本發明屬于中藥
技術領域：
，涉及一種治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑及其制備方法。
背景技術：
：禽流感是禽流行性感冒的簡稱，它是由甲型流感病毒的一種亞型引起的一種急性傳染病，也能感染人類，被國際獸疫局定為甲類傳染病，又稱真性雞瘟或歐洲雞瘟。人感染后的癥狀主要表現為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數伴有嚴重的肺炎，嚴重者心、腎等多種臟器衰竭導致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率約為33％。此病可通過消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結膜等多種途徑傳播。如今家禽養殖業的擴大發展對預防及治療禽流感的藥物需求量大，但是目前的中醫藥的生產限制，使所需的中藥治療藥物的生產效率低，且藥效低。技術實現要素：基于以上問題，本發明其一目的是提供一種治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑；再一目的是提供一種制備上述治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的方法，該制備方法利用具有突出藥效的細菌，一次性發酵復方中藥制劑，制成高效中藥發酵液，可以有效提取中藥中的活性組分，顯著增強中藥制劑的藥效，實現最好的治療效果，同時解決了中藥制劑工業大規模生產的瓶頸問題。根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑，所述中藥的原料以重量份計包括：連翹15-25份、黃芩20-28份、白術15-25份、生石膏30-40份、甘草3-10份、知母15-20份和梔子25-30份。根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑，進一步優選，所述中藥的原料以重量份計包括：連翹23份、黃芩23份、白術23份、生石膏36份、甘草6份、知母18份和梔子27份。根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的制備方法，所述中藥的原料以重量份計包括：連翹15-25份、黃芩20-28份、白術15-25份、生石膏30-40份、甘草3-10份、知母15-20份和梔子25-30份。所述制備方法包括以下步驟：(1)制備中藥原料細粉，將所述中藥原料清洗、烘干后進行粉碎；(2)提取藥液，將步驟(1)制得的中藥原料細粉蒸煮并過濾，得到藥液，得到的所述藥液與所述中藥原料的重量比為8-12:1；(3)殺菌，將步驟(2)得到的藥液進行殺菌消毒；(4)均衡營養源，向經步驟(3)殺菌消毒后的藥液檢測各種營養源數據，如碳、氮、磷、鉀和其他微量元素，根據藥液中實際碳氮比，碳含量少時加入碳源，氮含量少時加入氮源，均衡碳氮比至30-35:1；(5)發酵，向經步驟(4)均衡營養源后的藥液中加發酵菌，進行發酵，至所述藥液中的活性成分大于等于11wt％時，得到所述治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑。根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的制備方法，可以有效提取中藥原料中的活性成分，保證得到的所述中藥制劑治療禽流感的藥效得到最大程度的保留。根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的制備方法，為了保證所述中藥原料制備得到在步驟(1)中，所述中藥原料粉碎后過80-150目篩。根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的制備方法，為了將所述中藥原料的有效活性成分進行高效提取，得到藥效優異的藥液，在步驟(2)中，將所述中藥原料細粉裝入180-250目的蒸煮袋中蒸煮2-3小時，然后自沉2-3小時后，取上清液，得到藥液。根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的制備方法，為了去除藥液內的雜菌，不影響藥液的藥效，在步驟(3)中，將步驟(2)得到的藥液在95-100℃下消毒20-40分鐘。根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的制備方法，基于加入的碳源和氮源不影響藥液藥效，同時對身體無害的目的，在步驟(4)中，所述碳源為葡萄糖，所述氮源為蛋白胨。根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的制備方法，為了保持較高的發酵效率、增強藥效，在步驟(5)中，所述發酵菌與所述藥液的重量比為4-5:100。根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的制備方法，在步驟(5)中，所述發酵菌為枯草芽孢桿菌或黑曲霉菌與木犀草科植物或菊科植物通過細胞融合得到的融合細胞發酵菌。所述的融合細胞發酵菌發酵的所述治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑具有很強的藥效，比一般的沒有經過本發明發酵制備的中藥制劑藥效增強20-25倍。所述木犀草科植物為連翅或女貞子，所述菊科植物為野白菊，千里光或白術。根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的制備方法，所述融合細胞發酵菌通過聚乙二醇誘導細胞融合法得到。根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的制備方法，為了保證所述藥液在合適的ph環境下發酵，還包括在步驟(5)發酵前，檢測所述藥液的ph值，加入食品級ph調節劑的步驟，其中，調節所述藥液的ph為6.5-7.5。所述食品級ph調節劑優選氫氧化鈣、乳酸鈣或磷酸三鈣。根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的制備方法，為了保證所述藥液可以充分發酵，得到品質好的發酵中藥，使中藥的有效成分更易被吸收，增強藥效，并且分解中藥毒性、改善中藥口味，在步驟(5)中，在25-37℃、30-40rpm、溶氧量為5-6ml/l的條件下發酵68-75小時。為了便于方便理解本發明的技術方案，對本發明中涉及的中藥組分及功效做簡要說明：連翹：性味苦，微寒，主要功效為清熱解毒，消腫散結。用于治療癰疽，瘰癘，乳癰，丹毒，風熱感冒，溫病初起，溫熱入營，高熱煩渴，神昏發斑，熱淋尿閉。黃芩：性味苦，寒，主要功效為清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎。用于治療濕溫、暑溫胸悶嘔惡，濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，肺熱咳嗽，高熱煩渴，血熱吐衄，癰腫瘡毒，胎動不安。白術：性味苦、甘，溫，主要功效為健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎。用于治療脾虛食少，腹脹泄瀉，痰飲眩悸，水腫，自汗，胎動不安。生石膏：性味甘、辛，大寒，主要功效為清熱瀉火，除煩止渴。用于治療外感熱病，高熱煩渴，肺熱喘咳，胃火亢盛，頭痛，牙痛。甘草：性味甘，平，主要功效為補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥。用于治療脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛，癰腫瘡毒，緩解藥物毒性、烈性。知母：性味苦、甘，寒，主要功效為清熱瀉火，生津潤燥。用于外感熱病，高熱煩渴，肺熱燥咳，骨蒸潮熱，內熱消渴，腸燥便秘。梔子：性味苦，寒，主要功效為：瀉火除煩，清熱利尿，涼血解毒。用于熱病心煩，黃疸尿赤，血淋澀痛，血熱吐衄，目赤腫痛，火毒瘡瘍；外治扭挫傷痛。本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑重在解表、解毒、清熱、瀉火、殺菌、化痰，健脾驅濕、由表及里、標本兼治、扶正祛邪，平陰陽、調虛實，全面進行整體調整，使肌體達到最佳功能狀態。本發明的中藥原料中的連翹清熱、黃芩與連翹、梔子相使，增強清熱功能，同時清肺肝膽熱；甘草清熱解毒、石膏清胃熱，白術與甘草相須，健脾益氣，知母與甘草相須，清胃潤腸。本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的用藥方法為：預防家禽禽流感：將本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑和水以1:1000的體積比混兌，給家禽飲用；治療家禽禽流感：以本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑以2:1000的體積比混兌，給患病家禽飲用。本發明的有益效果為：根據本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑，中藥組分科學配伍，藥效較傳統中藥藥效大大增強，可有效抑制和殺滅禽流感病毒的繁殖，有效治療禽流感。本發明的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑的制備方法，將中藥組分中的有效成分進行提取后，再經特殊菌群的綜合發酵，制取的復方中藥發酵制劑的藥效較傳統中藥液提高20-25倍，將大分子物質轉化成小分子，分解毒性，改善口味，利于吸收；另外生產成本降低了近70％，節約中藥材80％以上。具體實施方式為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明的技術方案進行詳細的描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬于本發明所保護的范圍。以下實施例以1份為1噸。實施例1本發明提供一種治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑，所述中藥的原料以重量份計包括：連翹15份、黃芩28份、白術15份、生石膏40份和甘草3份、知母20份和梔子25份。所述中藥制劑的制備方法，包括以下步驟：(1)制備中藥原料細粉，將所述中藥原料進行烘干、粉碎后過150目篩；(2)提取藥液，將步驟(1)制得的中藥原料細粉裝入180目的蒸煮袋，在蒸汽罐中蒸煮3小時提取藥液，然后將藥液入沉淀罐自沉2小時后，取上清液，得到藥液，得到的所述藥液與所述中藥原料的重量比為8:1；(3)殺菌，將步驟(2)得到的藥液移入發酵罐，在100℃下進行殺菌消毒20分鐘；(4)均衡營養源，將經步驟(3)殺菌消毒后的藥液檢測各種營養源數據，如碳、氮、磷、鉀和其他微量元素，加入葡萄糖，均衡碳氮比至30:1；(5)發酵，向經步驟(4)均衡營養源后的藥液中加入食品級ph調節劑調節所述藥液的ph為6.5，然后加入融合細胞發酵菌，在37℃、轉速30rpm、溶氧量為5ml/l的條件下發酵75小時至所述藥液中的活性成分大于等于11wt％時，得到所述治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑。所述細胞融合發酵菌為枯草芽孢桿菌與連翹植物細胞通過聚乙二醇誘導細胞融合法制得，所述細胞融合發酵菌與所述藥液的重量比為5:100。實施例2本發明提供一種治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑，所述中藥的原料以重量份計包括：連翹25份、黃芩20份、白術25份、生石膏30份和甘草10份、知母15份和梔子30份。所述中藥制劑的制備方法，包括以下步驟：(1)制備中藥原料細粉，將所述中藥原料進行烘干、粉碎后過80目篩；(2)提取藥液，將步驟(1)制得的中藥原料細粉裝入250目的蒸煮袋，在蒸汽罐中蒸煮2小時提取藥液，然后將藥液入沉淀罐自沉3小時后，取上清液，得到藥液，得到的所述藥液與所述中藥原料的重量比為12:1；(3)殺菌，將步驟(2)得到的藥液移入發酵罐，在95℃下進行殺菌消毒40分鐘；(4)均衡營養源，將經步驟(3)殺菌消毒后的藥液檢測各種營養源數據，如碳、氮、磷、鉀和其他微量元素，加入蛋白胨，均衡碳氮比至35:1；(5)發酵，向經步驟(4)均衡營養源后的藥液中加入食品級ph調節劑調節所述藥液的ph為7.5，然后加入融合細胞發酵菌，在25℃、轉速36rpm、溶氧量為6ml/l的條件下發酵68小時至所述藥液中的活性成分大于等于11wt％時，得到所述治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑。所述細胞融合發酵菌為黑曲霉菌與野白菊植物細胞通過聚乙二醇誘導細胞融合法制得，所述細胞融合發酵菌與所述藥液的重量比為4:100。所述細胞融合發酵菌還可通過黑曲霉菌與連翹或女貞子或千里光或白術的植物細胞通過聚乙二醇誘導細胞融合法制得。實施例3本發明提供一種治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑，所述中藥的原料以重量份計包括：連翹23份、黃芩23份、白術23份、生石膏36份、甘草6份、知母18份和梔子27份。所述中藥制劑的制備方法，包括以下步驟：(1)制備中藥原料細粉，將所述中藥原料進行烘干、粉碎后過100目篩；(2)提取藥液，將步驟(1)制得的中藥原料細粉裝入200目的蒸煮袋，在蒸汽罐中蒸煮2小時提取藥液，然后將藥液入沉淀罐自沉2小時后，取上清液，得到藥液，得到的所述藥液與所述中藥原料的重量比為10:1；(3)殺菌，將步驟(2)得到的藥液移入發酵罐，在98℃下進行殺菌消毒30分鐘；(4)均衡營養源，將經步驟(3)殺菌消毒后的藥液檢測各種營養源數據，如碳、氮、磷、鉀和其他微量元素，加入葡萄糖，均衡碳氮比至32:1；(5)發酵，向經步驟(4)均衡營養源后的藥液中加入食品級ph調節劑調節所述藥液的ph為6.8，然后加入融合細胞發酵菌，在30℃、轉速40rpm、溶氧量為5ml/l的條件下發酵72小時至所述藥液中的活性成分大于等于11wt％時，得到所述治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑。所述細胞融合發酵菌為枯草芽孢桿菌與千里光植物細胞通過聚乙二醇誘導細胞融合法制得，所述細胞融合發酵菌與所述藥液的重量比為5:100。所述細胞融合發酵菌還可通過枯草芽孢桿菌與女貞子或野白菊或白術的植物細胞通過聚乙二醇誘導細胞融合法制得。實驗例一、材料與方法1.1毒株h9病毒流行毒株1167，由山東省農業科學院保存，測定病毒對spf雞胚的半數致死量為(eid50)5.1×109.5/ml，對spf雞半數致死量(ld50)。ibv病毒由山東省農業科學院保存，測定對spf雞的半數致死量為(ld50:6.1×109.5/ml)1.2雞胚和雞spf雞胚、spf雞購自山東省斯派福瑞禽業科技有限公司。spf雞飼養在不銹鋼正壓隔離器中，空氣經過過濾除菌，飲水和飼料經過消毒處理后通過傳遞艙進入飼養室，所有試驗均在生物安全三級實驗室進行，攻毒試驗均在山東農科院家禽研究所spf隔離罩內進行。1.3實驗方法1.3.1本發明實施例1-3所制備的治療禽流感的復方中藥生物發酵制劑命名為l，研究其對h9禽流感病毒在雞胚內復制的抑制作用把h9禽流感病毒按照10倍倍比稀釋，每個稀釋度分別取500ul與等量的中藥制劑l混勻，在室溫作用30min，取0.2ml混和液接種9日齡spf雞胚，每個稀釋度接種8枚spf雞胚；對照組直接用105.5eid50的病毒液接種10枚spf雞胚。放置37℃溫箱孵化，72h后無菌收每個雞胚尿囊液，用0.75％雞紅細胞測尿囊液血凝價，并記錄，結果如表2所示。1.3.2中藥制劑l對spf雞的ibv病毒、h9禽流感病毒攻毒保護試驗將spf雞分為4組，每組13只，12日齡時進行人工感染h9和ibv病毒，在感染后第二天，人工灌服中藥制劑l，連續觀察5天，記錄其精神狀況、死亡情況、是否咳嗽、死亡的解剖觀察腎臟病變等情況，7天后每組隨機挑取3只解剖觀察病變情況。試驗結束后，剩余雞只使用安樂死后高壓滅菌處理。實驗分組如表1所示：表1組別攻毒情況中藥制劑l使用劑量ⅰ組h9和ibv病毒0.1ml/只ⅱ組h9和ibv病毒0.3ml/只ⅲ組h9和ibv病毒0.5ml/只ⅳ組h9和ibv病毒-二、試驗結果2.1中藥制劑l對h9禽流感病毒在雞胚內復制的抑制作用實驗結果見表2，可以看出，本發明的中藥制劑10倍稀釋的病毒稀釋液有抑制效果，病毒不能在雞胚內復制，因此，本發明的中藥制劑對禽流感病毒有抑制效果；本發明的中藥制劑抑制低致病性h9禽流感病毒在雞胚內復制的最高濃度是：5.1×108.5/ml。中藥+病毒接種雞胚結果如表2所示：表2中藥制劑l原液+倍稀釋病毒雞胚ha血凝病毒稀釋梯度1中藥制劑l+等量5.1×109.5/ml++++++++病毒原液2中藥制劑l+等量5.1×108.5/ml--------10倍稀釋液3中藥制劑l+等量5.1×107.5/ml--------102倍稀釋液4中藥制劑l+等量5.1×106.5/ml--------103倍稀釋液5中藥制劑l+等量5.1×105.5/ml--------104倍稀釋液6中藥制劑l+等量5.1×104.5/ml--------105倍稀釋液7中藥制劑l+等量5.1×103.5/ml--------106倍稀釋液8中藥制劑l+等量5.1×102.5/ml--------107倍稀釋液9中藥制劑l+等量5.1×101.5/ml--------108倍稀釋液10中藥制劑l+等量5.1×100.5/ml--------109倍稀釋液11對照(不加中藥的h9病毒)++++++++105.5eid50注：“+”，表示每個雞胚尿囊液有血凝性，“-”表示每個雞胚尿囊液無血凝性2.2中藥制劑l對spf雞的ibv病毒、h9禽流感病毒攻毒保護試驗使用h9和ibv攻毒后5天，對照組出現現采食量下降、咳嗽、流鼻液癥狀，實驗組上述癥狀比對照輕，觀察期間對照組出現3只死亡，實驗ⅰ組和ⅱ組均出現1只死亡，實驗ⅲ組沒有死亡，對死亡雞解剖發現對照組均出現花斑腎、腎腫癥狀、氣管環出血，實驗組死亡肉雞出現腎腫，輕微花斑腎，氣管出血。實驗分組如表3所示：表3組別樣本量中藥制劑l使用劑量死淘數量ⅰ組130.1ml/只1ⅱ組130.3ml/只1ⅲ組130.5ml/只0ⅳ組13-3以上實驗結果表明，本發明中藥制劑l對ibv病毒和h9禽流感病毒有顯著的抑制功效，可以在家禽飼養過程中起到有效的治療和預防禽流感病毒的作用。以上所述，僅為本發明的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術領域：
的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。當前第1頁12