針對h7n9亞型禽流感病毒的全人源單克隆抗體及應用
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，具體涉及針對H7N9亞型禽流感病毒的全人源單克隆抗體、其抗原結合片段，和它們的應用。所述抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區中的互補決定區(CDR)特異性基因序列決定的，并在原核和真核細胞中獲得有效表達的特異性結合H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的抗體。利用此抗體CDR區或部分或全基因，可在原核和真核細胞及任何表達系統中改造和生產不同形式的基因工程抗體，可用于制備預防或治療H7N9亞型禽流感病毒相關疾病的制劑。
【專利說明】
針對H7N9亞型禽流感病毒的全人源單克隆抗體及應用
技術領域
:
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及針對H7N9亞型禽流感病毒的全人源單克隆抗體、其抗原結合片段，和它們的應用。【背景技術】:
[0002]據報道，禽流感病毒是感染鳥類的流感病毒，通常不會感染人類。然而，1997年我國香港首次報告了人類感染禽流感病例。這種高致病性禽流感病毒為H5N1亞型，截止 2013年12月10日已造成全球15個國家和地區共648例病例報告，其中384例死亡。隨后，H9N2等多個禽流感病毒亞型也相繼被發現具有感染人類的能力。特別是2013年3月， 我國上海和安徽兩地第一次發現人感染新型H7N9亞型禽流感病毒病例。目前H7N9疫情仍處于散發狀態，截止2014年10月2日已至少確診453例病例，其中175例死亡。病毒囊膜表面的跨膜糖蛋白血凝素蛋白(HA)和神經氨酸酶蛋白(NA)是流感病毒的主要免疫原性抗原。HA識別靶細胞表面受體并與受體相結合，具有與宿主細胞膜融合活性，能夠誘導機體產生保護性中和抗體。由于HA基因突變而引起的HA抗原變異往往會導致免疫失敗和變異毒株流行，流感病毒頻繁并且持續的發生抗原性變異，目前尚無有效的針對H7N9等新型禽流感病毒的疫苗，也沒有特效的治療藥物。作為一類新型特異性抗病毒感染的生物工程制劑， 抗體在抗感染治療及緊急被動免疫預防方面一直扮演著重要的角色。因此，研制特異性針對H7N9亞型禽流感病毒的抗體，用于緊急預防和治療是十分必要和可行的。
[0003]通過抗體分子基因水平的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源、人源化及全人源抗體，使對單克隆抗體的研究有了突破性進展并越來越顯示出其重要意義及實際應用前景。 上世紀80年代末90年代初興起的噬菌體抗體基因庫技術興起和整個基因工程抗體技術研究領域的發展，使當今世界全人源單克隆抗體及新結構抗體的開發研究取得很大進展并已由基礎研究階段步入實質性應用研究和開發階段。含有特異性抗體的人源或動物血清免疫球蛋白用以預防和治療傳染病已歷史悠久。而全人源單克隆抗體的發展，給這一領域的生物制品發展帶來了新的希望和遠大前景。單克隆抗體的體外抗病毒中和活性和體內保護機體抵抗病毒攻擊已獲得許多實驗證明，如抗甲肝病毒、漢坦病毒、RSV病毒、SARS病毒、亨尼帕病毒、埃博拉病毒等單克隆抗體可以在體內100%保護動物免受病毒攻擊(2)。我們相信特異性單克隆抗體，及其抗原結合片段，對人感染H7N9亞型禽流感應當具有良好的預防和治療效應。
[0004]因此，研發高效、特異性的抗H7N9亞型禽流感病毒的抗體意義重大。這些抗體可以用于人感染H7N9亞型禽流感的預防和治療。
[0005]與本發明相關的現有技術有:
[0006]1.Gao, R.et al.Human infect1n with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus.N Engl J Med 368, 1888-97 (2013).
[0007]2.Dimitrov, D.S.Therapeutic antibodies, vaccines and antibodyomes.MAbs 2, 347-56(2010).
[0008]3.Ying, T.et al.Except1nally potent neutralizat1n of Middle East respiratory syndrome coronavirus by human monoclonal antibodies.J Virol 88, 7796-805(2014).。
【發明內容】

[0009]本發明的目的是提供針對H7N9亞型禽流感病毒的全人源單克隆抗體及應用，具體涉及特異性結合H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的全人源單克隆抗體。本發明的全人源單克隆抗體包括克隆m826和克隆m827。
[0010]本發明還公開了所述抗體的抗原結合片段，雙特異性抗體，及與效應分子的偶聯物。本發明公開的抗體和組合物可以用于，比如說，人感染H7N9亞型禽流感的預防和治療。
[0011]在本發明的一些實施方式中，單克隆抗體，或抗原結合片段的輕鏈可變區的氨基酸序列和/或重鏈可變區的氨基酸序列，包含至少一個(比如三個)克隆m826或克隆m827 的輕鏈和/或重鏈可變區的互補決定區(CDR)。
[0012]本發明中，
[0013]m826輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0014]m826重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0015]m826輕鏈可變區CDR1的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示；
[0016]m826輕鏈可變區CDR2的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示；
[0017]m826輕鏈可變區CDR3的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示；
[0018]m826重鏈可變區CDR1的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示；
[0019]m826重鏈可變區CDR2的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示；
[0020]m826重鏈可變區CDR3的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示；
[0021]m827輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示；
[0022]m827重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示；
[0023]m827輕鏈可變區CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
[0024]m827輕鏈可變區CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示；
[0025]m827輕鏈可變區CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示；
[0026]m827重鏈可變區CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；
[0027]m827重鏈可變區CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示；
[0028]m827重鏈可變區CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0029]此外，本發明還公開了編碼這些單克隆抗體，抗原結合片段，雙特異性抗體，及偶聯物的核酸。在本發明的一些實施方案中，公開了包含這些核酸的載體，及包含這些載體的宿主細胞。在進一步的實施方案中，公開了包含這些單克隆抗體，抗原結合片段，雙特異性抗體，偶聯物，核酸，和載體的藥用組合物。
[0030]在本發明其它實施方案中，所述的單克隆抗體，抗原結合片段，雙特異性抗體，偶聯物，核酸，和載體被用來檢測，預防，或治療H7N9亞型禽流感。
[0031]更具體的，本發明提供了一種全人源單克隆抗體，或抗原結合片段，其特征在于， 其包含:抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO: 1的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸，及抗體的重鏈可變區含有SEQ ID N0:2的26-33位，51-58位，和/或97-110位氨基酸；或抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO:9的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸殘基， 及抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO: 10的26-33位，51-58位，和/或97-110位氨基酸殘基，其中，所述的單克隆抗體或抗原結合片段特異性結合H7N9亞型禽流感病毒。
[0032]本發明中，所述的單克隆抗體或抗原結合片段，其包含:抗體的輕鏈可變區含有 SEQ ID NO: 1的27-32位，50-52位，和89-97位氨基酸，及抗體的重鏈可變區含有SEQ ID N0:2的26-33位，51-58位，和97-110位氨基酸；或抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID N0:9 的27-32位，50-52位，和89-97位氨基酸殘基，及抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO: 10的 26-33位，51-58位，和97-110位氨基酸殘基。
[0033]本發明中，所述的單克隆抗體或抗原結合片段，其中:所述的輕鏈可變區的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1具有至少90%的相同性，且所述的重鏈可變區的氨基酸序列與SEQ ID N0:2具有至少90%的相同性；或所述的輕鏈可變區的氨基酸序列與SEQ ID N0:9具有至少 90%的相同性，且所述的重鏈可變區的氨基酸序列與SEQ ID NO: 10具有至少90%的相同性。
[0034]本發明中，所述的單克隆抗體或抗原結合片段，其中的單克隆抗體或抗原結合片段是全人源的。
[0035]本發明中，單克隆抗體為IgG ;抗原結合片段是scFv, Fv, Fab或F(ab)2。
[0036]本發明提供了一種雙特異性抗體，其含有上述的單克隆抗體或抗原結合片段。
[0037]本發明中，上述的單克隆抗體或抗原結合片段，或雙特異性抗體，與一種效應分子偶聯；所述的偶聯物，其中的效應分子是可檢測標記；所述的可選自檢測標記是熒光標記， 放射性標記，親和素，生物素，或酶；其中的效應分子是毒素如綠膿桿菌外毒素，或化療劑；
[0038]本發明還提供了一種核酸分子，其編碼所述的單克隆抗體或抗原結合片段，所述的核酸分子，可操作地連接至啟動子。
[0039]本發明還提供了一種質粒，含有所述的核酸分子；所述的質粒是一種病毒質粒。
[0040]本發明還提供了一種宿主細胞，含有所述的質粒。
[0041]本發明還提供了一種在生物樣品中檢測H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的方法，其特征在于，其中:
[0042]含有生物樣品，所述的單克隆抗體或抗原結合片段，所述的雙特異性抗體，或所述的偶聯物，在足以形成免疫復合物的條件下，檢測免疫復合物的存在與否，其中免疫復合物的存在表示生物樣品中存在H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白；
[0043]所述的方法中，樣品來源于人類或來源于禽類。
[0044]本發明還提供了一種檢測受試者是否患有H7N9亞型禽流感的方法，其特征在于， 其中:
[0045]含有來源于疑似感染H7N9亞型禽流感的受試者的生物樣品，及有效劑量的所述的單克隆抗體或抗原結合片段，所述的雙特異性抗體，或所述的偶聯物，并檢測單克隆抗體，抗原結合片段，雙特異性抗體，或偶聯物的結合，其中單克隆抗體，抗原結合片段，雙特異性抗體，或偶聯物的結合相比陰性對照增加表示受試者患有H7N9亞型禽流感；
[0046]所述的方法中，陰性對照是一個參比標準，或單克隆抗體，抗原結合片段，雙特異性抗體，或偶聯物與來源于健康受試者的樣品的結合；其中的樣品選自血液，血清，血漿，痰液，或活檢樣品。
[0047]本發明還提供了一種藥用組合物，其含有有效預防劑量的所述的單克隆抗體或抗原結合片段，所述的雙特異性抗體，所述的偶聯物，所述的核酸，或所述的質粒，和一種藥學可接受載體。
[0048]本發明同時提供了一種藥用組合物，其含有有效治療劑量的所述的單克隆抗體或抗原結合片段，所述的雙特異性抗體，所述的偶聯物，所述的核酸，或所述的質粒，和一種藥學可接受載體。
[0049]本發明在國際上首次獲得了針對H7N9亞型禽流感病毒的全人源單克隆抗體，及其抗原結合片段。并經試驗表明，利用此抗體CDR區或部分或全基因，可在原核和真核細胞及任何表達系統中改造和生產不同形式的基因工程抗體，可用于制備在臨床上預防或治療 H7N9亞型禽流感病毒相關疾病的制劑。
[0050]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的范圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的范圍內。另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重復敘述過一樣。【附圖說明】
[0051]圖1.利用多克隆噬菌體ELISA檢測針對H7N9亞型禽流感病毒HA的抗體富集。
[0052]圖2.利用ELISA檢測特異性抗原結合片段(Fab)與H7N9亞型禽流感病毒HA的結合能力。
[0053]圖3.利用ELISA檢測特異性單克隆抗體(IgGl)與H7N9亞型禽流感病毒HA的結合能力。
[0054]圖4.m826抗體對H7N9亞型禽流感病毒中和能力的檢測。
[0055]圖5.m826抗體能夠有效的誘導抗體介導的細胞毒性(ADCC)作用。【具體實施方式】
[0056]實施例1
[0057]1)制備H7N9亞型禽流感病毒HA蛋白
[0058]將合成的H7N9亞型禽流感病毒HA基因(SH2)與IgGIFc融合到一起，插入到表達質粒中，將表達質粒瞬時轉染293FREESTYLE細胞，表達HA1 (SH2) -Fc蛋白并進行純化；用同樣的方法表達沒有IgGl Fc標簽的HA1蛋白，及三聚體形式的HA1蛋白；
[0059]2)篩選H7N9亞型禽流感病毒特異性抗原結合片段(Fab)[〇〇6〇] 使用利用40個健康志愿者的外周血單核細胞cDNA構建的大型噬菌體展示抗體文庫，針對生物素標記的HA1(SH2)-Fc蛋白，及商業化的HA-SH1、HA-SH2蛋白篩選抗體； 1012個噬菌體展示的Fab在常溫下于1，2, 3, 4輪分別與5, 3, 3, 1微克抗原孵育兩小時，將 HA1 (SH2)-Fc，HA-SH1，HA-SH2蛋白包被在ELISA板上，用多克隆噬菌體ELISA檢測抗體的富集；第1，2, 3, 4輪的噬菌體與包被的蛋白孵育，用抗噬菌體的HRP耦合抗體檢測噬菌體與蛋白的結合(如圖1所示)，多克隆噬菌體ELISA結果顯示，利用表達的HA1(SH2)-Fc蛋白作為抗原進行的抗體篩選，在第4輪篩選后得到了非常顯著的富集；利用商業化的HA-SH1、HA-SH2蛋白作為抗原進行的篩選，在第4輪篩選后得到一定富集，但程度遠弱于利用所述的表達的HA1 (SH2)-Fc蛋白作為抗原進行的篩選，因此，本發明中選用HA1 (SH2)-Fc蛋白第 3, 4輪篩選獲得的噬菌體，感染TG1細胞并隨機挑選克隆進行單克隆噬菌體ELISA，進一步進行測序鑒定富集的Fab ;
[0061]3)檢測特異性抗原結合片段(Fab)與H7N9亞型禽流感病毒HA的結合能力
[0062]根據測序結果選擇十個克隆，命名為m820-m829,它們的可溶性表達產物的制備基本按現有技術的方法進行；具體為:將含有克隆m820-m829的質粒轉入HB2151感受態細胞，從過夜生長的氨芐平皿中挑取單個菌落，接種SB細菌培養液，在30度IPTG誘導條件下表達10-12小時，收獲細菌并從中提取純化Fab ;將HA1 (SH2) -Fc，HA-SH1，HA-SH2蛋白包被在ELISA板上，加入梯度濃度稀釋的m820-m829 Fab孵育，用抗FLAG標簽抗體檢測Fab與 H7N9亞型禽流感病毒HA的結合能力(如圖2所示)，ELISA結果顯示，十個Fab克隆中有兩個不能結合HA，有八個能結合HA，其中有三個與HA結合能力較弱，另五個與HA結合能力很強，本發明從中挑選兩個結合能力最強的克隆，m826和m827,轉換成單克隆抗體IgGl的形式并進行進一步表征；
[0063]4)檢測單克隆抗體(IgGl)與H7N9亞型禽流感病毒HA的結合能力
[0064]按現有技術的方法進行Fab轉換成IgGl并進行表達純化，具體為:將Fab的輕鏈與重鏈可變區分別用PCR擴增，并插入到IgGl的表達載體中，構建成單克隆抗體表達載體， 將表達質粒瞬時轉染293 FREESTYLE細胞，表達IgGl并利用Protein G樹脂進行純化，將 HA蛋白包被在ELISA板上，加入梯度濃度稀釋的m820或m827 IgGl孵育，用抗IgGIFc標簽抗體檢測IgGl與H7N9亞型禽流感病毒HA的結合能力(如圖3所示)，ELISA結果顯示， 單克隆抗體m826和m827均能高親和力結合H7N9亞型禽流感病毒HA，親和力約為InM (如圖3左所示)，單克隆抗體m826能特異性結合H7N9和H7N7亞型禽流感病毒HA，而不結合 H1N1和H3N2亞型禽流感病毒HA(如圖3右所示)，作為陰性對照的無關抗體ml02.4不結合任一種禽流感病毒HA ;
[0065]5)檢測m826抗體對H7N9亞型禽流感病毒中和能力
[0066]將H7N9亞型禽流感病毒HA蛋白，NA蛋白，和表達熒光素酶作為報告基因缺陷的 HIV-1基因，共同轉染293T細胞，包裝H7N9亞型禽流感假病毒；將m826和無關抗體m610.27 梯度稀釋，與假病毒一起感染MDCK細胞，孵育后檢測細胞裂解液luciferase ;初步結果如圖4所示，m826抗體與對照抗體m610.27相比，能夠中和H7N9亞型禽流感假病毒；
[0067]6)m826誘導抗體介導的細胞毒性(ADCC)作用實驗
[0068]將25微升的H9/IIIB(2.5X 104個)細胞鋪至96孔板，然后將m826，m827和無關抗體M梯度稀釋，加入到表達H7N9亞型禽流感病毒HA的H9/IIIB細胞中(50 y 1)，然后將 ADCC效應細胞(promega) 25微升(1.5X 105個)加入到H9/IIIB中，37度溫育24h后測其 luciferase，結果如圖5所示，m826抗體能有效誘導抗體介導的ADCC作用。
【主權項】
1.一種全人源單克隆抗體，或抗原結合片段，其特征在于，其包含:抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO: 1的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸，及 抗體的重鏈可變區含有SEQ ID N0:2的26-33位，51-58位，和/或97-110位氨基酸；或 抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO:9的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸殘 基，及抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO: 10的26-33位，51-58位，和/或97-110位氨基酸 殘基，其中，所述的單克隆抗體或抗原結合片段特異性結合H7N9亞型禽流感病毒。2.按權利要求1所述的單克隆抗體或抗原結合片段，其特征在于，其包含:抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO: 1的27-32位，50-52位，和89-97位氨基酸，及抗體 的重鏈可變區含有SEQ ID NO: 2的26-33位，51-58位，和97-110位氨基酸；或抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO: 9的27-32位，50-52位，和89-97位氨基酸殘基，及 抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO: 10的26-33位，51-58位，和97-110位氨基酸殘基。3.按權利要求1或2所述的單克隆抗體或抗原結合片段，其特征在于，其中:所述的輕鏈可變區的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1具有至少90%的相同性，且所述的重鏈可變區的氨基酸序列與SEQ ID N0:2具有至少90%的相同性；或所述的輕鏈可變區的氨基酸序列與SEQ ID N0:9具有至少90%的相同性，且所述的重 鏈可變區的氨基酸序列與SEQ ID NO: 10具有至少90%的相同性。4.按權利要求1-3中任一項所述的單克隆抗體或抗原結合片段，其特征在于，其中的 單克隆抗體或抗原結合片段是全人源的。5.按權利要求1-4中任一項所述的單克隆抗體或抗原結合片段，其特征在于，其中的 單克隆抗體為IgG。6.權利要求1-4中任一項所述的單克隆抗體或抗原結合片段，其特征在于，其中抗原 結合片段是scFv, Fv, Fab或F (ab) 2。7.—種雙特異性抗體，含有權利要求1-6中任一項所述的單克隆抗體或抗原結合片段。8.權利要求1-6中任一項所述的單克隆抗體或抗原結合片段，或權利要求7所述的雙 特異性抗體，與一種效應分子偶聯。9.權利要求8所述的偶聯物，其中的效應分子是可檢測標記。10.權利要求9所述的偶聯物，其中的可檢測標記是熒光標記，放射性標記，親和素，生 物素，或酶。11.權利要求8所述的偶聯物，其中的效應分子是毒素或化療劑。12.權利要求11所述的偶聯物，其中的毒素是綠膿桿菌外毒素。13.—種核酸分子，其編碼權利要求1-6中任一項所述的單克隆抗體或抗原結合片段， 權利要求7所述的雙特異性抗體，或權利要求8-12中任一項所述的偶聯物。14.權利要求13所述的核酸分子，可操作地連接至啟動子。15.—種質粒，含有權利要求13或權利要求14所述的核酸分子。16.權利要求15所述的質粒，其中質粒是一種病毒質粒。17.—種宿主細胞，含有權利要求15或權利要求16所述的質粒。18.—種在生物樣品中檢測H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的方法，其特征在于，其中:含有生物樣品，及權利要求1-6中任一項所述的單克隆抗體或抗原結合片段，權利要 求7所述的雙特異性抗體，或權利要求8-12中任一項所述的偶聯物，在足以形成免疫復 合物的條件下，檢測免疫復合物的存在與否，其中免疫復合物的存在表示生物樣品中存在 H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白。19.按權利要求18所述的方法，其特征在于，其中樣品來源于人類。20.按權利要求18所述的方法，其特征在于，其中樣品來源于禽類。21.—種檢測受試者是否患有H7N9亞型禽流感的方法，其特征在于，其中:含有來源于疑似感染H7N9亞型禽流感的受試者的生物樣品，及有效劑量的權利要求 1-6中任一項所述的單克隆抗體或抗原結合片段，權利要求7所述的雙特異性抗體，或權利 要求8-12中任一項所述的偶聯物，并檢測單克隆抗體，抗原結合片段，雙特異性抗體，或偶 聯物的結合，其中單克隆抗體，抗原結合片段，雙特異性抗體，或偶聯物的結合相比陰性對 照增加表示受試者患有H7N9亞型禽流感。22.按權利要求21所述的方法，其特征在于，其中陰性對照是一個參比標準，或單克隆 抗體，抗原結合片段，雙特異性抗體，或偶聯物與來源于健康受試者的樣品的結合。23.按權利要求21或權利要求22所述的方法，其特征在于，其中的樣品選自血液，血 清，血漿，痰液，或活檢樣品。24.—種藥用組合物，其特征在于，含有有效預防劑量的權利要求1-6中任一項所述的 單克隆抗體或抗原結合片段，權利要求7所述的雙特異性抗體，權利要求8-12中任一項所 述的偶聯物，權利要求13-14中任一項所述的核酸，或權利要求15-16中任一項所述的質 粒，和一種藥學可接受載體。25.—種藥用組合物，其特征在于，含有有效治療劑量的權利要求1-6中任一項所述的 單克隆抗體或抗原結合片段，權利要求7所述的雙特異性抗體，權利要求8-12中任一項所 述的偶聯物，權利要求13-14中任一項所述的核酸，或權利要求15-16中任一項所述的質 粒，和一種藥學可接受載體。
【文檔編號】C12N15/85GK105985433SQ201510064906
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月9日
【發明人】應天雷, 姜世勃, 陸路, 賀彪, 孫志武
【申請人】復旦大學