一種鑒定h5亞型aiv、n6亞型aiv和aiv的引物組合及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種鑒定H5亞型AIV、N6亞型AIV和AIV的引物組合及其應用。本發明的引物組合由引物對I、引物對II和引物對III組成。引物對I由引物M?F和M?R組成，分別如序列表1、2所示。引物對II由引物H5?F和H5?R組成，分別如序列表3、4所示。引物對III由引物N6?F和N6?R組成，分別如序列表5、6所示。本發明還保護所述引物組合在鑒別H5亞型AIV、N6亞型AIV和AIV中的應用。本研究構建的H5亞型AIV、N6亞型AIV和AIV的三重PCR檢測方法具有特異性強，靈敏度高，快速便捷的特點，為快速診斷H5N6亞型AIV提供有力技術支撐，為早期診斷和臨床檢測提供參考依據。
【專利說明】
_種鑒定H5亞型AIV、N6亞型AIV和AIV的引物組合及其應用
技術領域
[00011 本發明涉及一種鑒定H5亞型AIV、N6亞型AIV和AIV的引物組合及其應用。
【背景技術】
[0002] 禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)屬于正黏病毒科A型流感病毒屬，根據 血凝素(henmagglutinin，HA)和神經氨基酸(neuraminidase，NA)抗原性差異可分為不同亞 型，目前已發現有18種HA(H1-H18)亞型和11種NA(Nl-Nll)。
[0003] 1975年H5N6亞型病毒首次從美國綠頭鴨體內分離出來，據報道以往H5N6亞型病毒 主要以低致病狀態在禽類(主要是鴨類)流行，對養禽業并沒有明顯的影響。2013年，我國江 蘇省首次在活禽市場監測中發現H5N6禽流感病毒，對其進行基因分析后發現，H5N6禽流感 病毒竟由H5N1和H6N6兩種亞型禽流感病毒基因重組而來，并且多個基因來源于H5N1高致病 禽流感病毒，使其具備了高致病的特性。2014年，我國四川省南充市首次從人類中分離了高 致病性H5N6禽流感病毒。目前，已確診14例人類感染H5N6亞型AIV病例，提示AIV已經進一步 從禽類到人類轉變，H5N6亞型AIV不僅給養禽業帶來巨大的經濟損失，還可以跨越宿主屏障 直接感染人而危害人類安全。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種鑒定H5亞型AIV、N6亞型AIV和AIV的引物組合及其應用。 [0005] 本發明提供了一種引物組合，由引物對I、引物對II和引物對IΠ 組成；
[0006] 所述引物對I由引物M-F和引物M-R組成；
[0007] 所述引物M-F為如下(al)或(a2);
[0008] (al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；
[0009] (a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有 相同功能的DNA分子；
[0010] 所述引物M-R為如下(a3)或(a4);
[0011] (a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；
[0012] (a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有 相同功能的DNA分子；
[0013] 所述引物對11由引物H5-F和引物H5-R組成；
[0014] 所述引物H5-F為如下(a5)或(a6);
[0015] (a5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；
[0016] (a6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有 相同功能的DNA分子；
[0017] 所述引物H5-R為如下(a7)或(a8);
[0018] (a7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；
[0019] (a8)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有 相同功能的DNA分子；
[0020] 所述引物對ΙΠ 由引物N6-F和引物N6-R組成；
[0021] 所述引物N6-F為如下(a9)或(alO);
[0022] (a9)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子；
[0023] (alO)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有 相同功能的DNA分子；
[0024] 所述引物N6-R為如下(all)或(al2);
[0025] (all)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子；
[0026] (al2)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有 相同功能的DNA分子。
[0027] 所述引物組合的用途為如下(bl)至(b6)中的任意一種：
[0028] (bl)鑒別H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5亞型的AIV和非H5 亞型且非N6亞型的AIV;
[0029] (b2)制備用于鑒別H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5亞型的 AIV和非H5亞型且非N6亞型的AIV的試劑盒；
[0030] (b3)鑒定待測病毒是否為H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5 亞型的AIV或非H5亞型且非N6亞型的AIV;
[0031] (b4)制備用于鑒定待測病毒是否為H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞 型且非H5亞型的AIV或非H5亞型且非N6亞型的AIV的試劑盒；
[0032] (b5)檢測待測樣本中是否含有H5N6亞型AIV和/或H5亞型且非N6亞型的AIV和/或 N6亞型且非H5亞型的AIV和/或非H5亞型且非N6亞型的AIV;
[0033] (b6)制備檢測待測樣本中是否含有H5N6亞型AIV和/或H5亞型且非N6亞型的AIV 和/或N6亞型且非H5亞型的AIV和/或非H5亞型且非N6亞型的AIV的試劑盒。
[0034] 本發明還保護所述引物組合的應用，為如下(bl)至(b6)中的任意一種：
[0035] (bl)鑒別H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5亞型的AIV和非H5 亞型且非N6亞型的AIV;
[0036] (b2)制備用于鑒別H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5亞型的 AIV和非H5亞型且非N6亞型的AIV的試劑盒；
[0037] (b3)鑒定待測病毒是否為H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5 亞型的AIV或非H5亞型且非N6亞型的AIV;
[0038] (b4)制備用于鑒定待測病毒是否為H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞 型且非H5亞型的AIV或非H5亞型且非N6亞型的AIV的試劑盒；
[0039] (b5)檢測待測樣本中是否含有H5N6亞型AIV和/或H5亞型且非N6亞型的AIV和/或 N6亞型且非H5亞型的AIV和/或非H5亞型且非N6亞型的AIV;
[0040] (b6)制備檢測待測樣本中是否含有H5N6亞型AIV和/或H5亞型且非N6亞型的AIV 和/或N6亞型且非H5亞型的AIV和/或非H5亞型且非N6亞型的AIV的試劑盒。
[0041] 本發明還保護含有所述引物組合的試劑盒;所述試劑盒的用途為如下(cl)或(c2) 或(c3):
[0042] (cl)鑒別H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5亞型的AIV和非H5 亞型且非N6亞型的AIV;
[0043] (c2)鑒定待測病毒是否為Η5Ν6亞型AIV、H5亞型且非Ν6亞型的AIV、N6亞型且非Η5 亞型的AIV或非H5亞型且非N6亞型的AIV;
[0044] (c3)檢測待測樣本中是否含有H5N6亞型AIV和/或H5亞型且非N6亞型的AIV和/或 N6亞型且非H5亞型的AIV和/或非H5亞型且非N6亞型的AIV。
[0045]本發明還保護所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨包裝的步驟。
[0046] 本發明還保護一種鑒別H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5亞 型的AIV和非H5亞型且非N6亞型的AIV的方法，包括如下步驟(dl)或(d2):
[0047] (dl)提取待測病毒的RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，采用所述引物組合進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物，如果擴增產物中含有332bp的DNA片段、428bp的DNA片段和 571bp的DNA片段、待測病毒為或候選為H5N6亞型AIV，如果擴增產物中含有332bp的DNA片段 和571bp的DNA片段且不含有428bp的DNA片段、待測病毒為或候選為H5亞型且非N6亞型的 AIV，如果擴增產物中含有428bp的DNA片段和571bp的DNA片段且不含有332bp的DNA片段、待 測病毒為或候選為N6亞型且非H5亞型的AIV，如果擴增產物中含有571bp的DNA片段且不含 有332bp的DNA片段和428bp的DNA片段、待測病毒為或候選為非N6亞型且非H5亞型的AIV; [0048] (d2)檢測待測病毒的cDNA中是否含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所 示的DNA片段、序列表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段或序列表中序列12 自5'末端起第513至940位所示的DNA片段，然后進行如下判斷：如果所述cDNA中同時含有序 列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段、序列表中序列11自5'末端起第598 至929位所示的DNA片段和序列表中序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段、待測 病毒為或候選為H5N6亞型AIV，如果所述cDNA中同時含有序列表中序列10自5'末端起第28 至598位所示的DNA片段和序列表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段且不含 有序列表中序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段、待測病毒為或候選為H5亞型 且非N6亞型的AIV，如果所述cDNA中同時含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示 的DNA片段和序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段且不含有序列表中序列11自 5'末端起第598至929位所示的DNA片段、待測病毒為或候選為N6亞型且非H5亞型的AIV，如 果所述cDNA中含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段且不含有序列 表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段且不含有序列表中序列12自5'末端起 第513至940位所示的DNA片段、待測病毒為或候選為非N6亞型且非H5亞型的AIV。
[0049] 本發明還保護一種鑒定待測病毒是否為H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、 N6亞型且非H5亞型的AIV或非H5亞型且非N6亞型的AIV的方法，包括如下步驟(el)或（e2): [0050] (el)提取待測病毒的RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，采用所述引物組合進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物，如果擴增產物中含有332bp的DNA片段、428bp的DNA片段和 571bp的DNA片段、待測病毒為或候選為H5N6亞型AIV，如果擴增產物中含有332bp的DNA片段 和571bp的DNA片段且不含有428bp的DNA片段、待測病毒為或候選為H5亞型且非N6亞型的 AIV，如果擴增產物中含有428bp的DNA片段和571bp的DNA片段且不含有332bp的DNA片段、待 測病毒為或候選為N6亞型且非H5亞型的AIV，如果擴增產物中含有571bp的DNA片段且不含 有332bp的DNA片段和428bp的DNA片段、待測病毒為或候選為非N6亞型且非H5亞型的AIV，如 果擴增產物中不含有571bp的DNA片段、待測病毒為或候選為非AIV的病毒；
[0051 ] (e2)檢測待測病毒的cDNA中是否含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所 示的DNA片段、序列表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段或序列表中序列12 自5'末端起第513至940位所示的DNA片段，然后進行如下判斷：如果所述cDNA中同時含有序 列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段、序列表中序列11自5'末端起第598 至929位所示的DNA片段和序列表中序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段、待測 病毒為或候選為H5N6亞型AIV，如果所述cDNA中同時含有序列表中序列10自5'末端起第28 至598位所示的DNA片段和序列表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段且不含 有序列表中序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段、待測病毒為或候選為H5亞型 且非N6亞型的AIV，如果所述cDNA中同時含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示 的DNA片段和序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段且不含有序列表中序列11自 5'末端起第598至929位所示的DNA片段、待測病毒為或候選為N6亞型且非H5亞型的AIV，如 果所述cDNA中含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段且不含有序列 表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段且不含有序列表中序列12自5'末端起 第513至940位所示的DNA片段、待測病毒為或候選為非N6亞型且非H5亞型的AIV，如果所述 cDNA中不含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段、待測病毒為或候選 為非AIV的病毒。
[0052] 本發明還保護一種檢測待測樣本中是否含有H5N6亞型AIV和/或H5亞型且非N6亞 型的AIV和/或N6亞型且非H5亞型的AIV和/或非H5亞型且非N6亞型的AIV的方法，包括如下 步驟(Π )或(f2):
[0053] (Π )提取待測病毒的RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，采用所述引物組合進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物，如果擴增產物中含有332bp的DNA片段、428bp的DNA片段和 571bp的DNA片段、待測樣本為如下（gl)或（g2):(gl)疑似含有H5N6亞型AIV的待測樣本； (g2)疑似含有H5亞型AIV和N6亞型AIV的待測樣本，如果擴增產物中含有332bp的DNA片段和 571bp的DNA片段且不含有428bp的DNA片段、待測樣本疑似含有H5亞型且非N6亞型的AIV，如 果擴增產物中含有428bp的DNA片段和571bp的DNA片段且不含有332bp的DNA片段、待測樣本 疑似含有N6亞型且非H5亞型的AIV，如果擴增產物中含有571bp的DNA片段且不含有332bp的 DNA片段和428bp的DNA片段、待測樣本疑似含有非N6亞型且非H5亞型的AIV，如果擴增產物 中不含有571bp的DNA片段、待測樣本疑似不含有AIV的病毒；
[0054] (f2)檢測待測樣本的cDNA中是否含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所 示的DNA片段、序列表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段或序列表中序列12 自5'末端起第513至940位所示的DNA片段，然后進行如下判斷：如果所述cDNA中同時含有序 列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段、序列表中序列11自5'末端起第598 至929位所示的DNA片段和序列表中序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段、待測 樣本為如下（gl)或(g2):(gl)疑似含有H5N6亞型AIV的待測樣本；（g2)疑似含有H5亞型AIV 和N6亞型AIV的待測樣本，如果所述cDNA中同時含有序列表中序列10自5'末端起第28至598 位所示的DNA片段和序列表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段且不含有序 列表中序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段、待測樣本疑似含有H5亞型且非N6 亞型的AIV，如果所述cDNA中同時含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA 片段和序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段且不含有序列表中序列11自5'末端 起第598至929位所示的DNA片段、待測樣本疑似含有N6亞型且非H5亞型的AIV，如果所述 cDNA中含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段且不含有序列表中序 列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段且不含有序列表中序列12自5'末端起第513 至940位所示的DNA片段、待測樣本疑似含有非N6亞型且非H5亞型的AIV，如果所述cDNA中不 含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段、待測樣本疑似不含有AIV的 病毒。
[0055]本發明還保護所述引物對I。
[0056] 本發明還保護所述引物對I的應用，為如下(hi)或(h2):
[0057] (hi)鑒定待測病毒是否為AIV;
[0058] (h2)鑒定待測樣本是否感染了 AIV。
[0059] 本發明還保護含有所述引物對I的試劑盒;所述試劑盒的用途為如下(hi)或(h2):
[0060] (hi)鑒定待測病毒是否為AIV;
[0061] (h2)鑒定待測樣本是否感染了 AIV。
[0062]本發明還保護所述引物對II。
[0063] 本發明還保護所述引物對II的應用，為如下(h3)或(h4):
[0064] (h3)鑒定待測病毒是否為H5亞型AIV;
[0065] (h4)鑒定待測樣本是否感染了 H5亞型AIV。
[0066] 本發明還保護含有所述引物對II的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下（h3)或 (h4)：
[0067] (h3)鑒定待測病毒是否為H5亞型AIV;
[0068] (h4)鑒定待測樣本是否感染了 H5亞型AIV。
[0069]本發明還保護所述引物對ΙΠ 。
[0070] 本發明還保護所述引物對ΙΠ 的應用，為如下(h5)或(h6):
[0071] (h5)鑒定待測病毒是否為N6亞型AIV;
[0072] (h6)鑒定待測樣本是否感染了 N6亞型AIV。
[0073] 本發明還保護含有所述引物對II的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下（h5)或 (h6)：
[0074] (h5)鑒定待測病毒是否為N6亞型AIV;
[0075] (h6)鑒定待測樣本是否感染了 N6亞型AIV。
[0076] 以上任一所述待測病毒具體可為H5N6亞型AIV、H1N1亞型AIV、H2N3亞型AIV、H3N6 亞型 AIV、H4N6 亞型 AIV、H5N2 亞型 AIV、H6N6 亞型 AIV、H7N9 亞型 AIV、H8N4 亞型 AIV、H9N2 亞型 AIV、H9N6 亞型 AIV、H10N3 亞型 AIV、H11 亞型 AIV、H12N5 亞型 AIV、H13N6 亞型 AIV、H15N9 亞型 AIV、H3N2亞型AIV、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒（IBV)或傳染性喉氣管炎病毒 (ILTV)〇
[0077] 以上任一所述PCR擴增的退火溫度具體為53°C。
[0078] 以上任一所述PCR擴增的反應體系中，引物組合中的各條引物的濃度如下:M-F和 M-R的濃度均為0.2pmolAiL，H5-F和H5-R的濃度均為0.2pmolAiL，N6-F和N6-R的濃度均為 0 · 4pmol/iiL〇
[0079] 以上任一所述PCR擴增的反應體系（25yL)具體可為：2XEasy Taq PCR 12.5yL，模 板 lyL，M-F、M-R各Ο · 2yL，H5-F、H5-R各Ο · 2yL，N6-F、N6-R各Ο · 4yL，最后用ddH20補足至 25 · Ομ L〇
[0080] 以上任一所述PCR擴增的反應程序具體可為:94°C預變性3min;94°C30s、53°C退火 30s、72 °C lmin，進行35個循環;72 °C延伸lOmin; 4°C結束擴增。
[0081 ] 本發明建立了 H5亞型AIV、N6亞型AIV和AIV的三重PCR檢測方法。對H5N6亞型AIV只 需一管反應就可以快速鑒別，也可以把H5亞型和N6亞型單個感染以及其他亞型AIV感染鑒 別出來，為快速診斷H5N6亞型AIV提供有力技術支撐。本研究構建的H5亞型AIV、N6亞型AIV 和AIV三重PCR檢測方法具有特異性強，靈敏度高，快速便捷的特點，特異性試驗和敏感性試 驗擴增條帶與預期結果一致，為早期診斷和臨床檢測提供參考依據。
【附圖說明】
[0082]圖1為實施例2中的三重PCR擴增結果圖。
[0083]圖2為實施例4中特異性實驗三重PCR結果圖。
[0084]圖3為實施例5中靈敏度實驗三重PCR結果圖。
【具體實施方式】
[0085]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0086] PMD18-T載體:寶生物工程(大連)有限公司。
[0087] H1N1 亞型AIV毒株：參考文獻：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J] .Virology Journal，2011，8(1): 1-10.，H1N1 亞型 AIV病毒株在參考文獻中的名稱為"A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)"；公眾可從廣西壯 族自治區獸醫研究所獲得。
[0088] H2N3亞型AIV毒株：參考文獻：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J] .Viroloay Journal，2011，8(1): 1-10.，H2N3亞型 AIV病毒株在參考文獻中的名稱為"A/Mallard/Alberta/77(H2N3)" ；公眾可從廣西壯族自 治區獸醫研究所獲得。
[0089] H3N6亞型AIV毒株1:參考文獻:劉婷婷，謝芝勛，宋德貴，等.H3亞型禽流感病毒的 分離與鑒定[J].中國家禽，2015,37(19) :64-67.H3N6亞型AIV病毒株在參考文獻中的名稱 為"A/Pigeon/Guangxi/020P/2009(H3N6)"；公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得。
[0090] H3N6亞型AIV毒株2:參考文獻:劉婷婷，謝芝勛，宋德貴，等.H3亞型禽流感病毒的 分離與鑒定[J].中國家禽，2015,37(19) :64-67.H3N6亞型AIV病毒株在參考文獻中的名稱 為"A/Duck/Guangxi/175D12/2014(H3N6)" ；公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得。
[0091] H4N6 亞型 AIV 毒株：參考文獻：Luo S，Xie Z，Xie L，et al.Reverse-transcription，loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapid detection of H10 subtype avian influenza viruses[J]·Virology Journal，2014，12(12) : 1-7.，H4N6亞型AIV病毒株在參考文獻中的名稱為"A/Duck/ Guangxi/070D/2010 (H4N6)" ；公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得。
[0092] H5N2亞型AIV毒株：參考文獻：Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J] .Virology Journal，2011，8(1): 1-10.，H5N2亞型 AIV病毒株在參考文獻中的名稱為"A/Turkey/GA/209092/02(H5N2)" ；公眾可從廣西壯族自 治區獸醫研究所獲得。
[0093] H6N6 亞型 AIV 毒株：參考文獻：Luo S，Xie Z，Xie L，et al.Reverse-transcription，loop-mediated isothermal amplification assay for the sensitive and rapid detection of H10 subtype avian influenza viruses[J]·Virology Journal，2014,12 (12) : 1-7.，H6N6亞型AIV病毒株在參考文獻中的名稱為"A/duck/ Guangxi/GXd-4/2009 (H6N6)" ；公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得。
[0094] H7N9亞型AIV RNA:參考文獻：羅思思等;H7亞型和N9亞型禽流感病毒RT-LAMP可視 化檢測方法的建立.畜牧獸醫學報2015,46(7) :1176-1183. ;H7N9亞型AIV RNA在參考文獻 中的名稱為"H7N9 RNA" ；公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得。
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[0107] 雞毒支原體(MG):參考文獻:Yi P，Xie Z，Liu J，et al.Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay[J] .Virology Journal，2011，8(1): 1-10.，雞毒支原體 (MG)在參考文獻中的名稱為"Mycoplasma gallisepticum(S6)" ；公眾可從廣西壯族自治區 獸醫研究所獲得。
[0108]實施例1、引物設計
[0109] 進行大量序列分析、比對獲得了用于鑒定AIV、H5亞型AIV和N6亞型AIV的若干引 物。將各個引物進行預實驗，比較靈敏度、特異性等性能，最終得到用于鑒定AIV的一對引 物、用于鑒定H5亞型AIV的一對引物和用于鑒定N6亞型AIV的一對引物。
[0110] 用于鑒定AIV的特異性引物對由如下兩條引物組成(5'-3'）：
[0111] M-F(序列表的序列 1) :GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAA;
[0112] M-R(序列表的序列2) :CTGCTCCATAGCCTTAGCTGTAG;
[0113] 用于鑒定H5亞型AIV的特異性引物對由如下兩條引物組成(5'-3'）：
[0114] H5-F(序列表的序列3) :ACTGTGGGGGATTCACCATTC;
[0115] H5-R(序列表的序列4) :TCGCCCCTATTGGAGTTTGAC;
[0116] 用于鑒定N6亞型AIV的特異性引物對由如下兩條引物組成(5'-3'）：
[0117] N6-F(序列表的序列5) :AGTTGGGAAATGGGTCAAGCA;
[0118] N6-R(序列表的序列6) :GGTCTATTTGCCCCCTTCCAA;
[0119] 用于鑒定AIV的引物對命名為引物對I。
[0120]用于鑒定H5亞型AIV的引物對命名為引物對II。
[0121] 用于鑒定N6亞型AIV的引物對命名為引物對ΙΠ 。
[0122] 弓丨物組合由引物對I、引物對II和引物對ΙΠ 組成。
[0123] 實施例2、三重PCR反應條件優化
[0124] -、模板制備
[0125] 1、提取H5N2亞型AIV的總RNA，反轉錄為cDNA。
[0126] 2、提取HI 3N6亞型AIV的總RNA，反轉錄為cDNA。
[0127] 3、以步驟1得到的cDNA為模板，采用引物M-1和引物M-2進行PCR擴增，得到擴增產 物(序列表的序列10)，產物回收純化后與PMD18-T載體連接，得到重組質粒PMD18-T-M，濃度 為12.63父10 16拷貝/^。
[0128] M-1:5，-AGCAAAAGCAGGATAG-3，；
[0129] M-2:5 '-AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT-3 '；
[0130] 4、以步驟1得到的cDNA為模板，采用引物HA-1和引物HA-2進行PCR擴增，得到擴增 產物(序列表的序列11)，產物回收純化后與PMD18-T載體連接，得到重組質粒PMD18-T-H5， 濃度為10.9X1015拷貝ΛΛ。
[0131] HA-1:5，-AGCAAAAGCAGGGG-3，；
[0132] HA-2:5 '-AGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3 '；
[0133] 5、以步驟2得到的cDNA為模板，采用引物NA-1和引物NA-2進行PCR擴增，得到擴增 產物(序列表的序列12)，產物回收純化后與PMD18-T載體連接，得到重組質粒PMD18-T-N6， 濃度為10.1X10 15拷貝ΛΛ。
[0134] NA-1:5 '-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGTGAAAATG-3 '；
[0135] NA-2:5 '-ATATCGTCTGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3 '；
[0136] 6、將重組質粒PMD18-T-M、重組質粒PMD18-T-H5和重組質粒PMD18-T-N6分別稀釋 成8.41 X 101()拷貝AxL，按照拷貝數1:1:1比例混合，得到混合質粒DNA。
[0137] 二、引物濃度優化
[0138] 取步驟一得到的混合質粒DNA作為模板，采用實施例1制備的引物組合進行三重 PCR〇
[0139] 三重PCR的反應體系（25.0yL):2XEasy Taq PCR 12.5yL，模板lyL(重組質粒 PMD18-T-M、重組質粒PMD18-T-H5和重組質粒PMD18-T-N6均為8.41 X 101Q拷貝/yL)，M-F、M-R 各0 · 2yL，H5-F、H5-R各0 · 2yL，N6-F、N6-R各0 · 4yL，最后用ddH20補足至 25 · OyL。
[0140] 設置不同的引物濃度，設置方法如表1所示，按照表1所示的3個因素設置216個處 理組。
[0141] 表1引物在反應體系中的濃度
[0142]
[0143] 三重 PCR 的反應程序：94°C 預變性 3!1^11;941€3〇8、53°(：退火3〇8、72°(：11^11，進行35 個循環;72°C延伸10min;4°C結束擴增。
[0144] 將三重PCR的擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。
[0145] 根據電泳結果，選擇擴增效果最佳的引物濃度：M-F和M-R的優選濃度均為 0.2pmol/yL，H5-F和H5-R的優選濃度均為0.2pmol/yL，N6-F和N6-R的優選濃度均為 0 · 4pmol/iiL〇
[0146] 三、退火溫度優化
[0147] 取步驟一得到的混合質粒DNA作為模板，采用實施例1制備的引物組合進行三重 PCR〇
[0148] 三重PCR的反應體系（25.0yL):2XEasy Taq PCR 12.5yL，模板lyL(重組質粒 PMD18-T-M、重組質粒PMD18-T-H5和重組質粒PMD18-T-N6均為8.41 X 101Q拷貝/yL)，M-F、M-R 各0.2yL，H5-F、H5-R各0.2yL，N6-F、N6-R各0.4yL，最后用 ddH20補足至 25. OyL。三重PCR 的反 應體系中，M-F和M-R的濃度均為0 · 2pmolAiL，H5-F和H5-R的濃度均為0 · 2pmolAxL，N6-F和 N6-R的濃度均為0.4pmolAiL。
[0149] 三重PCR的反應程序：94°C預變性3min; 94°C 30s、退火30s、72 °C lmin，進行35個循 環;72°C延伸10min;4°C結束擴增。
[0150] 分別設置如下退火溫度：
[0151] 退火溫度 I:52°C;
[0152] 退火溫度 II:53°C;
[0153] 退火溫度in:54°C;
[0154] 退火溫度 IV:55°C;
[0155] 退火溫度 V:56°C;
[0156] 退火溫度VI :57 °C;
[0157] 退火溫度VII :58°C;
[0158] 將三重PCR的擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。
[0159] 根據電泳結果，選擇擴增效果最佳的退火溫度為53°C。
[0160] 綜合步驟二和步驟三，得到如下結論:三重PCR反應體系中，M-F和M-R的優選濃度 均為0.2pmolAiL，H5-F和H5-R的優選濃度均為0.2pmolAiL，N6-F和N6-R的優選濃度均為 0 · 4pmolAiL;三重PCR的優選反應程序為：94°C預變性3min; 94 °C 30s、53 °C退火30s、72 °C 1111；[11，進行35個循環;72°(^延伸10111；[11;4°(^結束擴增。
[0161] 四、優化條件驗證
[0162 ] 待測樣本為:步驟一制備的重組質粒PMD18-T-M、步驟一制備的重組質粒PMD18-T-H5、步驟一制備的重組質粒PMD18-T-N6。
[0163] 1、將重組質粒PMD18-T-M、重組質粒PMD18-T-H5和重組質粒PMD18-T-N6分別稀釋 成8·41Χ10 1()拷貝 ΛΛ。
[0164] 2、將步驟1的重組質粒PMD18-T-M、重組質粒PMD18-T-H5和重組質粒PMD18-T-N6按 照拷貝數1:1:1比例混合，得到混合質粒DNA。
[0165] 3、分別以步驟1的各個質粒DNA和步驟2的混合質粒DNA作為模板，采用實施例1制 備的引物組合進行三重PCR。
[0166] 三重PCR的反應體系（25.0yL):2XEasy Taq PCR 12.5yL，模板lyL，M-F、M-R各0.2 yL，H5-F、H5-R各 0 · 2yL，N6-F、N6-R各 0 · 4yL，最后用ddH20 補足至25 · OyL。三重 PCR 的反應體 系中，M-F和M-R的濃度均為0.2pmolAiL，H5-F和H5-R的濃度均為0.2pmolAiL，N6-F和N6-R的 濃度均為〇. 4pmolAiL。設置用等體積水代替待測樣本的陰性對照。
[0167] 模板為步驟1的重組質粒PMD18-T-M、重組質粒PMD18-T-H5或重組質粒PMD18-T-N6 時，lyL模板中重組質粒DNA的濃度為8.41 X 101Q拷貝ΛΛ。
[0168] 模板為步驟2的混合質粒DNA時，lyL模板中混合質粒DNA的濃度為8.41 X 101Q拷貝/ yL〇
[0169] 三重 PCR 的反應程序為：94°C 預變性 3!1^11;941€3〇8、53°(：退火3〇8、72°(：11^11，進行 35個循環;72°C延伸10min;4°C結束擴增。
[0170] 將三重PCR的擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。
[0171] 結果如圖1所示。圖1中，Μ為DL1000DNA Maker，泳道1為陰性對照，泳道2為混合質 粒DNA的三重PCR的擴增產物，泳道3為重組質粒PMD18-T-!KDNA的三重PCR的擴增產物，泳道 4為重組質粒PMD18-T-N6DNA的三重PCR的擴增產物，泳道5為重組質粒PMD18-T-M DNA的三 重PCR的擴增產物。使用三重PCR對混合質粒擴增結果出現3條特異性條帶(條帶A:332bp、條 帶B:428bp和條帶C:571bp);對重組質粒PMD18-T-H5擴增結果出現2條特異性條帶(條帶A: 332bp和條帶C:571bp);對重組質粒PMD18-T-N6擴增結果出現2條特異性條帶(條帶B:428bp 和條帶C:571bp)，對重組質粒PMD18-T-M擴增出現1條特異性條帶(條帶C:571bp)。將擴增產 物測序，條帶A對應的測序結果序列如序列8所示，條帶B對應的測序結果序列如序列9所示， 條帶C對應的測序結果序列如序列7所示。
[0172] 實施例3、三重PCR檢測方法建立
[0173] -、根據實施例2的條件優化結果，確立如下檢測待測病毒的方法：
[0174] 1、提取待測病毒的總RNA，并反轉錄成cDNA。
[0175] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，采用實施例1的引物組合進行三重PCR擴增。
[0176] 三重PCR的反應體系（25.0yL):2XEasy Taq PCR 12.5yL，模板lyL，M-F、M-R各0.2 yL，H5-F、H5-R各 0.2yL，N6-F、N6-R各0.4yL，最后用 ddH20補足至 25. OyL。三重PCR 的反應體 系中，M-F和M-R的濃度均為0.2pmolAi，H5-F和H5-R的濃度均為0.2pmolAxL，N6-F和N6-R的 濃度均為〇. 4pmolAiL。
[0177] 三重 PCR 的反應程序為：94°C 預變性 3!1^11;941€3〇8、53°(：退火3〇8、72°(：11^11，進行 35個循環;72°C延伸10min;4°C結束擴增。
[0178] 3、將三重PCR的擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳結果進行判斷，判 斷方法如下：
[0179] 如果擴增產物中含有332bp的DNA片段、428bp的DNA片段和571bp的DNA片段，待測 病毒為或候選為H5N6亞型AIV;
[0180] 如果擴增產物中含有332bp的DNA片段和571bp的DNA片段、不含有428bp的DNA片 段，待測病毒為或候選為H5亞型且非N6亞型的AIV;
[0181] 如果擴增產物中含有428bp的DNA片段和571bp的DNA片段、不含有332bp的DNA片 段，待測病毒為或候選為N6亞型且非H5亞型的AIV;
[0182] 如果擴增產物中含有571bp的DNA片段、不含有332bp的DNA片段和428bp的DNA片 段，待測病毒為或候選為非N6亞型且非H5亞型的AIV;
[0183] 如果擴增產物中不含有571bp的DNA片段，待測病毒為或候選為非AIV的病毒。
[0184] 二、根據實施例2的條件優化結果，確立如下檢測待測樣本的方法：
[0185] 1、提取待測樣本的總RNA，并反轉錄成cDNA。
[0186] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，采用實施例1的引物組合進行三重PCR擴增。
[0187] 三重PCR的反應體系（25.0yL):2XEasy Taq PCR 12.5yL，模板lyL，M-F、M-R各0.2 yL，H5-F、H5-R各 0.2yL，N6-F、N6-R各0.4yL，最后用 ddH20補足至 25. OyL。三重PCR 的反應體 系中，M-F和M-R的濃度均為0.2pmolAiL，H5-F和H5-R的濃度均為0.2pmolAiL，N6-F和N6-R的 濃度均為〇. 4pmolAiL。
[0188] 三重 PCR 的反應程序為：94°C 預變性 3!1^11;941€3〇8、53°(：退火3〇8、72°(：11^11，進行 35個循環;72°C延伸10min;4°C結束擴增。
[0189] 3、將三重PCR的擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳結果進行判斷，判 斷方法如下：
[0190] 如果擴增產物中含有332bp的DNA片段、428bp的DNA片段和571bp的DNA片段，待測 樣本為如下（1)或（2): (1)疑似含有H5N6亞型AIV的待測樣本；（2)疑似含有H5亞型AIV和N6 亞型AIV的待測樣本；
[0191] 如果擴增產物中含有332bp的DNA片段和571bp的DNA片段、不含有428bp的DNA片 段，待測樣本疑似含有H5亞型且非N6亞型的AIV;
[0192] 如果擴增產物中含有428bp的DNA片段和571bp的DNA片段、不含有332bp的DNA片 段，待測樣本疑似含有N6亞型且非H5亞型的AIV;
[0193] 如果擴增產物中含有571bp的DNA片段、不含有332bp的DNA片段和428bp的DNA片 段，待測樣本疑似含有非N6亞型且非H5亞型的AIV;
[0194] 如果擴增產物中不含有571bp的DNA片段，待測樣本疑似不含有AIV。
[0195] 實施例4、特異性
[0196] 待測樣本為:待測樣本為:H1N1亞型AIV毒株、H2N3亞型AIV毒株、H3N6亞型AIV毒株 1、H4N6亞型AIV毒株、H5N2亞型AIV毒株、H6N6亞型AIV毒株、H7N9亞型AIV RNA、H8N4亞型AIV 毒株、H9N2亞型AIV毒株、H9N6亞型AIV毒株、H10N3亞型AIV毒株、H11亞型AIV毒株、H12N5亞 型AIV毒株、H13N6亞型AIV毒株、H3N6亞型AIV毒株2、H15N9亞型AIV毒株、H3N2亞型AIV毒株、 新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒（IBV)、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV)、雞毒支原體 (MG)〇
[0197] 1、提取待測樣本的基因組DNA。待測樣本分別為:傳染性喉氣管炎病毒（ILTV)、雞 毒支原體(MG)。
[0198] 2、提取待測樣本的總RNA，并反轉錄成cDNA。待測樣本分別為:H1N1亞型AIV毒株、 H2N3亞型AIV毒株、H3N6亞型AIV毒株1、H4N6亞型AIV毒株、H5N2亞型AIV毒株、H6N6亞型AIV 毒株、H8N4亞型AIV毒株、H9N2亞型AIV毒株、H9N6亞型AIV毒株、H10N3亞型AIV毒株、H11亞型 AIV毒株、H12N5亞型AIV毒株、H13N6亞型AIV毒株、H3N6亞型AIV毒株2、H15N9亞型AIV毒株、 H3N2亞型AIV毒株、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒（IBV)。
[0199] 3、將H7N9亞型AIV RNA反轉錄成cDNA。
[0200] 4、分別將步驟1得到的各個基因組DNA樣本、步驟2得到的各個cDNA樣本和步驟3得 到的cDNA作為模板，采用實施例1制備的引物組合進行三重PCR。
[0201] 三重PCR的反應體系（25.0yL):2XEasy Taq PCR 12.5yL，模板lyL，M-F、M-R各0.2 yL，H5-F、H5-R各 0.2yL，N6-F、N6-R各0.4yL，最后用 ddH20補足至 25. OyL。三重PCR 的反應體 系中，M-F和M-R的濃度均為0.2pmolAiL，H5-F和H5-R的濃度均為0.2pmolAiL，N6-F和N6-R的 濃度均為〇.4pmolAiL。設置用H5N2亞型AIV毒株cDNA和H13N6亞型AIV毒株cDNA按照拷貝數1 :1比例混合的混合物代替待測樣本的陽性對照A，設置用重組質粒PMD18-T-H5和重組質粒 PMD18-T-N6按照拷貝數1:1比例混合的混合物代替待測樣本的陽性對照B。設置用等體積水 代替待測樣本的陰性對照。
[0202]模板為傳染性喉氣管炎病毒（ILTV)的基因組DNA時，lyL模板中的DNA含量為890μ g;
[0203] 模板為雞毒支原體(MG)的基因組DNA時，lyL模板中的DNA含量為924yg;
[0204] 模板為H1N1亞型AIV毒株的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1055yg;
[0205] 模板為H2N3亞型AIV毒株的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1060yg;
[0206] 模板為H3N2亞型AIV毒株的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1054yg;
[0207] 模板為H3N6亞型AIV毒株1的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1067yg;
[0208] 模板為H4N6亞型AIV毒株的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1046yg;
[0209] 模板為H5N2亞型AIV毒株的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1078yg;
[0210] 模板為H6N6亞型AIV毒株的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1068yg;
[0211] 模板為H7N9亞型AIV的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1070yg;
[0212] 模板為H8N4亞型AIV毒株的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1056yg;
[0213] 模板為H9N2亞型AIV毒株的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1069yg;
[0214] 模板為H9N6亞型AIV毒株的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1087yg;
[0215] 模板為H10N3亞型AIV毒株的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1060yg;
[0216] 模板為H11亞型AIV毒株的eDNA時，lyL模板中的DNA含量為1053yg;
[0217] 模板為H12N5亞型AIV毒株的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1063yg;
[0218] 模板為H13N6亞型AIV毒株的eDNA時，lyL模板中的DNA含量為1065yg;
[0219] 模板為H3N6亞型AIV毒株2的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1068yg;
[0220] 模板為H15N9亞型AIV毒株的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1063yg;
[0221] 模板為新城疫病毒(NDV)的cDNA時，lyL模板中的DNA含量為1080yg;
[0222] 模板為傳染性支氣管炎病毒（IBV)的cDNA時，lyL模板中的DNA含量1083yg;
[0223] 三重 PCR 的反應程序為：94°C 預變性 3!1^11;941€3〇8、53°(：退火3〇8、72°(：11^11，進行 35個循環;72°C延伸10min;4°C結束擴增。
[0224] 將三重PCR的擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳并拍照。
[0225] 結果見圖2。圖2中，Μ為DL1000DNA Maker，泳道1為陽性對照A三重PCR的擴增產物， 泳道B為陽性對照B三重PCR的擴增產物，泳道3為H1N1亞型AIV毒株cDNA的三重PCR的擴增產 物，泳道4為H2N3亞型AIV毒株cDNA的三重PCR的擴增產物，泳道5為H3N6亞型AIV毒株lcDNA 的三重PCR的擴增產物，泳道6為H4N6亞型AIV毒株cDNA的三重PCR的擴增產物，泳道7為H5N2 亞型AIV毒株cDNA的三重PCR的擴增產物，泳道8為H6N6亞型AIV毒株cDNA的三重PCR的擴增 產物，泳道9為H7N9亞型AIV cDNA的三重PCR的擴增產物，泳道10為H8N4亞型AIV毒株cDNA的 三重PCR的擴增產物，泳道11為H9N6亞型AIV毒株cDNA的三重PCR的擴增產物，泳道12為 H10N3亞型AIV毒株cDNA的三重PCR的擴增產物，泳道13為H11亞型AIV毒株cDNA的三重PCR的 擴增產物，泳道14為H12N5亞型AIV毒株cDNA的三重PCR的擴增產物，泳道15為H13N6亞型AIV 毒株cDNA的三重PCR的擴增產物，泳道16為H3N6亞型AIV毒株2cDNA的三重PCR的擴增產物， 泳道17為H15N9亞型AIV毒株cDNA的三重PCR的擴增產物，泳道18為H3N2亞型AIV毒株cDNA的 三重PCR的擴增產物，泳道19為H9N2亞型AIV毒株cDNA的三重PCR的擴增產物，泳道20為新城 疫病毒cDNA的三重PCR的擴增產物，泳道21為傳染性支氣管炎病毒cDNA的三重PCR的擴增產 物，泳道22為傳染性喉氣管炎病毒基因組DNA的三重PCR的擴增產物，泳道23為雞毒支原體 基因組DNA的三重PCR的擴增產物，泳道24為陰性對照。結果表明，使用三重PCR對陽性對照A 和陽性對照B擴增結果出現3條特異性條帶（332bp、428bp和571bp);對H5N2亞型AIV擴增結 果出現2條特異性條帶（332bp和571bp);對!13冊、!14冊、!16冊、!19冊、!113冊亞型41￥擴增結果 出現2條特異性條帶(428bp和571bp)，對其他亞型AIV擴增出現1條特異性條帶(571bp);對 常見的禽類疾病病毒的擴增均未出現條帶，而對其他病毒及支原體沒有出現條帶。
[0226] 實施例5、靈敏度
[0227] 1、按照實施例2的步驟一的方法制備混合質粒DNA。
[0228] 2、用ddH20 10倍梯度稀釋步驟1得到的混合質粒DNA，得到各個稀釋液。
[0229] 3、以步驟2得到的各稀釋液作為模板，采用實施例1制備的引物組合進行三重PCR。
[0230] 三重PCR的反應體系（25.0yL):2XEasy Taq PCR 12.5yL，模板lyL，M-F、M-R各0.2 yL，H5-F、H5-R各 0.2yL，N6-F、N6-R各0.4yL，最后用 ddH20補足至 25. OyL。三重PCR 的反應體 系中，M-F和M-R的濃度均為0.2pmolAiL，H5-F和H5-R的濃度均為0.2pmolAiL，N6-F和N6-R的 濃度均為〇. 4pmolAiL。設置用等體積水代替待測樣本的陰性對照。
[0231] 由于采用的稀釋液不同，形成如下不同的反應體系：
[0232] 反應體系1中，混合質粒DNA中每種質粒DNA的初始濃度為:2 X 107拷貝AxL;
[0233] 反應體系2中，混合質粒DNA中每種質粒DNA的初始濃度為:2X 106拷貝AxL;
[0234] 反應體系3中，混合質粒DNA中每種質粒DNA的初始濃度為:2X 105拷貝AxL;
[0235] 反應體系4中，混合質粒DNA中每種質粒DNA的初始濃度為:2X 104拷貝
[0236] 反應體系5中，混合質粒DNA中每種質粒DNA的初始濃度為:2X 103拷貝AxL;
[0237] 反應體系6中，混合質粒DNA中每種質粒DNA的初始濃度為:2X 102拷貝AxL;
[0238] 反應體系7中，混合質粒DNA中每種質粒DNA的初始濃度為:20拷貝ΛΛ;
[0239] 三重 PCR 的反應程序為：94°C 預變性 3!1^11;941€3〇8、53°(：退火3〇8、72°(：11^11，進行 35個循環;72°C延伸10min;4°C結束擴增。
[0240] 將三重PCR的擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳并拍照。
[0241] 結果見圖3。圖3中，Μ為DL1000DNA Maker，泳道1-7依次對應采用反應體系1-7時三 重PCR的擴增產物，泳道8為陰性對照。結果表明，使用三重PCR檢測AIV時，檢測所需的最低 模板含量為2 X 103個拷貝；使用三重PCR檢測H5亞型的AIV和N6亞型的AIV時，檢測所需的最 低模板含量為2 X102個拷貝。
【主權項】
1. 引物組合，由引物對I、引物對II和引物對III組成； 所述引物對I由引物M-F和引物M-R組成； 所述引物M-F為如下(al)或(a2); (al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子； (a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物M-R為如下(a3)或(a4); (a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子； (a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同 功能的DNA分子； 所述引物對Π 由引物H5-F和引物H5-R組成； 所述引物H5-F為如下(a5)或(a6); (a5)序列表的序列3所不的單鏈DNA分子； (a6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同 功能的DNA分子； 所述引物H5-R為如下(a7)或(a8); (a7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子； (a8)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同 功能的DNA分子； 所述引物對ΠI由引物N6-F和引物N6-R組成； 所述引物N6-F為如下(a9)或(alO); (a9)序列表的序列5所不的單鏈DNA分子； (alO)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同 功能的DNA分子； 所述引物N6-R為如下(all)或(al2); (all)序列表的序列6所不的單鏈DNA分子； (al2)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同 功能的DNA分子。2. 權利要求1所述引物組合的應用，為如下(bl)至(b6)中的任意一種： (bl)鑒別H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5亞型的AIV和非H5亞型 且非N6亞型的AIV; (b2)制備用于鑒別H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5亞型的AIV和 非H5亞型且非N6亞型的AIV的試劑盒； (b3)鑒定待測病毒是否為H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5亞型 的AIV或非H5亞型且非N6亞型的AIV; (b4)制備用于鑒定待測病毒是否為H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且 非H5亞型的AIV或非H5亞型且非N6亞型的AIV的試劑盒； (b5)檢測待測樣本中是否含有H5N6亞型AIV和/或H5亞型且非N6亞型的AIV和/或N6亞 型且非H5亞型的AIV和/或非H5亞型且非N6亞型的AIV; (b6)制備檢測待測樣本中是否含有H5N6亞型AIV和/或H5亞型且非N6亞型的AIV和/或 N6亞型且非H5亞型的AIV和/或非H5亞型且非N6亞型的AIV的試劑盒。3. 含有權利要求1所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下（cl)或（c2)或 (c3)： (cl)鑒別H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5亞型的AIV和非H5亞型 且非N6亞型的AIV; (c2)鑒定待測病毒是否為H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5亞型 的AIV或非H5亞型且非N6亞型的AIV; (c3)檢測待測樣本中是否含有H5N6亞型AIV和/或H5亞型且非N6亞型的AIV和/或N6亞 型且非H5亞型的AIV和/或非H5亞型且非N6亞型的AIV。4. 權利要求3所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨包裝的步驟。5. -種鑒別H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5亞型的AIV和非H5亞 型且非N6亞型的AIV的方法，包括如下步驟(dl)或(d2): (dl)提取待測病毒的RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，采用權利要求1所述引物組 合進行PCR擴增，得至IjPCR擴增產物，如果擴增產物中含有332bp的DNA片段、428bp的DNA片段 和571bp的DNA片段、待測病毒為或候選為H5N6亞型AIV，如果擴增產物中含有332bp的DNA片 段和571bp的DNA片段且不含有428bp的DNA片段、待測病毒為或候選為H5亞型且非N6亞型的 AIV，如果擴增產物中含有428bp的DNA片段和571bp的DNA片段且不含有332bp的DNA片段、待 測病毒為或候選為N6亞型且非H5亞型的AIV，如果擴增產物中含有571bp的DNA片段且不含 有332bp的DNA片段和428bp的DNA片段、待測病毒為或候選為非N6亞型且非H5亞型的AIV; (d2)檢測待測病毒的cDNA中是否含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的 DNA片段、序列表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段或序列表中序列12自5' 末端起第513至940位所示的DNA片段，然后進行如下判斷:如果所述cDNA中同時含有序列表 中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段、序列表中序列11自5'末端起第598至929 位所示的DNA片段和序列表中序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段、待測病毒為 或候選為H5N6亞型AIV，如果所述cDNA中同時含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位 所示的DNA片段和序列表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段且不含有序列 表中序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段、待測病毒為或候選為H5亞型且非N6 亞型的AIV，如果所述cDNA中同時含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA 片段和序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段且不含有序列表中序列11自5'末端 起第598至929位所示的DNA片段、待測病毒為或候選為N6亞型且非H5亞型的AIV，如果所述 cDNA中含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段且不含有序列表中序 列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段且不含有序列表中序列12自5'末端起第513 至940位所示的DNA片段、待測病毒為或候選為非N6亞型且非H5亞型的AIV。6. -種鑒定待測病毒是否為H5N6亞型AIV、H5亞型且非N6亞型的AIV、N6亞型且非H5亞 型的AIV或非H5亞型且非N6亞型的AIV的方法，包括如下步驟(el)或(e2): (el)提取待測病毒的RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，采用權利要求1所述引物組 合進行PCR擴增，得至IjPCR擴增產物，如果擴增產物中含有332bp的DNA片段、428bp的DNA片段 和571bp的DNA片段、待測病毒為或候選為H5N6亞型AIV，如果擴增產物中含有332bp的DNA片 段和571bp的DNA片段且不含有428bp的DNA片段、待測病毒為或候選為H5亞型且非N6亞型的 AIV，如果擴增產物中含有428bp的DNA片段和571bp的DNA片段且不含有332bp的DNA片段、待 測病毒為或候選為N6亞型且非H5亞型的AIV，如果擴增產物中含有571bp的DNA片段且不含 有332bp的DNA片段和428bp的DNA片段、待測病毒為或候選為非N6亞型且非H5亞型的AIV，如 果擴增產物中不含有571bp的DNA片段、待測病毒為或候選為非AIV的病毒； (e2)檢測待測病毒的cDNA中是否含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的 DNA片段、序列表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段或序列表中序列12自5' 末端起第513至940位所示的DNA片段，然后進行如下判斷:如果所述cDNA中同時含有序列表 中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段、序列表中序列11自5'末端起第598至929 位所示的DNA片段和序列表中序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段、待測病毒為 或候選為H5N6亞型AIV，如果所述cDNA中同時含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位 所示的DNA片段和序列表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段且不含有序列 表中序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段、待測病毒為或候選為H5亞型且非N6 亞型的AIV，如果所述cDNA中同時含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA 片段和序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段且不含有序列表中序列11自5'末端 起第598至929位所示的DNA片段、待測病毒為或候選為N6亞型且非H5亞型的AIV，如果所述 cDNA中含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段且不含有序列表中序 列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段且不含有序列表中序列12自5'末端起第513 至940位所示的DNA片段、待測病毒為或候選為非N6亞型且非H5亞型的AIV，如果所述cDNA中 不含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段、待測病毒為或候選為非 AIV的病毒。7. -種檢測待測樣本中是否含有H5N6亞型AIV和/或H5亞型且非N6亞型的AIV和/或N6 亞型且非H5亞型的AIV和/或非H5亞型且非N6亞型的AIV的方法，包括如下步驟(Π )或(f2): (Π )提取待測病毒的RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，采用權利要求1所述引物組 合進行PCR擴增，得至IjPCR擴增產物，如果擴增產物中含有332bp的DNA片段、428bp的DNA片段 和571bp的DNA片段、待測樣本為如下（gl)或(g2):(gl)疑似含有H5N6亞型AIV的待測樣本； (g2)疑似含有H5亞型AIV和N6亞型AIV的待測樣本，如果擴增產物中含有332bp的DNA片段和 571bp的DNA片段且不含有428bp的DNA片段、待測樣本疑似含有H5亞型且非N6亞型的AIV，如 果擴增產物中含有428bp的DNA片段和571bp的DNA片段且不含有332bp的DNA片段、待測樣本 疑似含有N6亞型且非H5亞型的AIV，如果擴增產物中含有571bp的DNA片段且不含有332bp的 DNA片段和428bp的DNA片段、待測樣本疑似含有非N6亞型且非H5亞型的AIV，如果擴增產物 中不含有571bp的DNA片段、待測樣本疑似不含有AIV的病毒； (f2)檢測待測樣本的cDNA中是否含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的 DNA片段、序列表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段或序列表中序列12自5' 末端起第513至940位所示的DNA片段，然后進行如下判斷:如果所述cDNA中同時含有序列表 中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段、序列表中序列11自5'末端起第598至929 位所示的DNA片段和序列表中序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段、待測樣本為 如下（gl)或(g2):(gl)疑似含有H5N6亞型AIV的待測樣本；（g2)疑似含有H5亞型AIV和N6亞 型AIV的待測樣本，如果所述cDNA中同時含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示 的DNA片段和序列表中序列11自5'末端起第598至929位所示的DNA片段且不含有序列表中 序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段、待測樣本疑似含有H5亞型且非N6亞型的 AIV，如果所述cDNA中同時含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段和 序列12自5'末端起第513至940位所示的DNA片段且不含有序列表中序列11自5'末端起第 598至929位所示的DNA片段、待測樣本疑似含有N6亞型且非H5亞型的AIV，如果所述cDNA中 含有序列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段且不含有序列表中序列11自 5'末端起第598至929位所示的DNA片段且不含有序列表中序列12自5'末端起第513至940位 所示的DNA片段、待測樣本疑似含有非N6亞型且非H5亞型的AIV，如果所述cDNA中不含有序 列表中序列10自5'末端起第28至598位所示的DNA片段、待測樣本疑似不含有AIV的病毒。8. 引物對I或引物對II或引物對III: 所述引物對I由引物M-F和引物M-R組成； 所述引物M-F為如下(al)或(a2); (al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子； (a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物M-R為如下(a3)或(a4); (a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子； (a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同 功能的DNA分子； 所述引物對Π 由引物H5-F和引物H5-R組成； 所述引物H5-F為如下(a5)或(a6); (a5)序列表的序列3所不的單鏈DNA分子； (a6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同 功能的DNA分子； 所述引物H5-R為如下(a7)或(a8); (a7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子； (a8)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同 功能的DNA分子； 所述引物對ΠI由引物N6-F和引物N6-R組成； 所述引物N6-F為如下(a9)或(alO); (a9)序列表的序列5所不的單鏈DNA分子； (alO)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同 功能的DNA分子； 所述引物N6-F為如下(all)或(al2); (all)序列表的序列6所不的單鏈DNA分子； (al2)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同 功能的DNA分子。9. 權利要求8所述引物對I在制備試劑盒甲中的應用，或，所述引物對II在制備試劑盒 乙中的應用，或，所述引物對III在制備試劑盒丙中的應用； 所述試劑盒甲的用途為如下(hi)或(h2): (hi)鑒定待測病毒是否為AIV; (h2)鑒定待測樣本是否感染了 AIV; 所述試劑盒乙的用途為如下(h3)或(h4): (h3)鑒定待測病毒是否為H5亞型AIV; (h4)鑒定待測樣本是否感染了 H5亞型AIV; 所述試劑盒丙的用途為如下(h5)或(h6): (h5)鑒定待測病毒是否為N6亞型AIV; (h6)鑒定待測樣本是否感染了 N6亞型AIV。10.含有權利要求8所述引物對I的試劑盒甲，或，含有權利要求8所述引物對II的試劑 盒乙，或，含有權利要求8所述引物對III的試劑盒丙； 所述試劑盒甲的用途為如下(hi)或(h2): (hi)鑒定待測病毒是否為AIV; (h2)鑒定待測樣本是否感染了 AIV; 所述試劑盒乙的用途為如下(h3)或(h4): (h3)鑒定待測病毒是否為H5亞型AIV; (h4)鑒定待測樣本是否感染了 H5亞型AIV; 所述試劑盒丙的用途為如下(h5)或(h6): (h5)鑒定待測病毒是否為N6亞型AIV; (h6)鑒定待測樣本是否感染了 N6亞型AIV。
【文檔編號】C12Q1/70GK105950789SQ201610554720
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月14日
【發明人】謝芝勛, 何瑩, 羅思思, 李孟, 謝志勤, 謝麗基, 黃莉, 鄧顯文, 黃嬌玲, 張艷芳, 曾婷婷
【申請人】廣西壯族自治區獸醫研究所