一種快速檢測禽病病毒的檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于光譜學和分子診斷領域，特別涉及一種快速檢測禽病病毒的檢測試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)，俗稱亞洲雞瘟，可引起雞群腹瀉、呼吸困難及神經癥狀。禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)包括多個亞型，其中H5亞型禽流感病毒能夠引起禽群大量發病和死亡，被世界動物衛生組織列為A類傳染病，受到高度重視。積極監測和控制新城疫病毒和禽流感病毒在禽群中的傳播，不僅能夠減少養殖業的損失，還能在很大程度上降低禽流感病毒從禽群傳播給人的風險，有重要的公共衛生安全意義。
[0003]目前實驗室檢測手段主要有病原學檢測、病原血清學檢測、免疫分析方法和分子生物學檢測方法。病毒的分離鑒定是確診本病最確切、最具公信力的方法，但是實驗操作步驟較為冗雜，需時較;免疫分析方法中酶聯免疫吸附試驗技術，即ELISA，是目前抗原抗體檢測領域中，應用最為廣泛的免疫學檢測方法，具有較高的特異性和敏感性，但是價格較為昂貴；焚光定量RT-PCR(Reverse Transcript1n-Polymerase Chain React1n)技術具有高度的敏感性和特異性，并且可大大縮短對病毒的檢出時間，克服了常規血清學診斷方法中非特異性因素的干擾及敏感性問題，為早期快速診斷病毒提供了敏感、快速、實用的檢測方法，但是步驟較為復雜，需要提供相應的實驗室設備。因此亟待建立一種操作簡單，快速，靈敏，無損的高通量的檢測方法。
[0004]表面增強拉曼光譜散射(SurfaceEnhanced Raman Scattering,SERS)是指當某些分子吸附到具有納米粗超度的貴金屬表面時，在這些粗超得到的拉曼散射信號就會別增強上百萬倍，甚至更高。由此得到的光譜被稱為“表面增強拉曼光譜”。相比其他光譜而言，如熒光光譜，紅外光譜等，表面增強拉曼光譜具有靈敏度高、譜帶窄、抗光漂白、不受水的干擾等特點，并且能夠實現快速、實時、無損檢測，因此非常適用于生物醫學的研究。
【發明內容】
[0005]為克服現有的檢測技術需要昂貴的儀器配備專業技術人員的問題，本發明的首要目的在于提供一種快速檢測禽病病毒的檢測試劑盒。所述的檢測試劑盒采用表面增強拉曼光譜技術，提供有一種操作簡便、靈敏度高的檢測病毒的試劑盒。
[0006]本發明的另一目的在于提供上述試劑盒的檢測方法。
[0007]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種快速檢測禽病病毒的檢測試劑盒，包括金屬溶膠液，石英片和拉曼光譜儀。
[0008]所述的金屬溶膠液為金溶膠液或銀溶膠液。
[0009]所述的銀溶膠的制備方法如下:常溫下將2.5mL 1^moI/L AgNO3加入到75mL蒸餾水中，加入5mL of 10—2mol/L巰基乙酸；攪拌1min后滴入2.5mL10—2mol/L Nal，攪拌20min后，得到淺綠色的AgI溶膠，加入20mg NaBH4還原，繼續攪拌約lOmin，生成黃褐色銀溶膠，得到的是形狀均一的球形粒子，平均粒徑約35nm，濃度約為120yg/ mL。
[00?0]所述的石英片為波數范圍是700-2000cm—1無明顯拉曼峰的基底石英片；
[0011 ]所述的石英片亦可有玻璃片代替。
[0012]所述的拉曼光譜儀為SmartRaman 0cean5pro便攜式拉曼光譜儀。
[0013]所述的拉曼光譜儀檢測條件為:激光波長785nm，激光功率為15-120mW、積分時間為Ι-lOs、波數范圍是TOOjOOOcm—1。
[0014]應用上述試劑盒進行禽病病毒的檢測方法，包括以下步驟:
[0015]I)將待測樣品與金屬溶膠液以1:2?3:1比例混勻；
[0016]2)取2?5yL步驟I)混勻后的樣品滴石英片上，自然風干；
[0017]3 )對石英片上形成的圓點狀樣品進行拉曼檢測，拉曼儀器為SmartRamanOcean5pro便攜式拉曼光譜儀。測試的參數為:功率為15?120mW，積分時間為I?1s，激發波長為785nm;
[0018]4)記錄譜圖，通過主成分分析和線性判別分析對兩種病毒進行建模分類；
[0019]5)判斷結果。
[0020]上述檢測方法的檢測環境溫度在4?40°C。
[0021]上述病毒一般是內部具有核酸(DNA或RNA)，外面具有衣殼的蛋白，最外層具有囊膜或者無囊膜結構。
[0022]所述的禽病病毒包括新城疫病毒、禽流感病毒等其他禽類病毒。
[0023]本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:
[0024]本發明建立一種快速檢測禽病病毒的方法及檢測試劑盒。該方法易操作、特異性強，耗時短，能快速檢測出禽病病毒的拉曼光譜圖，經主成分分析和線性判別分析等化學計量方法可以明顯區分不同的禽病病毒，為快速檢測禽病病毒提供了光學譜圖的依據，具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0025]圖1是本發明的GM毒株與H5N6毒株的拉曼光譜結果圖。
[0026]圖2是本發明GM毒株和H5N6毒株拉曼光譜圖PCA-LDA(Principal componentsanalysis-linear discriminate analysis)二維處理圖。
[0027]圖3是本發明GM毒株和H5N6毒株拉曼光譜圖PCA_LDA(Principal componentsanalysis-linear discriminate analysis)三維處理圖。
【具體實施方式】
[0028]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0029]本發明使用的樣品為禽流感病毒H5N6毒株(A/Oriental Magpie-robin/Guangdong/SW8/2014(H5N6)，基因庫號:KT454936)、新城疫病毒GM毒株(基因庫號:DQ486859)，毒株由廣東省華南農業大學禽病教研室提供。
[0030]下述實施例中所用的材料、試劑等如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0031]實施例1
[0032]本發明提供了一種快速檢測禽病病毒的檢測試劑盒，包括金屬溶膠液，石英片和拉曼光譜儀。
[0033]所述的金屬溶膠液為銀溶膠液。
[0034]所述的銀溶膠的制備方法如下:常溫下將2.5mL 10—Vol/L AgNO3加入到75mL蒸