用于腫瘤分子亞型分型的方法和試劑盒的制作方法
【專利說明】用于腫瘤分子亞型分型的方法和試劑盒
[0001]發明技術領域
[0002] 本發明涉及鑒定癌癥患者中腫瘤的分子亞型的體外方法以及將癌癥患者分類以 進行腫瘤治療的方法。本發明還涉及用于鑒定癌癥患者中腫瘤的分子亞型的試劑盒。
[0003] 發明背景
[0004] 腫瘤預后和治療反應預測與腫瘤的分子亞型密切相關。當前世界上使用的檢測癌 癥如乳腺癌的受體狀態的標準方法為由福爾馬林固定且石蠟包埋的（FFPE)活組織切片或 切除組織的免疫組織化學（IHC)。目前，給予內分泌或靶向系統治療（即曲妥單抗)大多是基 于 IHC。
[0005] FFPE樣本制備和隨后的利用特異性抗體的免疫組織化學染色是僅能在病理實驗 室中進行的當前技術。從FFPE腫瘤組織的顯微檢查加上染色結果的解釋，病理學家進一步 得到了關于腫瘤生物學和腫瘤擴散的臨床上至關重要的信息。此外，病理學家對FFPE組織 檢查的解釋被認為是臨床決策制定中的關鍵一欄。在許多國家，病理學家是乳腺癌管理決 策中所謂病例研討會的主要部分。盡管IHC可在集中設施中容易地進行，檢查病理學家的個 人見解和經驗在個體病例決策中非常重要。
[0006] 然而，數項研究已證實，在多達40 %的免疫組織化學結果中存在明顯的觀察者間 差異和技術差異。此外，免疫組織化學僅允許定性，或在一些情況下半定量陳述關于各自的 受體狀態。
[0007] 因此，需要可靠客觀的定量和可重復的用于腫瘤如乳腺腫瘤的分子亞型分型的檢 測系統，其有助于選擇合適的腫瘤治療方案（患者分類），并允許預后和預測治療成功以及 評估患者的遠處轉移風險。此外，這樣的檢測系統應當允許進行適合大部分癌癥患者的分 散檢測。
[0008] 發明概述
[0009] 在一個方面，本發明涉及鑒定癌癥患者中腫瘤的分子亞型的體外方法，所述方法 包括以下步驟：
[0010] (a)確定所述腫瘤的樣本中人表皮生長因子受體2(HER2)的RNA轉錄本的表達水 平；
[0011] (b)確定所述腫瘤的樣本中雌激素受體(ESRl)的RNA轉錄本的表達水平；
[0012] (c)確定所述腫瘤的樣本中孕酮受體(PGR)的RNA轉錄本的表達水平;和
[0013] (d)確定所述腫瘤的樣本中增殖抗原Ki-67(Ki67)的RNA轉錄本的表達水平;和/或
[0014] (e)確定所述腫瘤的樣本中RacGTP酶激活蛋白l(RACGAPl)的RNA轉錄本的表達水 平。
[0015] 在一個實施方案中，確定HER2、ESR1、PGR和Ki67和/或RACGAP1的RNA轉錄本的表達 水平包括確定HER2、ESR1、PGR和Ki67和/或RACGAP1的RNA轉錄本的表達水平是低于還是高 于HER2、ESR1、PGR和Ki67和/或RACGAP1的RNA轉錄本的設定表達閾值。
[0016] 在一個實施方案中，步驟(a)在步驟(b)、（c)和(d)和/或(e)之前進行。
[0017] 在一個實施方案中，步驟(d)和/或步驟(e)在步驟(a)、(b)和(c)之后進行。
[0018] 在一個實施方案中，步驟(a)在步驟(b)之前進行，步驟(b)在步驟(c)之前進行，且 步驟(c)在步驟(d)和/或步驟(e)之前進行。
[0019] 在一個實施方案中，所述分子亞型選自HER2-陽性、三陰性、管腔A(luminal A)型 和管腔B(luminal B)型。
[0020] 在一個實施方案中，比HER2的RNA轉錄本的設定表達閾值高的HER2的RNA轉錄本的 表達水平，將腫瘤的分子亞型鑒定為HER2-陽性的。
[0021] 在一個實施方案中，
[0022]-比HER2的RNA轉錄本的設定表達閾值低的HER2的RNA轉錄本的表達水平；
[0023]-比ESRl的RNA轉錄本的設定表達閾值低的ESRl的RNA轉錄本的表達水平；
[0024]-比PGR的RNA轉錄本的設定表達閾值低的PGR的RNA轉錄本的表達水平;和 [0025]-比Ki67的RNA轉錄本的設定表達閾值低或高的Ki67的RNA轉錄本的表達水平 [0026]將腫瘤的分子亞型鑒定為三陰性的。
[0027] 在一個實施方案中，所述分子亞型為管腔A(luminal A)型或管腔B(luminal B) 型。
[0028]在一個實施方案中，
[0029]-比HER2的RNA轉錄本的設定表達閾值低的HER2的RNA轉錄本的表達水平；
[0030]-比ESRl的RNA轉錄本的設定表達閾值高的ESRl的RNA轉錄本的表達水平；
[0031]-比PGR的RNA轉錄本的設定表達閾值高的PGR的RNA轉錄本的表達水平;和 [0032]-比Ki67的RNA轉錄本的設定表達閾值高的Ki67的RNA轉錄本的表達水平 [0033] 將腫瘤的分子亞型鑒定為管腔B(luminal B)型。
[0034]在一個實施方案中，
[0035]-比HER2的RNA轉錄本的設定表達閾值低的HER2的RNA轉錄本的表達水平；
[0036]-比ESRl的RNA轉錄本的設定表達閾值高的ESRl的RNA轉錄本的表達水平；
[0037]-比PGR的RNA轉錄本的設定表達閾值高的PGR的RNA轉錄本的表達水平;和 [0038]-比Ki67的RNA轉錄本的設定表達閾值低的Ki67的RNA轉錄本的表達水平 [0039] 將腫瘤的分子亞型鑒定為管腔A(luminal A)型。
[0040]在一個實施方案中，
[0041 ]-比HER2的RNA轉錄本的設定表達閾值低的HER2的RNA轉錄本的表達水平；
[0042]-比ESRl的RNA轉錄本的設定表達閾值高的ESRl的RNA轉錄本的表達水平；
[0043]-比PGR的RNA轉錄本的設定表達閾值低的PGR的RNA轉錄本的表達水平;和 [0044]-比Ki67的RNA轉錄本的設定表達閾值低或高的Ki67的RNA轉錄本的表達水平 [0045] 將腫瘤的分子亞型鑒定為管腔B(luminal B)型。
[0046]在一個實施方案中，
[0047]-比HER2的RNA轉錄本的設定表達閾值低的HER2的RNA轉錄本的表達水平；
[0048]-比ESRl的RNA轉錄本的設定表達閾值低的ESRl的RNA轉錄本的表達水平；
[0049]-比PGR的RNA轉錄本的設定表達閾值高的PGR的RNA轉錄本的表達水平;和 [0050]-比Ki67的RNA轉錄本的設定表達閾值高的Ki67的RNA轉錄本的表達水平 [0051 ] 將腫瘤的分子亞型鑒定為管腔B(luminal B)型。
[0052]在一個實施方案中，
[0053]-比HER2的RNA轉錄本的設定表達閾值低的HER2的RNA轉錄本的表達水平；
[0054]-比ESRl的RNA轉錄本的設定表達閾值低的ESRl的RNA轉錄本的表達水平；
[0055]-比PGR的RNA轉錄本的設定表達閾值高的PGR的RNA轉錄本的表達水平;和 [0056]-比Ki67的RNA轉錄本的設定表達閾值低的Ki67的RNA轉錄本的表達水平 [0057] 將腫瘤的分子亞型鑒定為管腔A(luminal A)型。
[0058]在一個實施方案中，
[0059]-比HER2的RNA轉錄本的設定表達閾值低的HER2的RNA轉錄本的表達水平；
[0060]-比ESRl的RNA轉錄本的設定表達閾值高的ESRl的RNA轉錄本的表達水平；
[0061 ]-比PGR的RNA轉錄本的設定表達閾值低的PGR的RNA轉錄本的表達水平;和 [0062]-比Ki67的RNA轉錄本的設定表達閾值高的Ki67的RNA轉錄本的表達水平 [0063] 將腫瘤的分子亞型鑒定為管腔B(luminal B)型。
[0064] 在一個實施方案中，所述管腔A型分子亞型與治療后無遠處復發存活5年的幾率相 關，該幾率比與管腔B型分子亞型相關的治療后無遠處復發存活5年的幾率高至少11%，優 選至少13%，和/或所述管腔A型分子亞型與治療后存活5年的幾率相關，該幾率比與管腔B 型分子亞型相關的治療后存活5年的幾率高至少7%，優選至少9%。
[0065] 在一個實施方案中，所述方法包括步驟(d)，并且
[0066]-比ESRl的RNA轉錄本的設定表達閾值高的ESRl的RNA轉錄本的表達水平 [0067]-比Ki67的RNA轉錄本的設定表達閾值高的Ki67的RNA轉錄本的表達水平
[0068] 指示癌癥患者不良臨床結果的風險增加，特別是遠處轉移的風險增加。
[0069] 在一個實施方案中，所述方法包括步驟(e)，并且比RACGAP1的RNA轉錄本的設定表 達閾值高的RACGAP1的RNA轉錄本的表達水平，指示癌癥患者的不良臨床結果的風險增加。
[0070] 在一個實施方案中，所述方法包括步驟(d)和(e)，并且
[0071]-比Ki67的RNA轉錄本的設定表達閾值低的Ki67的RNA轉錄本的表達水平，和
[0072] -比RACGAP1的RNA轉錄本的設定表達閾值高的RACGAP1的RNA轉錄本的表達水平
[0073] 指示癌癥患者不良臨床結果的風險增加。
[0074] 在一個實施方案中，所述方法包括步驟(d)和(e)，并且
[0075]-比Ki67的RNA轉錄本的設定表達閾值高的Ki67的RNA轉錄本的表達水平，和
[0076] -比RACGAP1的RNA轉錄本的設定的表達閾值高的RACGAP1的RNA轉錄本的表達水平
[0077] 指示癌癥患者不良臨床結果的風險進一步增加。
[0078] 在一個實施方案中，不良臨床結果包括存活期、無復發存活期和無遠處復發存活 期中的一種或多種的相對減少。
[0079] 在一個實施方案中，所述腫瘤為實體瘤。
[0080] 在一個實施方案中，所述腫瘤為乳腺腫瘤或來源于乳腺腫瘤。
[0081] 在一個實施方案中，所述癌癥為乳腺癌。
[0082] 在一個實施方案中，所述樣本為提取自腫瘤的RNA。
[0083]在一個實施方案中，RNA轉錄本的表達水平通過逆轉錄(RT)定量PCR來確定。
[0084]在一個實施方案中，所述定量PCR為基于熒光的定量實時PCR。
[0085]在一個實施方案中，所述方法包括使用ESRl特異性的引物，和/或HER2特異性的引 物，和/或Ki67特異性的引物，和/或PGR特異性的引物，和/或RACGAP1特異性的引物，其中所 述ESRl特異性的引物具有15至30個核苷酸的長度且包含SEQ ID NO: 1和2的序列的至少10 個連續的核苷酸，所述HER2特異性的引物具有15至30個核苷酸的長度且包含SEQ ID N0:4 和5的序列的至少10個連續的核苷酸，所述Ki67特異性的引物具有15至30個核苷酸的長度 且包含SEQ ID NO:7和8的序列的至少10個連續的核苷酸，所述PGR特異性的引物具有15至 30個核苷酸的長度且包含SEQ ID NO: 10和11的序列的至少10個連續的核苷酸，所述 RACGAP1特異性的引物具有15至30個核苷酸的長度且包含SEQ ID NO: 13和14的序列的至少 10個連續的核苷酸。
[0086]在一個實施方案中，所述方法包括使用ESRl特異性的探針，和/或HER2特異性的探 針，和/或Ki67特異性的探針，和/或PGR特異性的探針，和/或RACGAP1特異性的探針，其中所 述ESRl特異性的探針具有20至35個核苷酸的長度且包含SEQ ID N0:3的序列的至少15個連 續的核苷酸，所述HER2特異性的探針具有20至35個核苷酸的長度且包含SEQ ID N0:6的序 列的至少15個連續的核苷酸，所述Ki67特異性的探針具有20至35個核苷酸的長度且包含 SEQ ID N0:9的序列的至少15個連續的核苷酸，所述PGR特異性的探針具有20至35個核苷酸 的長度且包含SEQ ID NO: 12的序列的至少15個連續的核苷酸，所述RACGAP1特異性的探針 具有20至35個核苷酸的長度且包含SEQ ID NO: 15的序列的至少15個連續的核苷酸。
[0087]在一個實施方案中，將所述表達水平針對腫瘤樣本中一個或多個參照基因的（平 均)表達水平進行標準化。
[0088] 在一個實施方案中，所述一個或多個參照基因選自CALM2、B2M、RPL37A、GUSB、 HPRTl和GAPDH。
[0089] 在其他方面，本發明涉及將癌癥患者分類以進行腫瘤治療的方法，所述方法包括， 第一步，使用如上文所述的體外方法鑒定癌癥患者腫瘤的分子亞型，和第二步，基于通過所 述體外方法鑒定的分子亞型來選擇腫瘤治療方案。
[0090] 在一個實施方案中，所述分子亞型選自HER2-陽性、三陰性、管腔A(luminal A)型 和管腔B(luminal B)型。
[0091] 在一個實施方案中，
[0092]-所述分子亞型為HER2-陽性的，且所述腫瘤治療方案包括施用抗HER2抗體和化療 劑；
[0093]-所述分子亞型為三陰性的，且所述腫瘤治療方案包括施用化療劑；
[0094]-所述分子亞型為管腔A(luminal A)型，且所述腫瘤治療方案包括內分泌療法;或 [0095]-所述分子亞型為管腔B(luminal B)型，且所述腫瘤治療方案包括內分泌療法和 任選地施用化療劑。
[0096] 在一個實施方案中，所述分子亞型為管腔B(luminal B)型，且所述腫瘤治療方案 包括施用化療劑。
[0097] 在一個實施方案中，所述分子亞型為管腔B(luminal B)型，且所述腫瘤治療方案 包括施用紫杉烷，優選多西他賽。
[0098] 在一個實施方案中，所述紫杉烷聯合氟尿嘧啶、表柔比星和環磷酰胺(FEC)施用。
[0099] 在一個實施方案中，所述腫瘤為實體瘤。
[0100] 在一個實施方案中，所述腫瘤為乳腺腫瘤或來源于乳腺腫瘤。
[0101] 在一個實施方案中，所述癌癥為乳腺癌。
[0102] 在其他方面，本發明涉及治療癌癥的方法，所述方法包括，第一步，使用上文所述 的體外方法將癌癥患者分類以進行腫瘤治療，和第二步，向癌癥患者提供選擇的腫瘤治療 方案。
[0103] 在其他方面，本發明涉及用于通過逆轉錄(RT)定量PCR的方法來鑒定癌癥患者腫 瘤的分子亞型的試劑盒，所述試劑盒包含：
[0104] -至少一對HER2特異性的引物和至少一種HER2特異性的探針；
[0105]-至少一對ESRl特異性的引物和至少一種ESRl特異性的探針；
[0106]-至少一對PGR特異性的引物和至少一種PGR特異性的探針;和 [0107]-至少一對Ki67特異性的引物和至少一種Ki67特異性的探針;和/或
[0108] -至少一對RACGAP1特異性的引物和至少一種RACGAP1特異性的探針。
[0109] 在一個實施方案中，所述定量PCR為基于熒光的定量實時PCR。
[0110] 在一個實施方案中，所述探針的檢測基于擴增介導的探針置換。
[0111] 在一個實施方案中，所述探針為雙標記探針，其包含熒光報告基團和熒光淬滅基 團。
[0112] 在一個實施方案中，所述試劑盒還包含逆轉錄酶和DNA聚合酶。
[0113] 在一個實施方案中，所述逆轉錄酶和聚合酶以酶混合物的形式提供，這允許一步 法逆轉錄(RT)定量PCR。
[0114] 在一個實施方案中，所述試劑盒還包含至少一對參照基因特異性的引物和至少一 種參照基因特異性的探針。
[0115] 在一個實施方案中，所述參照基因為選自以下基因中的一種或多種:CALM2、B2M、 RPL3 7A、GUSB、HPRT1和GAPDH。
[0116] 在一個實施方案中，所述試劑盒還包含至少一種對照RNA樣本。
[0117] 在一個實施方案中，所述引物提供小于120bp的擴增子大小。
[0118] 在一個實施方案中，所述ESRl特異性的引物具有15至30個核苷酸的長度且包含 SEQ ID NO: 1和2的序列的至少10個連續的核苷酸，和/或所述HER2特異性的引物具有15至 30個核苷酸的長度且包含SEQ ID NO: 4和5的序列的至少10個連續的核苷酸，和/或所述 Ki67特異性的引物具有15至30個核苷酸的長度且包含SEQ ID N0:7和8的序列的至少10個 連續的核苷酸，和/或所述PGR特異性的引物具有15至30個核苷酸的長度且包含SEQ ID NO: 10和11的序列的至少10個連續的核苷酸，和/或所述RACGAP1特異性的引物具有15至30個核 苷酸的長度且包含SEQ ID NO: 13和14的序列的至少10個連續的核苷酸。
[0119] 在一個實施方案中，所述ESRl特異性的探針具有20至35個核苷酸的長度且包含 SEQ ID NO:3的序列的至少15個連續的核苷酸，和/或所述HER2特異性的探針具有20至35個 核苷酸的長度且包含SEQ ID N0:6的序列的至少15個連續的核苷酸，和/或所述Ki67特異性 的探針具有20至35個核苷酸的長度且包含SEQ ID NO:9的序列的至少15個連續的核苷酸， 和/或所述PGR特異性的探針具有20至35個核苷酸的長度且包含SEQ ID NO: 12的序列的至 少15個連續的核苷酸，和/或所述RACGAP1特異性的探針具有20至35個核苷酸的長度且包含 SEQ ID NO: 15的序列的至少15個連續的核苷酸。
[0120] 在一個實施方案中，所述腫瘤為實體瘤。
[0121 ]在一個實施方案中，所述腫瘤為乳腺腫瘤或來源于乳腺腫瘤。
[0122] 在一個實施方案中，所述癌癥為乳腺癌。
[0123] 在另一方面，本發明涉及如上文所述的試劑盒在鑒定癌癥患者中腫瘤的分子亞型 中的應用。
[0124] 在另一方面，本發明涉及如上文所述的試劑盒在評估癌癥患者的遠處轉移風險中 的應用。
【附圖說明】
[0125] 圖1概述本發明的方法作為亞型分類的常規方法(例如，IHC)后備和作為患者分類 的常規方法補充的可能應用。
[0126] 圖2示出了評估HER2、ESR1、PGR、Ki67和RACGAPlmRNA的表達水平對于乳腺癌患者 的5年存活率的預后和預測價值的劃分檢驗。首先通過HER2 mRNA表達水平將來自855例腫 瘤的可用數據分類以鑒定HER2-陽性腫瘤U閾值38)。通過ESRlmRNA表達水平將HER2-陰性 腫瘤進一步分類。A:通過Ki67mRNA表達水平（閾值31.7)接著PGR mRNA表達水平（閾值30.2) 將ESRl-陽性腫瘤U閾值34)進一步分類。B:可選地，通過PGR mRNA表達水平（閾值30.2)接 著Ki67mRNA表達水平（閾值31.7)將ESRl-陽性腫瘤U閾值34)進一步分類。這些數據的 Kaplan-Meier分析在圖3和圖4中示出。C:通過RACGAPlmRNA表達水平（閾值34.2)將Ki67-陽 性和Ki67-陰性腫瘤分類。為了增加用于RACGAP1的進一步分析的患者數目，在圖中未給出 PGR的數據。PGR的進一步考慮并未改變關于RACGAP1的總體結果。數據(參見表3)顯示低于 或高于設定閾值的RACGAPlmRNA表達水平與5年存活率的特別顯著的差異相關。
[0127] 圖3示出了具有HER2-陽性