本發明涉及一種淋巴細胞亞型的檢測方法，尤其是一種通過流式細胞術檢測蛻膜淋巴細胞亞型的檢測方法、采用該方法的試劑盒及該試劑盒在反復自然流產的免疫學檢測中的應用。
背景技術：
：自然流產是早期妊娠最常見的并發癥。反復自然流產(recurrentmiscarriage,rm)是指兩次及兩次以上的自然流產，發病率占育齡婦女的1％-2％。目前rm的病因主要包括：親代或子代染色體異常、子宮解剖結構異常、內分泌紊亂、感染以及母體自體免疫，但仍有許多不明原因反復自然流產(unknownrecurrentmiscarriage,urm)的發病原因未知。母胎之間存在免疫耐受現象，這種免疫耐受的破壞被認為是rm的病因之一。免疫治療改善了一部分rm患者的妊娠結局，但薈萃分析顯示已有的免疫治療方案對于rm患者總體的妊娠結局沒有明顯的優勢。因此如何闡述母胎界面的免疫耐受現象成為提高rm患者妊娠結局的前提。在母胎免疫中，t淋巴細胞亞群失衡以及nk細胞(naturalkillercell,nk)介導的免疫反應被認為是rm的可能機制。成熟的t淋巴細胞表達cd3，并可按功能分為表達cd4的th細胞亞群(thelperlymphocyte,th)和表達cd8的tc細胞亞群(cytotoxictlymphocyte，tc)。th細胞亞群可以按其分泌的細胞因子分為th1、th2功能亞群。抗原和il-12介導th1亞群分化，分化后的th1主要分泌ifn-γ和tnf-α等1型細胞因子促進細胞免疫應答。th2細胞主要分泌il-4、il-5、il-13等2型細胞因子介導體液免疫。蛻膜nk細胞(dnk細胞)也可以分泌1型和2型細胞因子，其中蛻膜nk1細胞(dnk1細胞)主要分泌ifn-γ和tnf-α等1型細胞因子，蛻膜nk2細胞(dnk2細胞)主要分泌il-4、il-5、il-13等2型細胞因子。然而，dnk細胞不表達cd3，高表達cd56，不表達cd16，可以通過這三個表型與t淋巴細胞或外周血nk細胞鑒別。th1/th2和dnk1/dnk2的構成與rm存在相關性，因此可以通過檢測這些細胞的構成來反映rm母胎界面真實的免疫反應狀況，從而識別免疫病因的存在并指導下一步治療。目前主要通過流式細胞術的方法來檢測rm患者蛻膜淋巴細胞亞型。普通方法多采用三色或四色抗體組合分別檢測th和dnk細胞的亞型，一般采用2管4色抗體組合，如利用cd3、cd4、cd8和一個細胞因子的4色組合檢測th1和th2亞型，利用cd3、cd56、cd16和一個細胞因子的4色組合檢測dnk1和dnk2亞型，若要檢測更多亞型，則需要更多抗體組合，因此該方法需要對同一蛻膜組織的多份淋巴細胞樣品進行不同抗體組合的染色。這種方法消耗的抗體量較多，操作步驟以及工時多，反復使用多種抗體對患者進行全面的抗原分析，費用較高。同時對待檢測蛻膜淋巴細胞樣品的需求量較大，需要采集足夠量的蛻膜組織才能完成檢測，然而患者的蛻膜組織需要在無菌環境中通過手術獲取，經過分離得到的淋巴細胞數量有限。這些問題給rm患者蛻膜淋巴細胞亞型檢測帶來許多不便。技術實現要素：本發明的目的是提供一種蛻膜淋巴細胞亞型的檢測方法，其所需蛻膜淋巴細胞樣品較少，且操作簡單，節省抗體。本發明的另一個目的是提供一種檢測蛻膜淋巴細胞亞型的試劑盒，使用其檢測蛻膜淋巴細胞亞型時所需蛻膜淋巴細胞樣品較少，且操作簡單，節省抗體。本發明的還一個目的是提供檢測蛻膜淋巴細胞亞型的試劑盒在反復自然流產的免疫學檢測中的應用，使用該試劑盒檢測蛻膜淋巴細胞亞型時所需蛻膜淋巴細胞樣品較少，且操作簡單，節省抗體。本發明提供了一種蛻膜淋巴細胞亞型的檢測方法，其包括：用熒光標記的抗cd3抗體、熒光標記的抗cd4抗體、熒光標記的抗cd8抗體、熒光標記的抗cd56抗體、熒光標記的抗cd16抗體、熒光標記的抗ifn-γ抗體、熒光標記的抗il-4抗體、和fixableviabilitydye對同一份待檢測蛻膜淋巴細胞樣品進行熒光染色，得到染色后樣品；將染色后樣品經流式細胞術檢測，得到檢測數據；以及分析檢測數據。其中，熒光標記的抗cd3抗體、熒光標記的抗cd4抗體、熒光標記的抗cd8抗體、熒光標記的抗cd56抗體、熒光標記的抗cd16抗體、熒光標記的抗ifn-γ抗體、熒光標記的抗il-4抗體、和fixableviabilitydye在流式細胞術檢測時，可具有不同的發射光波長。本發明提供的蛻膜淋巴細胞亞型的檢測方法，僅需對同一份蛻膜淋巴細胞樣品進行針對cd3、cd4、cd8、cd56、cd16、ifn-γ和il-4的熒光染色及fixableviabilitydye染色，即可實現對蛻膜淋巴細胞多個亞型的分析，該方法所需蛻膜淋巴細胞樣品較少，節省抗體，且操作簡單。在蛻膜淋巴細胞亞型的檢測方法的另一種示意性實施方式中，還設置對照組和同型對照組。設置對照組的意義在于排除無關變量的影響，增加實驗結果的可信度和說服力；設置同型對照組的意義在于區別抗體染色過程中相同亞型所造成的背景信號影響。在蛻膜淋巴細胞亞型的檢測方法的再一種示意性實施方式中，熒光標記的抗cd3抗體、熒光標記的抗cd4抗體、熒光標記的抗cd8抗體、熒光標記的抗cd56抗體、熒光標記的抗cd16抗體、熒光標記的抗ifn-γ抗體、和熒光標記的抗il-4抗體的熒光標記依次為percp、apc、fitc、pe-vio770、vioblue、apc-vio770和pe；fixableviabilitydye為fixableviabilitydyeefluor506。在蛻膜淋巴細胞亞型的檢測方法的又一種示意性實施方式中，熒光染色的步驟包括：將待檢測蛻膜淋巴細胞樣品與熒光標記的抗cd3抗體、熒光標記的抗cd4抗體、熒光標記的抗cd8抗體、熒光標記的抗cd56抗體、熒光標記的抗cd16抗體、和fixableviabilitydye共孵育，得到中間樣a；對中間樣a進行細胞固定和透膜處理，得到中間樣b；以及將中間樣b與熒光標記的抗ifn-γ抗體和熒光標記的抗il-4抗體共孵育，得到染色后樣品。藉此可有效地對胞內及胞外細胞標志物進行熒光標記。在蛻膜淋巴細胞亞型的檢測方法的又一種示意性實施方式中，分析的方法包括：細胞標志cd3-cd56++cd16-ifn-γ+il-4-代表蛻膜nk1細胞亞群，細胞標志cd3-cd56++cd16-ifn-γ-il-4+代表蛻膜nk2細胞亞群，細胞標志cd3+cd56-cd4+cd8-ifn-γ+il-4-代表th1細胞亞群，細胞標志cd3+cd56-cd4+cd8-ifn-γ-il-4+代表th2細胞亞群，細胞標志cd3+cd56-cd4-cd8+ifn-γ+il-4-代表tc1細胞亞群，細胞標志cd3+cd56-cd4-cd8+ifn-γ-il-4+代表tc2細胞亞群，細胞標志cd3+cd56+ifn-γ+il-4-代表nkt1-like細胞亞群，細胞標志cd3+cd56+ifn-γ-il-4+代表nkt2-like細胞亞群。在蛻膜淋巴細胞亞型的檢測方法的又一種示意性實施方式中，分析的方法包括：a.建立fsc/fixableviabilitydye密度圖，將在偽彩圖顯示模式下最靠近右下方的細胞群落設門標記為p1；b.對p1內細胞依次通過ssc-h/ssc-w和fsc-h/fsc-w設門去除粘連體；c.對去除粘連體后的細胞群以cd3/cd56十字門設門；d.對cd3-cd56+細胞群以cd56/cd16設門，對cd56++cd16-細胞群經橢圓門設門，所得細胞群為蛻膜nk細胞亞群；e.對cd3+cd56-細胞群以cd4/cd8十字門設門，所得cd4+cd8-細胞群為th細胞亞群，所得cd4-cd8+細胞群為tc細胞亞群；cd3+cd56+細胞群為nkt-like細胞亞群；以及f.對th細胞亞群、tc細胞亞群、蛻膜nk細胞亞群和nkt-like細胞亞群分別以ifn-γ/il-4十字門設門，所得ifn-γ+il-4-細胞群為相應的1型亞群，所得ifn-γ-il-4+細胞群為相應的2型亞群。藉此可提高蛻膜淋巴細胞亞型檢測的準確性。本發明還提供了一種采用上述蛻膜淋巴細胞亞型的檢測方法檢測蛻膜淋巴細胞亞型的試劑盒，其包括：熒光標記的抗cd3抗體、熒光標記的抗cd4抗體、熒光標記的抗cd8抗體、熒光標記的抗cd56抗體、熒光標記的抗cd16抗體、熒光標記的抗ifn-γ抗體、熒光標記的抗il-4抗體、和fixableviabilitydye。其中，熒光標記的抗cd3抗體、熒光標記的抗cd4抗體、熒光標記的抗cd8抗體、熒光標記的抗cd56抗體、熒光標記的抗cd16抗體、熒光標記的抗ifn-γ抗體、熒光標記的抗il-4抗體、和fixableviabilitydye在流式細胞術檢測時，可具有不同的發射光波長。使用該試劑盒檢測蛻膜淋巴細胞亞型時所需蛻膜淋巴細胞樣品較少，且操作簡單，節省抗體。在檢測蛻膜淋巴細胞亞型的試劑盒的另一種示意性實施方式中，熒光標記的抗cd3抗體、熒光標記的抗cd4抗體、熒光標記的抗cd8抗體、熒光標記的抗cd56抗體、熒光標記的抗cd16抗體、熒光標記的抗ifn-γ抗體、和熒光標記的抗il-4抗體的熒光標記依次為percp、apc、fitc、pe-vio770、vioblue、apc-vio770和pe。在檢測蛻膜淋巴細胞亞型的試劑盒的另一種示意性實施方式中，fixableviabilitydye為fixableviabilitydyeefluor506。在檢測蛻膜淋巴細胞亞型的試劑盒的另一種示意性實施方式中，試劑盒還包括用于細胞固定和透膜的試劑。本發明還提供了上述的檢測蛻膜淋巴細胞亞型的試劑盒在反復自然流產的免疫學檢測中的應用，其包括：使用試劑盒檢測健康人群及反復自然流產患者的蛻膜淋巴細胞亞型，得到檢測結果；比較檢測結果中健康人群及該反復自然流產患者的蛻膜淋巴細胞亞型中的細胞亞群的細胞比例；以及若該反復自然流產患者與健康人群的細胞比例存在差異，則判斷該反復自然流產患者存在由免疫導致流產的風險。將該試劑盒應用于反復自然流產的免疫學檢測時，所需蛻膜淋巴細胞樣品較少，且操作簡單，節省抗體。在檢測蛻膜淋巴細胞亞型的試劑盒在反復自然流產的免疫學檢測中的應用的另一種示意性實施方式中，包括：使用試劑盒檢測健康人群及反復自然流產患者的蛻膜淋巴細胞亞型，得到檢測結果；比較檢測結果中健康人群及該反復自然流產患者的蛻膜淋巴細胞亞型中的細胞亞群的細胞比例，細胞亞群為th1細胞亞群、tc1細胞亞群、蛻膜nk1細胞亞群和/或nkt1-like細胞亞群；以及若該反復自然流產患者的細胞亞群的細胞比例高于健康人群的細胞亞群的平均細胞比例，則判斷該反復自然流產患者存在由免疫導致流產的風險。藉此提高反復自然流產的免疫學檢測在由免疫導致流產的風險評估中的準確性。在本發明中，流式細胞術中所用到的抗體可以為與待測樣品同源的抗體或也可以為與待測樣品非同源的抗體，只要該抗體能夠與待測樣品中細胞標志物產生抗原-抗體特異性結合反應即可。在本發明中，“+”代表陽性，即表示該抗原在細胞有表達；“++”代表強陽性，即表示該抗原在細胞高表達；“-”代表陰性，即表示該抗原在細胞不表達。在本發明中，各個熒光標記的抗體中的熒光標記物不受本發明的限制，本領域技術人員可以根據實際情況選擇合適的熒光標記物，以及對應的同型對照。在本發明中，本發明提供的檢測蛻膜淋巴細胞亞型的試劑盒中，熒光標記的抗體，可以是熒光標記物與抗體單獨放置，在使用時將兩者偶聯獲得熒光標記的抗體；也可以是熒光標記的抗體，在使用時，直接使用即可。附圖說明以下附圖僅對本發明做示意性說明和解釋，并不限定本發明的范圍。圖1顯示了fsc/viability密度圖的中央型設門。圖2顯示了fsc/viability密度圖的擴大型設門。圖3顯示了ssc-h/ssc-w密度圖設門去除粘連體。圖4顯示了fsc-h/fsc-w密度圖設門去除粘連體。圖5顯示了cd3/cd56十字門設門。圖6顯示了cd56/cd16橢圓門設門。圖7顯示了cd4/cd8十字門設門。圖8顯示了fsc/ssc密度圖的中央型設門。圖9顯示了fsc/ssc密度圖的擴大型設門。圖10顯示了viability直方圖。圖11顯示了通過不同設門策略進行流式數據分析的流程圖。圖12顯示了通過不同設門策略進行流式數據分析的各細胞標志的熒光強度分布直方圖。具體實施方式為了對發明的技術特征、目的和效果有更加清楚的理解，現結合以下實施例說明本發明的具體實施方式。本發明提供的一種蛻膜淋巴細胞亞型的檢測方法和檢測蛻膜淋巴細胞亞型的試劑盒中所用到的試劑和原料均可由市場購得。本發明中用到的熒光標記percp、apc、fitc、pe-vio770、vioblue、apc-vio770和pe均為常見的熒光標記，可以由市場購得，各個熒光標記的抗體也可以由市場購得。本發明中用到的fixableviabilitydye可由市場購得。第一實施例。一、蛻膜淋巴細胞樣品的制備1、蛻膜單個核細胞(dmc)分離1.1、組織塊大小約2×1×1cm大小數枚，用刀片將其切割成1×1×1mm大小的塊，放入組織研磨器中加入1ml培養液，轉動研棒，研至勻漿，5ml培養液沖洗研磨器2次，過細胞濾網，過濾后入10ml離心管，450g離心5min；1.2、用2ml培養液重懸細胞團，鋪在2ml的密度梯度分離液上，2000rpm不間斷離心15min；1.3、小心吸取界面處的細胞入1ml離心管，2000rpm離心10min，吸除上清液，0.5ml培養液重懸細胞，需充分彈打離心管底部。其中，細胞量不足時可以將研磨后的剩余組織用1mg/ml膠原蛋白酶37℃消化1h后再次分離細胞，可使最終獲得的細胞總量加倍。是否增加酶消化步驟得到的細胞對方法結果無影響，僅是細胞數量上的差別。2、細胞計數2.1、70％酒精洗滌細胞計數板與載玻片，完全干燥后將蓋玻片蓋在計數倉上，輕壓蓋玻片使之吸附；2.2、吸管吸取0.1ml細胞懸液與0.3ml臺盤藍染液在1ml離心管中混勻，吸取10μl混合液滴在蓋玻片的邊緣；2.3、待混合液充分吸入計數倉后，在倒置顯微鏡下計數4個大格的活細胞總數，細胞懸液濃度(/ml)＝4個大格活細胞總數×104，細胞活力應>90％；2.4、計算培養液用量，重懸細胞懸液至濃度2×106/ml；2.5、以上操作5min內完成，細胞懸液4℃冷藏。(如計數后標本量充足，分裝細胞懸液并凍存)。3、預刺激3.1、解凍活化劑工作液(購自bd，貨號550583)，培養板孔內加入dmc細胞懸液，0.5ml/孔(濃度2×106/ml)，每孔加入分裝好的解凍后的活化劑工作液0.5ml，混勻，37℃5％co2培養箱培養6小時；3.2、細胞懸液移入1ml離心管中，300g離心10min，1ml流式緩沖液洗滌1遍，300g離心10min，0.5ml流式緩沖液重懸細胞；3.3、細胞計數，方法同上，pbs重懸細胞懸液至濃度2×106/ml，得到活化的細胞懸液。二、蛻膜淋巴細胞樣品的蛻膜淋巴細胞亞型檢測1、檢測蛻膜淋巴細胞亞型的試劑盒：試劑廠家貨號cd8-fitc(fitc標記的抗cd8抗體)miltenyi130-080-601cd56-pe-vio770(pe-vio770標記的抗cd56抗體)miltenyi130-100-676cd16-vioblue(vioblue標記的抗cd16抗體)miltenyi130-099-080cd4-apc(apc標記的抗cd4抗體)miltenyi130-091-232cd3-percp(percp標記的抗cd3抗體)miltenyi130-094-965ifn-γ-apc-vio770(apc-vio770標記的抗ifn-γ抗體)miltenyi130-096-625il-4-pe(pe標記的抗il-4抗體)miltenyi130-091-647fixableviabilitydyeefluor506ebioscience65-0866-14固定和透膜試劑ebioscience88-8824pbs緩沖液//2、操作步驟2.1、熒光染色：a、表面標記：從離心管中取100μl活化的細胞懸液至流式上樣管中，取percp標記的抗cd3抗體、apc標記的抗cd4抗體、fitc標記的抗cd8抗體、pe-vio770標記的抗cd56抗體、vioblue標記的抗cd16抗體和fixableviabilitydyeefluor506各5μl混勻后加入上樣管中，振蕩器混勻，2-8℃避光孵育15min，得到中間樣a；b、固定和透膜：向中間樣a中加入500μl固定和透膜試劑，室溫避光孵育20min，充分彈勻離心管，得到中間樣b；c、胞內標記：向中間樣b中加入apc-vio770標記的抗ifn-γ抗體和pe標記的抗il-4抗體各5μl，振蕩器混勻1-2s，室溫避光培育15min；(如標記同型對照，取同型對照5μl，同法標記)；加入2mlpbs緩沖液終止孵育，800-850g離心5min，吸除上清液，注意保護細胞團，再加入300μlpbs緩沖液充分彈勻,得到染色后樣品。其中，染色后樣品如不能當日上機檢測，加入0.5ml1％多聚甲醛pbs重懸固定，4℃避光過夜，可次日上機檢測。2.2、流式細胞術檢測使用bdfacscantoplus流式細胞儀對染色后樣品進行檢測，得到檢測數據。儀器性能在每次檢測前都進行檢查。光電倍增管(pmt)電壓的設定采用未標記的細胞標本，并在整個研究中保持固定。熒光補償通過單標微球調整然后通過單標細胞標本調整。每次上樣收集150000個細胞。各熒光標記的激發光波長和發射光波長如下所示：percp：激發光波長482nm/發射光波長675nm；apc：激發光波長652nm/發射光波長660nm；fitc：激發光波長495nm/發射光波長520nm；pe-vio770：激發光波長565nm/發射光波長775nm；vioblue：激發光波長400nm/發射光波長452nm；apc-vio770：激發光波長650nm/發射光波長774nm；pe：激發光波長565nm/發射光波長578nm；fixableviabilitydyeefluor506nm：激發光波長415/發射光波長506nm。2.3、分析檢測數據所有流式數據使用flowjo10.0軟件進行分析，其中：細胞標志cd3-cd56++cd16-ifn-γ+il-4-代表蛻膜nk1細胞亞群，細胞標志cd3-cd56++cd16-ifn-γ-il-4+代表蛻膜nk2細胞亞群，細胞標志cd3+cd56-cd4+cd8-ifn-γ+il-4-代表th1細胞亞群，細胞標志cd3+cd56-cd4+cd8-ifn-γ-il-4+代表th2細胞亞群，細胞標志cd3+cd56-cd4-cd8+ifn-γ+il-4-代表tc1細胞亞群，細胞標志cd3+cd56-cd4-cd8+ifn-γ-il-4+代表tc2細胞亞群，細胞標志cd3+cd56+ifn-γ+il-4-代表nkt1-like細胞亞群，細胞標志cd3+cd56+ifn-γ-il-4+代表nkt2-like細胞亞群。分析方法一(以下簡稱fsc/vt設門方法)：a.建立fsc/viability(fixableviabilitydyeefluor506)密度圖，采用中央型(參見圖1)或擴大型(參見圖2)的設門范圍在偽彩圖顯示模式下將最靠近右下方的細胞群落(即fixableviabilitydye染色較低的細胞中fsc較高的細胞群落)設門標記為p1；b.對p1內細胞依次通過ssc-h/ssc-w(參見圖3)和fsc-h/fsc-w(參見圖4)設門去除粘連體；c.對去除粘連體后的細胞群以cd3/cd56十字門設門(參見圖5)；d.對cd3-cd56+細胞群以cd56/cd16設門，對cd56++cd16-細胞群經橢圓門設門(參見圖6)，所得細胞群為蛻膜nk細胞亞群；e.對cd3+cd56-細胞群以cd4/cd8十字門設門(參見圖7)，所得cd4+cd8-細胞群為th細胞亞群，所得cd4-cd8+細胞群為tc細胞亞群；cd3+cd56+細胞群為nkt-like細胞亞群；f.對th細胞亞群、tc細胞亞群、蛻膜nk細胞亞群和nkt-like細胞亞群分別以ifn-γ/il-4十字門設門，所得ifn-γ+il-4-細胞群為相應的1型亞群(即th1、tc1、dnk1和nkt1-like)，所得ifn-γ-il-4+細胞群為相應的2型亞群(即th2、tc2、dnk2和nkt2-like)。分析方法二(以下簡稱fsc/ssc設門方法)：a.建立fsc/ssc密度圖，采用中央型(參見圖8)或擴大型(參見圖9)的設門范圍將有核細胞區域設門標記為p1；b.對p1內細胞依次通過ssc-h/ssc-w和fsc-h/fsc-w設門去除粘連體；c.對去除粘連體后的細胞群以viability(fixableviabilitydyeefluor506)直方圖設門去除死細胞(參見圖10)；然后以cd3/cd56十字門設門；d.對cd3-cd56+細胞群以cd56/cd16設門，對cd56++cd16-細胞群經橢圓門設門，所得細胞群為蛻膜nk細胞亞群；e.對cd3+cd56-細胞群以cd4/cd8十字門設門，所得cd4+cd8-細胞群為th細胞亞群，所得cd4-cd8+細胞群為tc細胞亞群；cd3+cd56+細胞群為nkt-like細胞亞群；f.對th細胞亞群、tc細胞亞群、蛻膜nk細胞亞群和nkt-like細胞亞群分別以ifn-γ/il-4十字門設門，所得ifn-γ+il-4-細胞群為相應的1型亞群(即th1、tc1、dnk1和nkt1-like)，所得ifn-γ-il-4+細胞群為相應的2型亞群(即th2、tc2、dnk2和nkt2-like)。其中，上述的中央型設門策略的設門范圍以偽彩圖中最亮部分為標準，擴大型設門策略的設門范圍包括了中央門的周圍散點，如果偽彩圖中中央門周圍散點分界不清楚，可在輪廓圖顯示模式下以最外一條輪廓線為擴大門的設門標準。圖11為通過不同設門策略進行流式數據分析的流程圖，其中a為fsc/ssc中央型設門策略，b為fsc/vt中央型設門策略，c為fsc/ssc擴大型設門策略，d為fsc/vt擴大型設門策略。該蛻膜淋巴細胞亞型的檢測方法，僅需對同一份待檢測蛻膜淋巴細胞樣品進行針對cd3、cd4、cd8、cd56、cd16、ifn-γ和il-4的熒光染色及fixableviabilitydye染色，即可實現對蛻膜淋巴細胞多個亞型的分析，該方法所需蛻膜淋巴細胞樣品較少，節省抗體，且操作簡單。下表1是分別用四色流式細胞術和第一實施例的方法檢測dnk、nkt-like、t、dnk2、dnk1、tc、th、tc2、tc1、th2、th1、nkt2-like和nkt1-like時，對細胞和抗體的消耗情況及耗時。表1：兩種檢測方法的比較第二實施例采用第一實施例所述的方法，對收集的31例樣本進行蛻膜淋巴細胞亞型檢測，樣本來自2016年8月-2017年2月在首都醫科大學附屬北京婦產醫院收治的10例urm患者，平均年齡31.6±2.5歲，以及21例同時期行主動人流術的健康女性，平均年齡29.6±2.8歲。不同設門策略檢測出的健康女性和urm患者蛻膜淋巴細胞亞型的細胞比例分別見下表2和表3。通過細胞比例可以反映相應的細胞數量。表2：健康女性蛻膜淋巴細胞亞型的細胞比例表3：urm患者蛻膜淋巴細胞亞型的細胞比例對表2和表3中的數據進行2×2析因設計方差分析，結果顯示：不論是健康女性或者urm患者，設門方法(fsc/vt設門方法或fsc/ssc設門方法)對dnk、nkt-like、tc、th、th1的細胞數量沒有影響，而對th2、dnk2、dnk1、nkt1-like的細胞數量有影響。此外，結果還顯示：設門方法對tc1/tc2和dnk1/dnk2比值的影響具有統計學意義，采用fsc/vt設門方法得到的結果均高于采用fsc/ssc設門方法得到的結果。可以看出，在蛻膜淋巴細胞的多色流式細胞術數據分析過程中，設門方法可以影響1型、2型細胞亞群的分析數值。從各細胞標志的熒光強度分布直方圖也可以反映出不同設門方法對細胞數量的影響(參見圖12)其中，r2為上述fsc/ssc設門方法，r3為上述fsc/vt設門方法，r1為參照外周血淋巴細胞群落的位置的設門方法(即淋巴細胞的fsc/ssc常規設門方法)。圖中分別顯示了cd3、cd56、cd4、cd8、ifn-γ和il-4的熒光強度-細胞數量關系，可以看出fsc/vt設門方法對于在fsc/ssc設門方法中不能很好顯示出分群的樣本非常適用。此外，從圖中還可以看出按照淋巴細胞的fsc/ssc常規設門位置(r1)不能很好地識別淋巴細胞群落，將該設門調整至細胞比較密集的位置(r2)效果稍好一些，但fsc/vt的細胞群落位置識別起來更加清晰，獲得的細胞數量也比調整后的r2更多，說明針對蛻膜淋巴細胞fsc/vt是更合適的初始設門方法。在流式細胞術檢測過程中，可通過目標細胞分群是否清楚、目標細胞熒光強度等表示準確性的高低；目標細胞分群清楚、目標細胞熒光強度高，則表示準確性高。可見，在本發明中，相較于fsc/ssc設門方法，fsc/vt設門方法能夠提高蛻膜淋巴細胞亞型檢測的準確性。根據表2及表3中的分析結果，發現urm患者相較于健康女性存在明顯增加的1型細胞，包括th1、tc1、dnk1和nkt1-like細胞，差異具有統計學意義。該結果證明本發明在應用于健康人群或反復自然流產患者的蛻膜淋巴細胞分型是可靠的。第三實施例：檢測蛻膜淋巴細胞亞型的試劑盒在反復自然流產的免疫學檢測中的應用。方法：a、使用第一實施例中所述的檢測蛻膜淋巴細胞亞型的試劑盒，并根據第一實施例中所述的方法檢測健康人群及反復自然流產患者的蛻膜淋巴細胞亞型，得到檢測結果；b、比較該檢測結果中健康人群及該反復自然流產患者的蛻膜淋巴細胞亞型中的th1細胞亞群、tc1細胞亞群、dnk1細胞亞群和/或nkt1-like細胞亞群的細胞比例；以及c、若該反復自然流產患者的th1細胞亞群、tc1細胞亞群、dnk1細胞亞群和/或nkt1-like細胞亞群的細胞比例高于健康人群的細胞亞群的平均細胞比例，則判斷該反復自然流產患者存在由免疫導致流產的風險。該應用所需蛻膜淋巴細胞樣品較少，且操作簡單，節省抗體。發明人發現反復自然流產患者相較于健康女性存在明顯增加的1型細胞，包括th1、tc1、dnk1和nkt1-like細胞，差異具有統計學意義。因此通過比較健康人群及反復自然流產患者的蛻膜淋巴細胞亞型中的th1細胞亞群、tc1細胞亞群、dnk1細胞亞群和/或nkt1-like細胞亞群的細胞比例，可使反復自然流產的免疫學檢測應用于由免疫導致流產的風險評估時具有較高的準確性。在本文中，“示意性”表示“充當實例、例子或說明”，不應將在本文中被描述為“示意性”的任何實施方式解釋為一種更優選的或更具優點的技術方案。在本文中，“相等”、“相同”等并非嚴格的數學和/或幾何學意義上的限制，還包含本領域技術人員可以理解的且生產或使用等允許的誤差。除非另有說明，本文中的數值范圍不僅包括其兩個端點內的整個范圍，也包括含于其中的若干子范圍。應當理解，雖然本說明書是按照各個實施例描述的，但并非每個實施例僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發明的可行性實施例的具體說明，它們并非用以限制本發明的保護范圍，凡未脫離本發明技藝精神所作的等效實施方案或變更，如特征的組合、分割或重復，均應包含在本發明的保護范圍之內。當前第1頁12