鹽、金屬離子的濃度，發酵體系pH以及微粒子添加對米根霉 (Rhizopus oryzae)生長形態的影響及其變化規律。
[0003] 近年來，隨著化石燃料的益枯竭和人們環保意識的增強，利用生物技術開發和生 產可持續、綠色環保的生物燃料正成為替代能源研究的一個重要方向，利用微生物生產油 脂也是近年來的研究重點之一。皮狀絲孢酵母具有油脂含量高，生長速度快、可利用木質纖 維素等優點，在利用廉價的工農業廢棄原料進行發酵生產方面具有優勢，越來越受到人們 的重視。迄今，皮狀絲孢酵母已成為一個重要的微生物油脂生產候選菌種。皮狀絲孢酵母歸 類為二型態真菌，可呈酵母型和菌絲型兩種形態，但正常情況下，其在發酵過程中是以絲狀 生長為主。隨著細胞密度的上升，菌絲會發生結團，造成發酵液的流體學性質發生改變(粘 度上升），大大影響了營養物質和氧氣的傳遞，從而進一步對菌體的生長起到阻礙作用，無 法進行高密度培養，使得最終油脂產量不高。外界環境條件是影響二型態真菌形態轉換的 重要因素之一，例如碳氮源、溫度、溶氧和pH值等。但有關調控皮狀絲孢酵母發酵形態的具 體環境因素及工藝卻未有報道。本發明所述的皮狀絲孢酵母B3發酵形態的調控工藝，可穩 定控制其發酵形態，對研究皮狀絲孢酵形態代謝具有重要的意義，為其高密度發酵產微生 物油脂奠定基礎。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種調控皮狀絲孢酵母B3發酵形態的方法，為皮狀絲孢酵母 B3形態代謝研究和高密度發酵產微生物油脂奠定基礎。
[0005] 本發明提供了皮狀絲孢酵母B3發酵形態的調控方法，所述皮狀絲孢酵母B3保藏于 中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO.Μ 2010076;
[0006] 本發明所述的調控皮狀絲孢酵母Β3發酵形態的方法，具體步驟如下：
[0007] 1.皮狀絲孢酵母B3所使用的培養基：
[0008] (1)固體培養基
[0009] 葡萄糖:20g/L;酵母提取物：1 Og/L;瓊脂:20g/L; pH自然。
[0010] ⑵種子培養基
[0011] 葡萄糖：40g/L;酵母提取物：3.0g/L;KH2P04:0.75g/L;CaC12 · 2H20:0.4g/L; MgS04 · 7H20：0.4g/L；pH=6.0〇
[0012] ⑶發酵培養基
[0013] 葡萄糖：40g/L;KH2P04:0.75g/L;CaC12 · 2H2〇:0.4g/L;MgS04 · 7H2〇:0.4g/L;以 酵母提取物、蛋白胨、硫酸銨、尿素作為氮源，用檸磷酸氫二鈉-檸檬酸或甘氨酸-氫氧化鈉 緩沖液進行調配初始pH值。
[0014] 2.皮狀絲孢酵母B3呈酵母型的發酵方法：
[0015] (1)將保存在固體培養基上的產微生物油脂皮狀絲孢酵母B3的菌種接入種子培養 基中培養48-60h，以5%-10%的接種量接入發酵培養基;搖瓶培養的溫度為25-30°C，搖床 轉速為180_200r/min，pH保持在7.0-9.0，氮源濃度保持在0-1. Og/L以下或者0.1~1. Og/L;
[0016] (2)將步驟（1)中培養48h的菌體放置顯微鏡下觀察并拍照，所得照片運用圖像定 量分析(QIA)軟件進行分析，計算酵母細胞所占的百分率：[酵母型細胞數/(酵母型細胞數+ 菌絲型細胞數）]X 100%，即：[Y/(Y+M) ] X 100%。
[0017] 3.皮狀絲孢酵母B3呈菌絲型的發酵方法：
[0018] (1)將保存在固體培養基上的產微生物油脂皮狀絲孢酵母B3的菌種接入種子培養 基中培養48-60h，以體積分數5 %-10 %的接種量接入發酵培養基;搖瓶培養的溫度為25-30 °C，搖床轉速為180-200r/min，pH保持在4.0-6.0，氮源濃度保持在5.0-10.Og/L。
[0019] ⑵將步驟⑴中培養48h的菌體放置顯微鏡下觀察并拍照，所得照片運用圖像定 量分析(QIA)軟件進行分析，計算菌絲型細胞所占的百分率：[菌絲型細胞數/(酵母型細胞 數+菌絲型細胞數）]X 100%，g卩：[M/(Y+M) ] X 100%。
[0020] 有益效果:本發明的調控皮狀絲孢酵母B3發酵形態的方法確立了影響皮狀絲孢酵 母B3形態的關鍵因素:氮源濃度和培養基的pH。采用本發明所述的方法可穩定控制皮狀絲 孢酵母B3發酵過程中的細胞形態，這對皮狀絲孢酵母的形態代謝工程研究具有重要意義。
[0021] 另外，采用本發明所設計的促使細胞呈酵母型的發酵方法可使菌體在發酵過程中 始終呈酵母型，避免了因菌絲結團造成的發酵液粘度上升，這為皮狀絲孢酵母B3高密度發 酵產微生物油脂奠定基礎。
【附圖說明】
[0022] 圖1是pH為7.0時，不同氮源低濃度條件下細胞的形態；
[0023] 圖2是pH為8.0時，不同氮源低濃度條件下細胞的形態；
[0024] 圖3是pH為9.0時，不同氮源低濃度條件下細胞的形態；
[0025] 圖4是pH為4.0時，不同氮源高濃度條件下細胞的形態；
[0026] 圖5是pH為5.0時，不同氮源高濃度條件下細胞的形態；
[0027]圖6是pH為6.0時，不同氮源高濃度條件下細胞的形態。
【具體實施方式】：
[0028]以下結合實施例對本發明進行詳細說明。
[0029] 實施例1 pH為7.0時，不同氮源低濃度條件對皮狀絲孢酵母B3細胞形態的影響
[0030] (1)培養基
[0031] a.固體培養基
[0032]葡萄糖:20g/L;酵母提取物：1 Og/L;瓊脂:20g/L; pH自然。
[0033] b.種子培養基
[0034]葡萄糖：4(^/1^酵母提取物：38/1^1〇12?04 :0.758/1^03(：12.2!120:0.48/1^ MgS04 · 7H20：0.4g/L；pH=6.0〇
[0035] c.發酵培養基
[0036] 葡萄糖：40g/L;KH2P04:0.75g/L;CaC12 · 2H2〇:0.4g/L;MgS04 · 7H2〇:0.4g/L;以 酵母提取物、蛋白胨、硫酸銨、尿素作為氮源，濃度設置如下 ：18/1、0.58凡、0.4/1;初始?!1 7.0(通過檸磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進行調配）。
[0037] (2)培養方式
[0038]甘油管保藏的菌種轉接至固體平板培養基，28°C活化48h。種子培養使用250mL三 角瓶，裝液量50mL，培養溫度為28°C，搖床轉速200r/min。種子培養48h以5 %的接種量接入 發酵培養基，裝樣量50mL/250mL，培養溫度為28 °C，搖床轉速180r/min。培養48h后進行菌體 形態觀察。
[0039] (3)結果顯示
[0040] pH= 7.0，氮源濃度在1. Og/L以下時，皮狀絲孢酵母B3基本都呈酵母型，酵母型菌 體比例均在90%以上，結果見表1，圖1。
[0041 ]表1堿性環境，低氮源濃度條件下，酵母型細胞的比例
[0043] 實施例2 pH為8.0時，不同氮源低濃度條件對皮狀絲孢酵母B3細胞形態的影響
[0044] (1)培養基
[0045] a.固體培養基
[0046] 同實例1
[0047] b.種子培養基
[0048] 同實例1
[0049] c.發酵培養基
[0050] 培養基成分同實例1;初始pH 8.0(通過檸磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進行調配）
[0051 ] (2)培養方式
[0052] 同實例1
[0053] (3)結果顯示：
[0054] pH= 8.0，氮源濃度1. Og/L以下時，皮狀絲孢酵母B3基本呈酵母型，酵母型菌體比 例均在90%以上，結果見表1，圖2。
[0055] 實施例3 pH為9.0時，不同氮源低濃度條件對皮狀絲孢酵母B3細胞形態的影響
[0056] (1)培養基
[0057] a.固體培養基
[0058] 同實例1
[0059] b.種子培養基
[0060] 同實例1 [00611 c.發酵培養基
[0062]培養基成分同實例1;初始pH 9.0(通過甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液進行調配）
[0063] (2)培養方式
[0064] 同實例1 [0065] (3)結果顯示：
[0066] pH= 9.0，氮源濃度在1. Og/L以下時，皮狀絲孢酵母B3基本都呈酵母型，酵母型菌 體比例均在90%以上，結果見表1，圖3。
[0067]實施例4 pH為4.0時，不同氮源高濃度條件對皮狀絲孢酵母B3菌體形態的影響
[0068] (1)培養基
[0069] a.固體培養基
[0070] 同實例1
[0071] b.種子培養基 [0072]同實例1 [0073] c.發酵培養基
[0074]葡萄糖：40g/L;KH2P04:0.75g/L;CaC12 · 2H2〇:0.4g/L;MgS04 · 7H2〇:0.4g/L;以 酵母提取物、蛋白胨、硫酸銨、尿素作為氮源，濃度設置如下:5. Og/L、7. Og/L、10.0 g/L;初始 pH 4.0(通過檸磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進行調配）。
[0075] (2)培養方式
[0076] 同實例1 [0077] (3)結果顯示：
[0078] pH=4.0，氮源濃度在5.0-10.0 g/L時，皮狀絲孢酵母B3基本呈菌絲型，且由于培養 基環境酸性過強，菌體會產生少量厚垣孢子或形成假菌絲（歸為菌絲型），菌絲型菌體比例 可達90%以上，結果見表2,圖4。
[0079] 表2酸性環境，高氮源濃度條件下，菌絲型細胞的比例
[0081] 實施例5 pH為5.0時，不同氮源高濃度條件對皮狀絲孢酵母B3菌體形態的影響
[0082] (1)培養基
[0083] a.固體培養基
[0084] 同實例1
[0085] b.種子培養基
[0086] 同實例1 [0087] c.發酵培養基
[0088] 同實例4,初始pH 5.0(通過檸磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進行調配）。（2)培養方式
[0089] 同實例1
[0090] (3)結果顯示：
[0091] pH= 5.0，氮源濃度在5.0-10.0 g/L時，皮狀絲孢酵母B3基本呈細長菌絲型，菌絲型 菌體比例高達90%以上，結果見表2,圖5。
[0092]實施例6 pH為6.0時，不同氮源高濃度條件對皮狀絲孢酵母B3菌體形態的影響
[0093] (1)培養基
[0094] a.固體培養基
[0095] 同實例1
[0096] b.種子培養基
[0097] 同實例1
[0098] c.發酵培養基
[0099] 同實例4,初始pH 6.0(通過檸磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進行調配）。（2)培養方式
[0100] 同實例1
[0101] (3)結果顯示：
[0102] pH=6.0，氮源濃度在5.0-10.0 g/L時，皮狀絲孢酵母B3也基本呈菌絲型，菌絲型細 胞比例要比同等條件下pH為5.0時略低一點，但比例也在90%左右，結果見表2,圖6。
【主權項】
1. 一種調控皮狀絲孢酵母B3發酵形態的方法，皮狀絲孢酵母B3呈酵母型生長的發酵工 藝為堿性環境pH 7.0~9.0，低氮源濃度0~1. Og/L;皮狀絲孢酵母B3呈菌絲型生長的發酵 工藝為酸性環境pH 3.0~6.0，高氮源濃度5.0~10.0 g/L。2. 按照權利要求1所述的調控皮狀絲孢酵母B3發酵形態的方法，其特征在于:所述的氮 源為酵母提取物、蛋白胨、尿素或(NH4) 2S04中的一種。3. 按照權利要求1所述的調控皮狀絲孢酵母B3發酵形態的方法，其特征在于:通過檸磷 酸氫二鈉-檸檬酸或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液調節培養基的初始pH值。4. 按照權利要求1所述的調控皮狀絲孢酵母B3發酵形態的方法，其特征在于:將保存在 固體培養基上的皮狀絲孢酵母B3的菌種接入種子培養基中培養48-60h，以體積分數5%-iQ% 的接種量接入發酵培養基; 搖瓶培養的溫度為 25-30°C，搖床轉速為 180-200r/min，氮 源濃度保持在〇~1. 〇g/L，pH保持在7.0-9.0，細胞呈酵母型生長。5. 按照權利要求1所述的調控皮狀絲孢酵母B3發酵形態的方法，其特征在于:將保存在 固體培養基上的皮狀絲孢酵母B3的菌種接入種子培養基中培養48-60h，以體積分數5%-iQ% 的接種量接入發酵培養基; 搖瓶培養的溫度為 25-30°C，搖床轉速為 180-200r/min，氮 源濃度保持在5. Og/L~10.0 g/L，pH保持在3.0-6.0，細胞呈菌絲型生長。
【文檔編號】C12R1/645GK105969676SQ201610517308
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月4日
【發明人】張志斌, 顏日明, 祝麗彬, 朱篤, 汪涯, 楊慧林, 江玉梅
【申請人】江西師范大學