一種凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWDi、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法
【專利摘要】本發明涉及一種凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWDi、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法。通過模板制備、引物設計、PCR擴增、公司測序過程，獲得了該基因的完整cDNA序列，Lv-SWDi基因的核苷酸序列具有421bp，編碼的氨基酸序列具有92個氨基酸殘基。研究凡納對蝦Lv-SWDi基因有助于進一步完善無脊椎動物先天免疫防御機制的基礎理論，而且，體外重組表達的凡納對蝦rLv-SWDi蛋白質在食品抗菌劑以及抗菌藥品研制方面，具有較大的應用前景。
【專利說明】—種凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWD1、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWD1、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法，屬于分子生物學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]在動物進化過程中，隨著外界環境中病原細菌和病毒等微生物的不斷刺激造成的各種挑戰，動物自身的免疫系統也在不斷進化，從而能夠使物種進化、延續到今天。到目前為止，依據動物體所處進化地位的高低，已經形成了兩大類免疫系統，一類是先天免疫系統，另一類是獲得性免疫系統。先天免疫系統主要存在于無脊椎動物體內，然而，獲得性免疫系統主要存在于高等的脊椎動物體內，而且，高等的脊椎動物體內仍然存在先天免疫。
[0003]對于甲殼類動物來說，先天免疫系統是它們防御細菌、真菌、病毒侵染的唯一防線，尤其是細胞免疫和體液免疫兩種免疫方式，它們和甲殼類動物自身的物理屏障共同擔負著所有的免疫防御功能。先天免疫系統中的細胞免疫和體液免疫，在防御病原入侵的過程中，幾乎是協同作用的，但是，也有些文獻報道稱在病原入侵的最初階段，主要是體液免疫起到了主要的免疫監視和防衛作用。體液免疫在發揮作用的過程中，受到了多種信號途徑的調節，包括目前研究的十分清楚的Toll途徑和IMD途徑，在這兩條信號途徑的末端存在著多種免疫效應分子來執行免疫防御功能。其中，抗菌肽分子是一類非常重要的能夠針對細菌和真菌的入侵發揮免疫效應的分子，而且，它也是甲殼類無脊椎動物與免疫反應相關的多種信號通路 的最終發揮清除作用的最主要的功能分子。目前，發現的抗菌肽分子種類繁多，其中有一類分子的結構比較典型，在其氨基酸序列中存在著一個乳清酸性蛋白結構域，簡稱WAP結構域，這個結構域的特點就是存在著由8個半胱氨酸殘基形成的4對二硫鍵。根據分子中存在的WAP結構域的個數，我們人為地將其分為具有單個WAP結構域的抗菌肽分子或者稱為SWD抗菌肽分子、具有雙WAP結構域的抗菌肽分子或者稱為DWD抗菌肽分子。
[0004]多數抗菌肽分子不僅可以在甲殼類動物體內發揮清除細菌、真菌的作用，也可以在體外行使抗菌功能以及蛋白酶活性抑制劑作用。因此，一旦將甲殼類動物內源性的抗菌肽進行體外表達與純化，這些蛋白質其在食品行業的抗菌方面就會具有非常廣闊的應用前景，它們可以成為良好的綠色無污染的食品抗菌制劑。此外，與目前我國醫療行業廣泛使用的抗生素、抗菌劑有著很大的不同，源于甲殼類動物的抗菌肽分子發揮抗菌作用的同時，不會引起耐藥性問題，因為抗菌肽分子發揮作用的過程是直接作用于細菌、真菌細胞壁的某一部位的氨基酸序列，從而引起細菌、真菌細胞壁某一部位的水解產生漏洞因而引起細菌、真菌細胞的內溶物外泄，使其死亡而被清除，所以，這類抗菌肽分子在醫藥行業也存在較大的應用前景。
[0005]凡納對蝦是上世紀九十年代由美國引進我國的一個蝦類品種，目前，在我國養殖規模非常大，是一類經濟價值較高的水產養殖動物。而且，這類蝦的優良的抗病品質，在養殖過程中發揮了巨大作用，使我國水產養殖業能夠良性發展。此外，凡納對蝦在科研研究方面也是一個十分典型的甲殼類模式生物，它的優良的抗菌和抗病毒品質一直是先天免疫相關研究人員重點追蹤的科學問題。凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWDi編碼的抗菌肽分子在動物體內先天免疫系統中是一類重要的免疫效應分子，尤其，Lv-SffDi抗菌肽分子的蛋白酶活性抑制劑作用在體外可以抑制細菌繁殖過程中產生的蛋白酶的活性，從而將細菌分泌蛋白酶水解環境中的有機物從而獲得可吸收的營養物質的途徑徹底切斷，將細菌活活餓死，而且這種蛋白酶活性抑制劑作用不存在專一性，Lv-SffDi抗菌肽分子的蛋白酶活性抑制劑作用具有廣泛的抑制效果，凡是細菌繁殖過程中產生的蛋白酶的活性都可以被徹底抑制，因而，具有光譜抑制作用。所以，SWD基因亞型Lv-SWDi編碼的凡納對蝦SWDi抗菌肽分子在食品抗菌、醫療抗生素方面具有良好的應用空間。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供一種凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWDi的核苷酸序列，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1，具有42 Ibp。
[0007]本發明的另一個目的在于提供一種凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWDi編碼的氨基酸序列，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2，具有92個氨基酸殘基。 [0008]同時，本發明還提供該凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWDi基因的克隆方法。
[0009]本發明所提供的SWD基因亞型Lv-SWDi來源于凡納對奸(Litopenaeusvannamei)，命名為Lv-SWDi基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1，具有421bp。
[0010]上述SWD基因亞型Lv-SWDi編碼的蛋白質來源于凡納對奸(Litopenaeusvannamei)，命名為Lv-SWDi蛋白質，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2，具有92個氨基酸殘基。
[0011]上述凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWDi的克隆方法，包括如下步驟:
[0012](I)選用凡納對蝦作為實驗材料，利用動物總RNA提取試劑盒提取多種組織的總RNA，獲得凡納對蝦各種組織的總RNA樣品；
[0013](2)以步驟(1)獲得的總RNA樣品作為模板，利用一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得凡納對蝦各個組織的cDNA樣品；
[0014](3)設計擴增凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWDi編碼區的前后引物Lv-SWD1-F和Lv-SffD1-R:
[0015]Lv-SffD1-F: 5' -TACTCAGAATTCATGGTGTCCATCAAGGCAGTTC-3'
[0016]Lv-SffD1-R:5/ -TACTCACTCGAGTTACCTTCCACTTCCGTAAG-3;
[0017]以步驟(2)中的凡納對蝦的各個組織的cDNA樣品作為模板，以Lv-SWD1-F和Lv-SffD1-R作為擴增反應的引物對，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性5min，94°C變性30s，58。。退火45s，72。。延伸30s，循環35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0018](4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoR I核酸內切酶和Xho I核酸內切酶的雙酶切處理，并且與經過EcoR I核酸內切酶和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的大腸桿菌pET_28a質粒載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態細胞之后，進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測序公司進行序列測定，獲得凡納對蝦SffD基因亞型Lv-SWDi的基因序列；
[0019](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學翻譯軟件進行氨基酸序列的翻譯，獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
[0020]本發明的優點:
[0021]本發明涉及一種凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWD1、其編碼的氨基酸序列以及克隆方法。該基因在凡納對蝦體內過量表達可以提高凡納對蝦先天免疫系統中SWDi抗菌肽蛋白的表達量，從而提聞凡納對ife下對抗生存的水體環境中病原細菌的能力，進一步可以提聞繁殖與生存能力。而且，體外重組表達的SWDi抗菌肽蛋白質，在食品與藥品抗菌劑方面也具有較大的應用前景。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的描述。
[0023]實施例1凡納對蝦肝胰腺組織中Lv-SWDi基因的核苷酸序列克隆。
[0024](I)選用凡納對蝦肝胰腺組織作為實驗材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進行總RNA的提取,獲得凡納對蝦肝胰腺組織的總RNA樣品；
[0025](2)以步驟(1)獲得的凡納對蝦肝胰腺組織的總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供 的一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得凡納對蝦肝胰腺組織的cDNA樣品；
[0026](3)設計擴增凡納對蝦Lv-SWDi基因編碼區的前后引物Lv-SWD1-F和Lv-SWD1-R:
[0027]Lv-SffD1-F:5/ -TACTCAGAATTCATGGTGTCCATCAAGGCAGTTC-3;
[0028]Lv-SffD1-R:5/ -TACTCACTCGAGTTACCTTCCACTTCCGTAAG-3'
[0029]以步驟(2)中的凡納對蝦肝胰腺組織的cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性3min，94°C變性30s，58°C退火45s，72°C延伸30s，循環35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0030](4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行切膠回收、純化，之后進行EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切處理，并且與經過EcoR I和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的大腸桿菌pET-28a表達載體16°C過夜12_14h連接，次日，轉化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態細胞之后，進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測序公司進行序列測定，獲得凡納對蝦肝胰腺組織中Lv-SWDi基因的核苷酸序列；
[0031](5)將步驟(4)獲得的Lv-SWDi基因核苷酸序列，利用分子生物學Expasy在線軟件(//au.expasy.0rg)進行氨基酸序列的翻譯,獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
[0032]實施例2凡納對蝦血細胞Lv-SWDi基因的核苷酸序列克隆
[0033](I)選用凡納對蝦作為實驗材料，利用凡納對蝦血淋巴抗凝劑作為佐劑，使用醫用注射器從凡納對蝦腹節中部抽取血淋巴組織液，3000rpm低速離心3min之后，收集血細胞沉淀，并且，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進行總RNA的提取，獲得凡納對蝦血細胞總RNA樣品；
[0034](2)以步驟(1)獲得的凡納對蝦血細胞總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得凡納對蝦血細胞cDNA樣品；
[0035](3)設計擴增凡納對蝦血細胞Lv-SWDi基因編碼區的前后引物Lv-SWD1-F和Lv-SffD1-R:
[0036]Lv-SffD1-F:5/ ~TACTCAGAATTCATGGTGTCCATCAAGGCAGTTC~3;
[0037]Lv-SffD1-R:5/ -TACTCACTCGAGTTACCTTCCACTTCCGTAAG-3;
[0038]以步驟(2)中的凡納對蝦血細胞cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性3min，94°C變性30s，58。。退火45s，72。。延伸30s，循環35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0039](4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoR I核酸內切酶和Xho I核酸內切酶的雙酶切處理，并且與經過EcoR I核酸內切酶和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的大腸桿菌pET-28a表達載體，在金屬浴中進行16°C過夜12-14h連接，次日，轉化大腸桿菌DH5ci克隆菌株感受態細胞之后，進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測序公司進行序列測定，獲得凡納對蝦血細胞Lv-SWDi基因的核苷酸序列；
[0040](5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學Expasy在線軟件(//au.expasy.0rg)進行氨基酸序列的翻譯,獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
[0041]實施例3凡納對蝦小腸Lv-SWDi基因的核苷酸序列克隆
[0042](I)選用凡納對蝦小腸作為實驗材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)動物總RNA快速抽提試劑盒進行總RNA的提取,獲得凡納對蝦小腸總RNA樣品；
[0043](2)以步驟( 1)獲得的凡納對蝦小腸總RNA樣品作為模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得凡納對蝦小腸cDNA樣品；
[0044](3 )設計擴增凡納對蝦小腸Lv-SWDi基因編碼區的前后引物Lv-SWD1-F和Lv-SffD1-R:
[0045]Lv-SffD1-F:5/ -TACTCAGAATTCATGGTGTCCATCAAGGCAGTTC-3'
[0046]Lv-SffD1-R:5/ -TACTCACTCGAGTTACCTTCCACTTCCGTAAG-3;
[0047]以步驟(2沖的凡納對蝦小腸cDNA樣品作為模板，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性3min，94°C變性30s，58。。退火45s，72。。延伸30s，循環35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物；
[0048](4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoR I核酸內切酶和Xho I核酸內切酶的雙酶切處理，并且與經過EcoR I核酸內切酶和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的大腸桿菌pET-28a表達載體，在金屬浴中進行16°C過夜12-14h連接，次日，轉化大腸桿菌DH5ci克隆菌株感受態細胞之后，進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測序公司進行序列測定，獲得凡納對蝦小腸Lv-SWDi基因的核苷酸序列；
[0049](5)將步驟(4)獲得的基因核苷酸序列，利用分子生物學Expasy在線軟件(//au.expasy.0rg)進行氨基酸序列的翻譯,獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
[0050]
【權利要求】
1.一種凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWDi，其特征在于，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
2.根據權利要求1所述的一種凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWDi，其特征在于，凡納對蝦SffD基因亞型Lv-SWDi編碼的蛋白質對應的氨基酸序列為SEQ ID N0.2。
3.一種凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWDi的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)選用凡納對蝦作為實驗材料，利用動物總RNA提取試劑盒提取多種組織的總RNA，獲得凡納對蝦各種組織的總RNA樣品； (2)以步驟(1)獲得的總RNA樣品作為模板，利用一步法RT-PCR擴增試劑盒進行cDNA的反轉錄合成，獲得凡納對蝦各個組織的cDNA樣品； (3 )設計擴增凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWDi編碼區的前后引物Lv-SWD1-F和Lv-SffD1-R:
Lv-SffD1-F:5/ -TACTCAGAATTCATGGTGTCCATCAAGGCAGTTC-3'
Lv-SffD1-R:5/ -TACTCACTCGAGTTACCTTCCACTTCCGTAAG-3' 以步驟(2)中的凡納對蝦的各個組織的cDNA樣品作為模板，以Lv-SWD1-F和Lv-SffD1-R作為擴增反應的引物對，進行PCR擴增反應，反應的程序為:94°C預變性5min，94°C變性30s，58°C退火30s，72。。延伸30s，循環35圈，后延伸5min，獲得PCR反應產物； (4)將步驟(3)獲得的PCR反應產物進行回收、純化，之后進行EcoRI核酸內切酶和Xho I核酸內切酶的雙酶切處理，并 且與經過EcoR I核酸內切酶和Xho I核酸內切酶雙酶切處理的大腸桿菌pET_28a質粒載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α克隆菌株感受態細胞之后，進行菌落PCR篩選，將篩選得到的陽性克隆子送測序公司進行序列測定，獲得凡納對蝦SWD基因亞型Lv-SWDi的基因序列。 (5)將步驟(4)獲得的基因序列，利用分子生物學翻譯軟件進行氨基酸序列的翻譯，獲得對應蛋白質的氨基酸序列。
【文檔編號】C07K14/435GK103981188SQ201310733006
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2013年12月27日 優先權日:2013年12月27日
【發明者】杜志強, 林濤, 吳燁 申請人:內蒙古科技大學