專利名稱：CSFV、PRRSV、PCV2與SIV H9亞型多重SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR引物及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種病毒的檢測方法，具體涉及CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亞型多重 SYBR Green I實時熒光PCR引物及其檢測方法。
背景技術：
豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)和豬圓環病毒2型(PCV2)都能夠不同程度的導致妊娠引起種豬不育，即公豬睪丸腫脹，精液質量下降，失去種用能力； 母豬表現為不發情，返情，不孕；妊娠母豬發生流產、早產、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔豬發病且導致大量死亡等，給養豬業造成了巨大的經濟損失。SIV能引起人獸共患病的發生和傳播，威脅人類安全。對這類傳染病的有效控制是保證人類公共安全和養豬業健康發展的關鍵因素之一。目前，國內外對以上三種病毒已經有大量的相關研究，建立了病毒分離、ELISA檢測方法、免疫組化法、免疫熒光法等方法，以及以分子生物學為基礎的檢測方法，如PCR、套式PCR和競爭PCR等。但這些方法都存在這樣那樣的缺點病毒分離耗時、原位雜交操作繁瑣等，PCR雖然有較高的特異性和敏感性，但容易出現假陰性結果，而且不能定量，往往漏檢隱性感染的動物，造成疾病的蔓延。TaqMan探針方法能夠定量，但成本較高，不利于推廣。 臨床上，這幾種病毒經常混合感染，靠分離病毒和抗體檢測來確診容易造成假陰性，而且操作繁瑣，對儀器的操作要求較高，所需時間長，亟需一種操作簡單、快速的檢測、準確率高的鑒別診斷方法。

發明內容
本發明要解決的技術問題是CSFV、PRRSV, PCV2及SIV H9亞型這幾種病毒常常以混合感染的形式出現，靠分離病毒和抗體檢測來確診容易造成假陰性，而且操作繁瑣，提供一種CSFV、PRRSV, PCV2及SIV H9亞型多重STOR Green I實時熒光PCR引物及其檢測方法。本發明的技術方案是CSFV、PRRSV, PCV2及SIV H9亞型多重SYBR Green I實時熒光PCR引物CSFV引物的序列如下上游引物P1 5 ‘ -AAACGGAGGGACTAGCCGT-3 ‘；下游引物P2 5 ‘ -TGCCATGTACAGCAGAGA-3 ‘；PRRSV引物的序列如下上游引物P3:5' -AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘；下游引物P4:5' -CCACAGTGTAACTTATCCTC-3 ‘；PCV2引物的序列如下上游引物P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘；
下游引物P6:5' -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3‘；SIV H9亞型引物的序列如下上游引物P7 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘；下游引物P8 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘。所述引物檢測CSFV、PRRSV, PCV2及SIV H9亞型的多重STOR Green I實時熒光 PCR檢測方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I實時熒光PCR反應體系和反應條件對病毒進行檢測，所述STOR Green I實時熒光PCR反應體系，在25 μ 1體系中加入
以下成份
SYBR PreMix(5U/uL)16 μL
P1/P3/P5/P70.5+ 0.5+0.5+0.5μ
Ρ2^4/Ρ6/Ρ80.5+0.5+0.5+0.5μ
DNA1+ 1+1+1 μ
ddH201 μL
25 μL所述反應條件為95°C預變性60s ；進入循環，95°C變性15s ；58°C退火20s ；72°C 延伸20s，40個循環，反應結束后先加熱至95°C，然后再降至65°C，開始以0. 5°C /sec遞增至95°C檢測熒光信號得出擴增產物的熔解曲線。本發明的有益效果是本發明分別設計擴增CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亞型的特異性引物，通過四重STOR Green I實時定量PCR檢測方法，能夠同時檢測CSFV、PRRSV、 PCV2、SIV H9亞型。利用TM值來區分不同的核酸片段，核酸片段的TM值主要與GC含量、 序列長度和結構有關(Ririe K M et al，1997)。CSFV的擴增片段基因序列長252bp，其TM 值在89°C左右；PRRSV的擴增片段基因序列長208bp，其TM值在86. 5°C左右；PCV2擴增片段長171bp，TM值在85°C以下；SIV H9亞型的擴增片段為209bp，GC含量相對最高，TM值達到92°C以上，CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亞型的TM值可以很好的區分。在本發明中，CSFV擴增片段的TM值、PCV2擴增片段的TM值和PRV擴增片段的TM 值會在一定的溫度范圍變動，CSFV的TM值變化范圍為89. 2-89. 5°C,PRRSV的TM值變化范圍為86. 6-86. 8°C, PCV2的TM值變化范圍為84. 5-84. 7°C，SIV H9亞型的TM值變化范圍為92. 2-92. 3°C，4種病毒的TM值相差較大，借此可以利用熔解曲線的4個特異性的峰對這 4種病毒進行鑒別與診斷。本發明的敏感性表明，CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型同時檢出的極限拷貝數分別為173拷貝/ μ L，196拷貝/ μ L，203拷貝/ μ L，211拷貝/ μ L。本發明的特異性試驗結果良好，只出現4個特異性的峰值，重復性試驗具有很好的穩定性并且本試驗的最大優勢在于能夠同時檢測CSFV、SIV H9亞型、PCV2和PRRSV 4種DNA病毒，有利于妊娠母豬繁殖障礙性病毒的鑒別與診斷。本發明建立了檢測CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型多重SYBR Green I熒光定量 PCR方法，具有較好的特異性、重復性和敏感性，為CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型的檢測提供了一種新的方法，可作為規模化豬場CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型的凈化檢測方法，建立無CSFV、I3RRSV、PCV2和SIV H9亞型的豬群，同時也為CSFV、I3RRSV、PCV2和SIV H9 亞型感染的分子流行病學調查，研究CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型分子發病機理，CSFV、 PRRSV、PCV2和SIV H9亞型早期診斷，診斷試劑盒的研制與開發，藥物或疫苗的免疫機制提供了試驗依據和技術手段。


圖1是CSFV部分基因質粒PCR鑒定結果，M. DL 2000Marker, 1.陰性對照，2.目的片段；圖2是PRRSV部分基因質粒PCR鑒定結果，M. DL 2000Marker, 1.陰性對照，2.目的片段；圖3是PCV2部分基因質粒PCR鑒定結果，M. DL 2000Marker, 1.陰性對照，2.目的片段；圖4是SIV H9亞型部分基因質粒PCR鑒定結果；圖5是復合STOR Green I熒光定量PCR反應溶解曲線分析；圖6是多重STOR Green I熒光定量PCR反應特異性試驗熔解曲線分析；圖7是復合STOR Green I熒光定量PCR反應同濃度重復性試驗熔解曲線分析；圖8是不同濃度重復性試驗熔解曲線分析；圖9是不同濃度重復性試驗熔解曲線分析；圖10是不同濃度重復性試驗熔解曲線分析。
具體實施例方式CSFV、PRRSV、PCV2 及 SIV H9 亞型多重 SYBR Green I 實時熒光 PCR 引物CSFV引物的序列如下上游引物P1 5 ‘ -AAACGGAGGGACTAGCCGT-3 ‘；下游引物P2 5 ‘ -TGCCATGTACAGCAGAGA-3 ‘；PRRSV引物的序列如下上游引物P3 5 ‘ -AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘；下游引物P4:5' -CCACAGTGTAACTTATCCTC-3 ‘；PCV2引物的序列如下上游引物P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘；下游引物P6 5 ‘ -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3 ‘；SIV H9亞型引物的序列如下上游引物P7 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘；下游引物P8 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘。所述引物檢測CSFV、PRRSV, PCV2及SIV H9亞型的多重STOR Green I實時熒光 PCR檢測方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I實時熒光PCR反應體系和反應條件對病毒進行檢測，所述STOR Green I實時熒光PCR反應體系，在25 μ 1體系中加入SYBR PreMix(5U/uL) P1/P3/P5/P7
16 μL
以下成份，
P2/P4/P6/P8
ddH20
0.5+ 0.5+0.5+0.5μΙ> 0.5+0.5+0.5+0.5μ 1+ 1+1+1 μ 1 \iL 25 μL所述反應條件為95°C預變性60s ；進入循環，95°C變性15s ；58°C退火20s ；72°C 延伸20s，40個循環，反應結束后先加熱至95°C，然后再降至65°C，開始以0. 5°C /sec遞增至95°C檢測熒光信號得出擴增產物的熔解曲線。具體實驗操作如下1材料與方法1. 1 材料1.1.1毒株、菌株PRV、PPV標準毒株購自中國獸藥監察所；CSFV、SIV H9亞型、PRRSV、PCV2購自河南省動物性食品安全重點實驗室；DH5ci感受態細胞購自寶生物工程有限公司。1. 1. 2常用溶液及培養基LB液體培養基；氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)貯存液，100mg/mL ；IPTG液，濃度為lOOmg/mL ；X_gal，濃度為20mg/mL，保存于棕色瓶內或用鋁箔包裹的瓶內，以上溶液均貯存于-20°C備用。1. 1. 3主要儀器及試劑紫外凝膠成像系統購自美國ALPHA INN0TECH公司；Agilent Mx3005P型實時定量 PCR擴增儀購自美國安捷倫Mratagene公司、PTC-200型PCR儀購自美國MJ公司等。SYBR Premix Ex Taq II,EX TaqDNA 聚合酶、DNA marker DL2000 均購自大連寶生物工程有限公司；Protein K購自華美生物工程公司；T4 DNA連接酶、PGEM-T fesy質粒載體均購自!Iomega公司；DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術有限公司；質粒提取試劑盒購自北京博大泰克生物公司；RNA提取試劑盒購自上海捷瑞生物技術有限公司；反轉錄試劑盒購自美國MBI公司。1. 2 方法1.2. 1引物的設計和合成以 GenBank 公布 PRRSV 0RF7 基因為參照序列(GQ183803)，SIV (EF055887) H9 基因序列，PCV20RF2基因為參照序列(AF027217)，CSFV 5'端保守序列用Primer Premier 6.0 生物軟件分別設計一對特異性引物，引物的序列如表1所示。表1熒光PCR引物序列
權利要求
1.CSFV, PRRSV, PCV2及SIV H9亞型多重SYBR Green I實時熒光PCR引物，其特征在于CSFV引物的序列如下上游引物 P1 5 ‘ -AAACGGAGGGACTAGCCGT-3 ‘； 下游引物 P2 5 ‘ -TGCCATGTACAGCAGAGA-3 ‘； PRRSV引物的序列如下 上游引物 P3 5 ‘ -AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘； 下游引物 P4 5 ‘ -CCACAGTGTAACTTATCCTC-3 ‘； PCV2引物的序列如下上游引物 P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘； 下游引物 P6 5 ‘ -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3 ‘； SIV H9亞型引物的序列如下 上游引物 P7 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘； 下游引物 P8 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘。
2.利用權利要求1所述引物檢測CSFV、PRRSV,PCV2及SIV H9亞型的多重STOR Green I實時熒光PCR檢測方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I實時熒光 PCR反應體系和反應條件對病毒進行檢測，其特征在于所述STOR Green I實時熒光PCR反應體系，在25 μ 1體系中加入以下成份 SYBR PreMix(5U/uL)16 μιΡ1/Ρ3/Ρ5/Ρ70.5+0.5+0.5+0.5μ Ρ2^4/Ρ6/Ρ80.5+0.5+0.5+0.5μΕDNA1+ 1+1+1 μLddH201 pL25 μ ,所述反應條件為95°C預變性60s ；進入循環，95°C變性15s ；58°C退火20s ；72°C延伸 20s,40個循環，反應結束后先加熱至95°C，然后再降至65°C，開始以0. 5°C /sec遞增至 95°C檢測熒光信號得出擴增產物的熔解曲線。
全文摘要
本發明公開了一種CSFV、PRRSV、PCV2及SIV H9亞型多重SYBR Green I實時熒光PCR引物及其檢測方法，CSFV引物的序列如下上游引物P15′-AAACGGAGGGACTAGCCGT-3′；下游引物P25′-TGCCATGTACAGCAGAGA-3′；PRRSV引物的序列如下上游引物P35′-AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3′；下游引物P45′-CCACAGTGTAACTTATCCTC-3′；PCV2引物的序列如下上游引物P55′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；下游引物P65′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′；SIV H9亞型引物的序列如下上游引物P75′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′；下游引物P85′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′。本發明分別設計擴增CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亞型的特異性引物，通過四重SYBR Green Ⅰ實時定量PCR檢測方法，能夠同時檢測CSFV、PRRSV、PCV2、SIV H9亞型。有較好的特異性、重復性和敏感性，為CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型的檢測提供了一種新的方法，可作為規模化豬場CSFV、PRRSV、PCV2和SIVH9亞型的凈化檢測方法，建立無CSFV、PRRSV、PCV2和SIV H9亞型的豬群。
文檔編號C12Q1/68GK102373298SQ201110221749
公開日2012年3月14日 申請日期2011年8月4日 優先權日2011年8月4日
發明者崔保安, 彭新然, 王亞賓, 胡慧, 韓志濤, 魏戰勇 申請人:河南農業大學