專利名稱：一種含hiv-1 crf01-ae亞型rt基因的雜交免疫缺陷質粒、病毒及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種含Hiv-I CRF Ol-AE亞型RT基因的雜交免疫缺陷質粒、病毒RT-SHIV/AE及其在構建AE亞型RT-SHIV猴模型中的應用。
背景技術：
艾滋病，又稱為獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)(Human immunodeficiency virus, HIV)弓 1 白勺一類死亡率極高的傳染性疾病，對全球尤其是亞洲和非洲發展中國家的人民的生命健康安全威脅極大。目前流行于全球的HIV-I分為三組，M組、0組和N組，M組內又可分為A J 10個亞型，各亞型間的基因離散率是20% 35%，同時，還有數十種循環重組型存在。 HIV-ICRF Ol-AE亞型病毒1989年最先在泰國發現，主要在性傳播人群中流行擴散，在吸毒人群中廣泛傳播，改變了以往B亞型感染為主的流行格局。近年來，CRF Ol-AE亞型病毒日益泛濫，正在成為我國最流行的HIV-I病毒亞型。高效抗逆轉錄病毒療法(HighlyActive Anti-Retroviral Therapy, HAART)的發明是艾滋病防治道路上的一個重大進步。大多數的患者經過HAART的治療能抑制HIV-I病毒的復制，使病毒的載量處于一個低水平狀態，這種療法的應用能降低死亡率和提高病人的生活質量。HAART中含有三類抗逆轉錄病毒的藥物，分別為(1)核苷酸近似體逆轉錄酶抑制劑(NRTIs)。NRTIs中含有缺少3_0H的核苷酸，通過這種缺少3-0H的核苷酸在逆轉錄的過程中與RT基因結合，從而阻斷DNA鏈的形成，使逆轉錄過程失敗。(2)非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)。NNRTIs是一種與逆轉錄酶結合的非競爭性抑制劑，主要在化學合成方面發揮作用而阻斷DNA的合成。(3)蛋白酶抑制劑(PIs)。PIs與病毒蛋白酶催化基因結合抑制酶活性，導致蛋白前體不能裂解和形成成熟病毒體。早期的HAART方案包含一種蛋白酶抑制劑和兩種核苷酸近似體逆轉錄酶抑制劑。 非核苷類逆轉錄酶抑制劑研制成功后，便廣泛的應用于HAART方案中。現今主流的逆轉錄療法主要包括兩種NRTIs和一種NNRTI或PI的組合。HAART治療的過程中潛伏和殘余的病毒仍在持續復制，并未從體內剔除，并且長期的治療會導致HIV病毒的耐藥性突變，一旦產生突變將會導致病毒載量的反彈和治療的失敗，HIV病毒耐藥性突變是導致HARRT治療失敗的一個主要原因。為了更好的研究病毒的耐藥性突變以及對藥物的有效性進行合理評價，需要選用合適的動物模型進行研究。動物模型在研究HIV-I抗病毒耐藥性問題存在很多的優點，使用合適的動物模型可以研究病毒在人體內的復制情況，包括不同的細胞亞群對病毒感染的反應、免疫選擇壓力、不同位點的病毒復制特點等。HIV與SIV同屬于逆轉錄病毒科慢病毒屬，且同屬于靈長類慢病毒組，關系最為密切。恒河猴感染猴免疫缺陷病毒SIV和人感染HIV-I存在著相似性，繼而發展出的癥狀也和AIDS相似，這些特點可以使SIV/恒河猴動物模型用于抗逆轉錄治療的研究。然而，恒河猴感染SIV作為一個治療性的動物模型還存在一些限制，SIV的RT和HIV-I的RT的相似性為60%，在對于藥物的易感性和非核苷逆轉錄酶抑制性上存在著差異，主要問題為HIV和 SIV中的逆轉錄酶RT基因對藥物的敏感性不同。國外科學家經過基因操作手段將人免疫缺陷病毒HIV的RT基因替換猴免疫缺陷病毒SIV的RT基因得到嵌合病毒RT-SHIV來解決這個問題，該嵌合病毒RT-SHIV包含有抗 HIV病毒藥物的主要靶點-HIV RT基因。由RT-SHIV建立的恒河猴動物模型能夠對抗逆轉錄病毒藥物進行有效性的篩選，以及深入的研究和了解更多關于治療過程中病毒抗性，殘留病毒的持續復制等問題。現有RT-SHIV病毒均攜帶HIV-IB亞型的RT基因，B亞型主要在歐美流行，這種 RT-SHIV適合研究歐美艾滋病治療問題，而中國的HIV-I流行株主要為CRF-BC亞型，CRF-AE 亞型和B，亞型，其中又有以CRF Ol-AE亞型為主，HIV-IB亞型與CRF Ol-AE亞型兩者RT基因的同源性只有90. 36%，特別是有很多耐藥位點的差異，因此B亞型的RT-SHIV不適合針對中國患者的艾滋病藥物研究。為了用RT-SHIV動物模型來研究中國的艾滋病治療問題，需要構建包含中國流行株RT基因的RT-SHIV。而且到目前為止，世界上還沒有一種RT-SHIV是針對HIV-ICRF Ol-AE亞型構建的，因此構建一種攜帶有CRF Ol-AE亞型HIV-IRT基因的SHIV，能模擬 HIV-I感染的SHIV/恒河猴模型對針對中國患者研究艾滋病的發病機制和篩選逆轉錄酶抑制劑具有重要意義。

發明內容
本發明的目的在于提供一種含有HIV CRFOl-AE亞型逆轉錄酶基因的雜交免疫缺陷質粒，所述HIV CRFOl-AE亞型逆轉錄酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，作為優選，所述雜交免疫缺陷質粒核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發明還提供含有所述雜交免疫缺陷質粒制備的雜交免疫缺陷病毒。在本發明的具體實施方式
中，利用所述雜交免疫缺陷質粒制備雜交免疫缺陷病毒株RT-SHIV/AE，該病毒攜帶HIV-ICRF Ol-AE亞型的逆轉錄酶基因RT，能感染靶細胞及具有體外感染中國恒河猴單個核細胞PBMC和復制的能力，可感染猴建立AIDS猴模型，用于艾滋病藥物的研究。該病毒為含有HIV CRF Ol-AE亞型RT基因的猴-人免疫缺陷病毒，于2010年12月31日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4510。本發明的另一個目的是提供所述雜交免疫缺陷質粒、雜交免疫缺陷病毒在制備針對HIV-ICRF Ol-AE亞型的RT-SHIV猴模型中的應用。本發明利用基因重組技術，在致病性的SIVmac239基因框架上將HIV-ICRF Ol-AE的RT基因取代SIVmac239相應基因而構建的一種雜交病毒株RT-SHIV/AE。在本發明具體實施例中，HIV-ICRF Ol-AE的RT基因來自一位海南AIDS患者體內分離到的 HIV-107CN. HN031毒株，其基因序列在美國國立生物技術信息中心(National Center For Biotechnology Information, NCBI)的基因庫，genbank 登錄號為 FM251973。通過序列分析證明該毒株是HIV-ICRF 01-AE亞型，并且其RT基因是完整的。
本申請發明人從p239spsp5’中通過套疊PCR擴增出去掉RT基因的片段，再將該片段連入T載體，命名為Τ-0Ε，經測序確定未發生突變。從HIV-I病毒液中擴增出RT基因， 將RT基因連入T-OE載體中，命名為T-OE-RT。將T-OE-RT載體上的目的片段經I^c I和 BsrGI酶切替換進SIVmac239全長質粒的相應片段中，便構建成攜帶有HIV-ICRF Ol-AE亞型RT基因的猴-人免疫缺陷病毒質粒，命名為RT-SHIV/AE全長質粒。使用三個限制性內切酶EcoR I，Hind III和Kpn I酶切所述RT-SHIV/AE全長質粒，發現EcoR I不能酶切該質粒，Hind III把質粒剪切成三段，長度分別為9608bp， 3025bp和583bp，Kpn I把質粒剪切成五段，長度分別為4524bp，3855bp，3191bp，823bp和 823bp ；與原有SIVmac239全長質粒不同，SIV質粒的酶切結果為EcoR I不能酶切該質粒， Hind III把質粒剪切成兩段，長度分別為12630bp和58;3bp，Kpn I把質粒剪切成五段，長度分別為4524bp, 3855bp, 3516bp, 823bp和495bp。同時，使用HIV-IRT基因特異的PCR引物能從RT-SHIV/AE轉染上清和病毒上清中檢測到1659bp的陽性產物，而在SIVmac239質粒轉染上清和病毒上清則不能，證明成功構建序列正確的RT-SHIV/AE全長質粒。用所述RT-SHIV/AE全長質粒轉染細胞，收集上清便獲得具有感染性的本發明所述雜交免疫缺陷病毒RT-SHIV/AE的完整病毒顆粒，本發明所述雜交免疫缺陷病毒 RT-SHIV/AE為含有HIVCRF01-AE亞型RT基因的猴-人免疫缺陷病毒，于2010年12月31 日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 4510。用本發明所述雜交免疫缺陷病毒RT-SHIV/AE體外感染攜帶不同來源的細胞，包括TZM-bl和CEMxl74細胞，鑒定重組病毒的生物學特性，結果發現，本發明所述雜交免疫缺陷病毒RT-SHIV/AE具有感染靶細胞能力；其感染的TZM-bl細胞發生腫脹，胞漿呈顆粒樣變化，胞膜邊緣不整齊，RT-SHIV/AE能使CEMxl74細胞融合形成合胞體，證明該病毒具有使細胞病變的能力。通過在中國恒河猴PBMC細胞中培養獲得高滴度的重組病毒，監測培養液中SIV核心蛋白P27水平的變化，以判定重組病毒的復制能力，結果顯示病毒具有體外感染和復制能力。本發明所述雜交免疫缺陷病毒RT-SHIV/AE具有下述優點1)攜帶具有代表性的CRF Ol-AE亞型HIV-I逆轉錄酶(RT)；2)具有感染靶細胞的能力；3)具有體外感染猴PBMC和高效復制的能力。本發明所述雜交免疫缺陷病毒RT-SHIV/AE衍生于人類免疫缺陷病毒HIV和猴免疫缺陷病毒SIV，攜帶中國主要流行株HIV-1CRF01-AE亞型的逆轉錄酶RT。使用該雜交病毒建立的AE亞型RT-SHIV/猴模型，可用于研究艾滋病毒體內感染過程、病原特性、發病機理及免疫反應等，特別是用于檢測和篩選逆轉錄酶抑制劑，具有良好的應用前景。生物材料保藏說明分類命名RT-SHIV/AE，含有HIV CRF Ol-AE亞型RT基因的猴-人免疫缺陷病毒， 于2010年12月31日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4510。


圖1為RT-SHIV/AE基因結構示意圖；圖2為RT-SHIV/AE全長質粒基因結構示意圖；
圖3為RT-SHIV/AE全長質粒酶切鑒定圖；泳道 1 DLIOOOOmarker ；泳道2-4:克隆1;
泳道5-7:克隆2;泳道8-10:克隆 3;泳道11-13:克隆 4;泳道14-16:克隆 5;泳道17-19:克隆 6;泳道20-22 :SIVmac239 ；泳道 23 :DL5000marker ；泳道 24 :DL2000marker。圖4為RT-SHIV/AE質粒轉染293T細胞和CEMxl74細胞RT-SHIV/AE轉染液的PCR 擴增產物1.5%凝膠電泳圖；泳道 1 :DL2000marker ；泳道2 RT-SHIV/AE 轉染 293T 上清；泳道3 RT-SHIV/AE 轉染 CEMxl74 細胞上清 1 ；泳道4 RT-SHIV/AE 轉染 CEMxl74 細胞上清 2 ；泳道5 :SIVmac239 轉染 293T 上清。圖5 RT-SHIV/AE 感染 TZM-bl 細胞的 100X 光鏡圖；A為感染RT-SHIV/AE 48小時的TZM_bl細胞；B為TZM_bl正常細胞。圖 6 RT-SHIV/AE 感染 CEMX174 細胞的 100X 光鏡圖；A為感染RT-SHIV/AE第13天的CEMxl74細胞，箭頭所指部分為病變細胞；B為 CEMx 174正常細胞。
具體實施例方式本發明公開了一種所述雜交免疫缺陷質粒、雜交免疫缺陷病毒及其在構建AE亞型RT-SHIV/猴模型中的應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。實施例1 :RT_SHIV/AE全長克隆的特殊培養、大量制備及鑒定RT-SHIV/AE基因是在SIVmac239的基因組框架上，以海南AIDS患者體內分離到的HIV-107CN. HN031毒株的部分基因片段取代SIVmac239的相應基因，RT-SHIV/AE基因結構示意圖見圖1，圖中白色的部分來自于HIV-107CN.HN031，黑色的部分來自于SIVmac239。所述HIV-107CN. HN031毒株基因序列在美國國立生物技術信息中心(National Center For Biotechnology Information, NCBI)的基因庫，genbank 登錄號為 No. FM251973。通過序列分析證明該毒株是HIV-ICRF Ol-AE亞型，并且其RT基因是完整的，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1 所示。制備RT-SHIV/AE全長質粒，將T-OE-RT載體上的目的片段(包括HIV-IRT基因) 經Pac I和BsrG I酶切替換進SIVmm239全長質粒的相應片段中，構建成RT-SHIV/AE全長質粒。RT-SHIV/AE全長質粒基因結構示意圖見圖2，圖中標示CRF Ol-AE RT片段為來自于 HIV-107CN. HN031的RT基因，其余部分為SIVmac239其余基因和載體。RT-SHIV/AE全長質粒核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。RT-SHIV/AE全長質粒用于后續細胞實驗，同時保持質粒的穩定性，避免兩端LTR發生重組。目的質粒大量制備含有全長SHIV基因組的cDNA克隆，由于兩端具有病毒LTR 長末端重復序列，在宿主大腸桿菌中進行大量擴增時，質粒極易發生同源重組和缺失，必須嚴格使用特殊的培養條件才能盡量保持質粒的穩定性。采用重組缺陷抑制型菌株E. coli JM109為宿主菌，30°C，不高于ISOrpm及不超過14h的特殊培養條件，可以基本保持質粒的穩定性。鑒于含有全長SHIV基因組質粒的特殊性，最好不要在大腸桿菌中進行保存，以免出現質粒的丟失。需要對質粒進行大量擴增時，重新用JM109菌株進行轉化，挑取新鮮的單菌落進行培養。由于動物實驗的需要，大量制備不含內毒素的SHIV質粒時，采用以下方法進行 將SHIV質粒轉化JM109菌株，30°C平板培養18 20小時后，挑取單菌落接種到5mL含有氨芐的LB液體培養基中。30°C，ISOrpm震蕩培養12 14小時后，取1. 5mL菌體培養液進行質粒小提，酶切鑒定無誤后，將剩余的3. 5mL菌體培養液全部接種到IL含有氨芐的2XYT 液體培養基中。30°C、ISOrpm震蕩培養12小時后，取1. 5mL菌體培養液再次進行小提，酶切鑒定無誤后，參照Qiagen公司的的說明書，將IL的菌液用Endofree Plasmid Giga Kit進行質粒的大量制備。步驟如下(1)將菌液于4°C，6000rpm離心15min，棄去上清，將沉淀重懸于500ml冰預冷的 STE溶液中，40C，6000rpm離心15min，棄去上清；(2)菌體沉淀重懸于125ml的Buffer Pl中，振蕩至無沉淀團塊出現，加入125ml 的Buffer P2，輕輕的顛倒離心管數次，室溫下靜置5min，待裂解充分后加入125ml的 Buffer P3，顛倒離心管數次，充分混勻；(3)將混勻后的裂解產物倒入濾器(Mega-Giga Cartridge)中，室溫下靜置20min 以上，打開真空泵加壓抽濾，待液體抽濾完畢后，加入50ml的Buffer FWB2，用無菌玻璃棒輕輕攪動沉淀團塊，繼續進行抽濾；(4)在裂解液中加入30ml的Buffer ER,顛倒混勻，冰浴30min，待溶液澄清后加入預先用75ml的Buffer QBT平衡好的制備柱；(5)待裂解液完全通過DNA制備柱后，用600ml的Buffer QC洗脫雜質，待液體全部過柱后，以100ml的洗脫液Buffer QN洗脫DNA ；(6)收集DNA洗脫液，加入70ml的異丙醇，充分混勻后，于12°C，IOOOOrpm離心 50min ；
(7)小心倒去上清，用IOml 70 %乙醇洗滌沉淀，棄去乙醇洗液，離心管倒置在紙巾上自然干燥；(8)加入5ml_10ml的生理鹽水溶解質粒DNA ； (9)分光光度計測定質粒DNA的濃度，根據測定的質粒濃度稀釋為終濃度為1 μ g/ μ 1(或 0.4yg/y l，40ng/y 1)，-20°C保存。結果得到2. 25mg的RT-SHIV/AE全長質粒，使用三個限制性內切酶(EcoR I,Hind III和Kpn I)酶切RT-SHIV/AE全長質粒，酶切產物電泳圖見圖3，結果顯示EcoR I不能酶切該質粒，Hind III把質粒剪切成三段，長度分別為9608bp，3025bp和583bp，Kpn I把質粒剪切成五段，長度分別為4524bp，3855bp，3191bp，823bp和823bp ；SIVmac239全長質粒的酶切結果為=EcoR I不能酶切該質粒，Hind III把質粒剪切成兩段，長度分別為12630bp 和583bp，Kpn I把質粒剪切成五段，長度分別為4524bp，3855bp，3516bp，823bp和495bp。使用PCR方法特異性擴增質粒中的RT基因，序列測定發現質粒保持穩定，確保后續實驗的順利進行。實施例2 :293T細胞培養及質粒轉染為了獲得雜交病毒株RT-SHIV/AE，使用實施例1制備的全長質粒轉染293Τ細胞， 獲得具有感染性的完整病毒顆粒。293Τ傳代細胞系為半貼壁細胞，生長較快，當細胞狀態良好時，在含有8%胎牛血清的DMEM完全培養基中培養時，平均48小時就要傳1代(1瓶傳為3瓶)。當細胞長滿瓶后，輕輕將培養基上清吸去，加入胰酶和EDTA的混合消化液(胰酶EDTA=I 3)消化細胞，顯微鏡下觀察，待細胞開始變圓時，迅速將消化液吸掉，加入新鮮的DMEM完全培養基輕輕將細胞吹散，將1瓶細胞分為3瓶。37°C 5% CO2培養箱中培養。轉染實驗成功與否以及轉染效率的高低受很多因素影響，主要與用于轉染的細胞系生長狀態、質粒DNA的質量、選用的轉染試劑和具體的操作方法有關。由于得到的SHIV 全長克隆數量較多，在第一輪轉染實驗中使用6孔板進行細胞培養并獲得病毒顆粒，具體步驟如下(1)用10%完全DMEM培養基將293T細胞鋪入6孔板中(5 X IO5/孔)，過夜培養， 細胞密度達到70%，目的是為了培養較長時間。(2)每孔用2ml不含抗生素的完全DMEM培養基換液，繼續培養2小時。(3)將5 μ g質粒DNA稀釋于650 μ 1無血清、無抗生素的DMEM培養基，輕輕混勻。(4) 10 μ 1 Lipofectamine 2000試劑(使用前輕輕混勻)稀釋于650 μ 1無血清、 無抗生素的DMEM培養基，室溫孵育5分鐘。(5)將稀釋的質粒DNA和稀釋的Lipofectamine 2000試劑(總體積為1. 3ml)混合，輕輕混勻，室溫20分鐘，注意溶液可能會混濁，但不會影響轉染。(6)直接將混合液分別加入每孔細胞中，輕輕搖動孔板混勻，5% C02，37°C培養5 小時。(7)取2ml新鮮的2%完全培養基換液，5% CO2, 37°C培養40小時。(8)收集每孔上清，用0. 45 μ M濾器過濾后，用SIV Ρ27抗原檢測試劑盒測定SHIV 病毒滴度，直接用于TZM感染實驗或凍存于液氮中。為轉染RT-SHIV/AE全長質粒得到病毒，我們培養了 293T細胞，293T細胞由293細胞派生，同時表達SV40大T抗原，含有SV40復制起始點與啟動子區的質粒可以復制。瞬時轉染293T細胞是表達蛋白并包裝病毒的便捷方式。293T細胞的生長狀態直接關系到包裝病毒和轉染的效率，應盡量選擇傳代次數少，培養總時間短的細胞。從細胞形態上看，相差顯微鏡下觀察立體感強并且形態良好的細胞產病毒率或者轉染效率都很高。在本研究中， 我們選擇傳代次數少，培養時間短的293T細胞進行轉染實驗，得到較好的結果，轉染上清檢測到高水平的SIV P27抗原含量，SIV P27抗原含量大于32ng/mL，證明轉染出能高水平表達的雜交病毒株RT-SHIV/AE。所述雜交病毒株RT-SHIV/AE為含有HIVCRF01-AE亞型RT基因的猴-人免疫缺陷病毒，于2010年12月31日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4510。 實施例3 本發明所述雜交病毒株RT-SHIV/AE感染TZM_bl細胞及病毒TCID5tl滴定本發明所述雜交病毒株RT-SHIV/AE具有感染性，RT-SHIV/AE感染TZM_bl細胞的光鏡圖(100X)見圖5。A為TZM-bl細胞感染RT-SHIV/AE 48小時后的病變圖，箭頭所指部分為病變細胞，病變細胞發生腫脹，胞漿呈顆粒樣變化，胞膜邊緣不整齊；B為TZM-bl正常細胞。RT-SHIV/AE感染CEMX174細胞的的光鏡圖(100X)見圖6，A為感染RT-SHIV/AE 第13天的CEMxl74細胞，箭頭所指部分為病變細胞，病毒能使CEMxl74細胞融合形成合胞體；B為CEMxl74正常細胞。TZM細胞系也為貼壁細胞，生長速度較慢。在含10%胎牛血清的DMEM完全培養基中培養，當細胞長滿瓶進行傳代。輕輕將培養基上清吸去，用胰酶將細胞全部消化下來，SOOrpm離心5分鐘，徹底去除胰酶。用培養基將細胞重懸，輕 輕吹散，分瓶。對SHIV 病毒在TZM-bl細胞中單循環感染周期(48小時培養)的TCID50進行測定，將relative luminescence units (RLU)的 2· 5 倍定為 Cutoff 值。(1)將SHIV-KB9病毒從液氮中取出后4°C緩慢融化，用完全DMEM培養基2倍稀釋病毒，取100 μ 1病毒稀釋液加入96孔培養板中，設四孔重復。(2) IOml 含 45 μ g/ml DEAE 的完全培養基實驗前補充 30 μ 1 Indinavir。(3)消化一瓶TZM-bl細胞，離心，用3ml完全培養基懸浮細胞，取Iml細胞懸浮液， 加3ml完全培養基以及8ml含45 μ g/ml DEAE完全培養基，混勻，每孔加100 μ 1。(4)用封口膜封住平板四周，37°C，5% CO2孵育48小時。(5)除去培養基，200 μ 1 IXPBS洗一遍。加入50 μ 1 CCRL裂解液，室溫400rpm
振蕩30分鐘。鏡下觀察細胞是否裂解完全。(6)將細胞裂解液轉移到黑色96孔讀數板中(0ptiplate-96F)，避免氣泡產生。(7)避光在96孔讀數板中每孔加入50 μ 1 Iuciferase底物，輕輕振蕩混勻。(8)將96孔讀數板上機(1420Multilabel Counter)，計數熒光強度。(9)半數細胞感染劑量TCID5tl可運用Reed-Muench法公式計算TCID50 = CPE > 50 %病毒稀釋度+(> 50 %的百分數_50)/(50 %的百分數-<50%的百分數)TZM-bl細胞表達功能性TAT蛋白，激活熒光素酶報告基因的表達，并且感染細胞的病毒量與細胞產生的熒光素酶活性成正比，而沒感染病毒細胞的熒光素酶活性很差。根據該原理檢測本發明所述雜交病毒株RT-SHIV/AE的感染性，結果發現細胞對照的熒光強度為638RLU，RT-SHIV/AE轉染上清1 2稀釋后，接種TZM_bl細胞的熒光強度在 2500-4000RLU之間，大于細胞對照2. 5倍的cutoff值，說明本發明所述RT-SHIV/AE病毒能感染TZM-bl細胞，該病毒是一個具有感染靶細胞能力的病毒，且與親本的SIVmac239毒株具有相似的生物學特性。在此基礎上，我們進一步測定了轉染上清的TCID5tl，經計算，我們構建質粒轉染上清中含有500TCID5(1/mL的病毒。 實施例4 本發明所述雜交病毒株RT-SHIV/AE感染中國恒河猴實驗目的利用本發明所述雜交病毒株RT-SHIV/AE具有特殊的生物學特性和優點，建立一種新型的RT-SHIV/猴模型。動物選擇選擇36月齡中國恒河猴2只，用商品化膨化飼料飼養。體重3_5kg。 實驗前經體檢無異常，經血清學間接免疫熒光抗體檢查法(IFA)檢查排除猴免疫缺陷病毒 (SIV)、猴逆轉錄D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴細胞性I型病毒(STLV-I)的感染。病毒感染及采樣經后肢靜脈感染，每只猴注射2mL的病毒液。在感染前和感染后 3、7、10、14、17、21、28、35、42、49、56、70及84天采集猴靜脈血61^，311^ EDTA抗凝，用于病毒載量和CD4+/CD8+值測定；3mL肝素抗凝，用于病毒分離。采集肝素抗凝血，待檢全血樣本在24孔板上做系列5倍稀釋，使每孔最后含標本 M 200 μ 1,40 μ 1,8 μ 1,1. 6 μ 1,0. 32 μ 1、0· 064 μ 1。每孔加入 2 X105/ml CEMx 1740. 4ml, 最后用含10%牛血清1640補足每孔1. 6ml。全血病毒滴度所用的培養基含IL_210U/ml。3 天后IL-2量可適當降低。置3715%0)2孵箱，次日換液一次。以后每周換液兩次。每次換液前，觀察每孔有否污染和CPE。連續觀察4周，最高稀釋度全血仍能出現CPE為該標本的病毒滴度，以TCID5Q/ml表示。PBMC前病毒DNA檢測根據產品說明書的要求，取EDTA抗凝全血300 μ 1，用Wizard Genomie DNA Purification Kit (Promega，A1120)提取外周血淋巴細胞的基因組DNA。RT-PCR擴增反應在Eppendorf PCR儀上進行，使用大連寶生物的Takara One StepRNAPCR Kit (DRR024A)，該試劑盒采用了一步反應法，RNA-cDNA-PCR的反應操作在同一反應體系中進行，由AMV來源的反轉錄酶從RNA反轉錄為cDNA，再由AMV-Optimized Tag擴增(^嫩，總反應體積為20口 1，內含10XOne Step buffer 2 μ 1 (10mmol/LTris-Cl,pH8. 3 ； 50mmol/L KCl) ；5mmol/L Mgcl2 ； lmmol/L dNTP Mixture ； 16U RNase Inhibitor ；2U AMV RTase XL ；2U的Tag酶；RT-PCR上下游引物各0. 4mol/L ；2 μ 1的病毒RNA作為模板。循環條件為 60°C 30min(Xl)，95°C 5min (Χ 1)，95°C 15s (Χ 50)，60°C Imin (Χ 50)。這一輪的產物作為巢式PCR的模板。巢式PCR反應在Eppendorf PCR儀上進行，總反應體積為20 μ 1，內含10mmol/L Tris-Cl，ρΗ8· 3 ；50mmol/L KCl ；1. 5mmol/L MgCl2 ；0. 2mmol/L 4X dNTP ；0. 5U 的 Tag 酶；巢式PCR上下游引物各20pmol/L ；2 μ 1的RT-PCR擴增反應產物作為這一輪的模板。循環條件為 94°C 2min(X 1)，94°C 15s (X40)，58°C 30s (Χ40), 72°C 30s (Χ40), 72°C 6min(Xl)。血漿病毒載量的測定使用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)方法監測猴血漿中病毒RNA載量。Rneasy Mini kit (QIAGEN，74106)提取血漿中病毒 RNA，使用 Quantitect SYBR Green RT-PCR Kit (Qiagen，204243)在 Roche LightCycler 熒光定量儀測定血菜病毒 RNA載量，引物分別為2f :GTA ACT ATG TCC ACC TGC CAT ΤΑ,2r :CAG CCT CCT CGT TTA TGA TGT。反應體系為
權利要求
1.一種含有HIV CRFOl-AE亞型逆轉錄酶基因的雜交免疫缺陷質粒，所述HIV CRFOl-AE亞型逆轉錄酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示。
2.根據權利要求1所述的雜交免疫缺陷質粒，其核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
3.一種含有HIV CRFOl-AE亞型逆轉錄酶基因的雜交免疫缺陷病毒，其保藏編號為 CGMCC No. 4510。
4.根據權利要求1或2所述的雜交免疫缺陷質粒在制備針對HIV-ICRFOl-AE亞型的 RT-SHIV猴模型中的應用。
5.根據權利要求3所述的雜交免疫缺陷病毒在制備針對HIV-ICRFOl-AE亞型的 RT-SHIV猴模型中的應用。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，公開了一種含有HIV CRF01-AE亞型逆轉錄酶基因的雜交免疫缺陷質粒、雜交免疫缺陷病毒RT-SHIV/AE及其在構建AE亞型RT-SHIV猴模型中的應用。本發明所述雜交免疫缺陷病毒RT-SHIV/AE是在猴免疫缺陷病毒SIVmac239的基因組框架上，以CRE-01AE亞型的HIV-1的基因片段取代SIVmac239的基因構成，其攜帶AE亞型HIV-1的逆轉錄酶基因，能體外感染恒河猴PBMC并高效復制。本發明所述雜交免疫缺陷病毒RT-SHIV/AE感染恒河猴建立的AIDS猴模型，適用于研究針對中國患者的艾滋病病毒的體內感染過程、病原特性、發病機制以及篩選和評價抗逆轉錄酶抑制劑。
文檔編號A01K67/027GK102154356SQ20111000281
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月7日 優先權日2011年1月7日
發明者叢喆, 姚南, 王衛, 秦川, 蔣虹, 魏強 申請人:中國醫學科學院醫學實驗動物研究所