本發明涉及生物制藥(yao)領域，具體涉及一(yi)種免疫增強劑、口(kou)蹄疫滅(mie)活疫苗(miao)及其制備方法(fa)。
背景技術：
口蹄(ti)疫(yi)(yi)(foot-and-mouthdisease,fmd)是(shi)由口蹄(ti)疫(yi)(yi)病(bing)(bing)毒(du)(foot-and-mouthdiseasevirus,fmdv)引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性的傳染病(bing)(bing)。口蹄(ti)疫(yi)(yi)病(bing)(bing)毒(du)屬小(xiao)rna病(bing)(bing)毒(du)科(picornaviridae)口蹄(ti)疫(yi)(yi)病(bing)(bing)毒(du)屬(aphthavirus)，有7個血(xue)清(qing)型(xing)：a、o、c、sat1、sat2、sat3以(yi)及asia1型(xing)，每個血(xue)清(qing)型(xing)又包含若干個亞(ya)型(xing)。該病(bing)(bing)毒(du)不僅(jin)在(zai)各型(xing)間沒有交叉免疫(yi)(yi)性，同血(xue)清(qing)型(xing)的各亞(ya)型(xing)之間也僅(jin)有部分交叉免疫(yi)(yi)性。2012年，國(guo)務院辦公廳印發了《國(guo)家中長期動(dong)物(wu)疫(yi)(yi)病(bing)(bing)防(fang)治(zhi)規劃(2012—2020年)》，將口蹄(ti)疫(yi)(yi)列為優先(xian)防(fang)治(zhi)病(bing)(bing)種之一。
在我國，口(kou)蹄疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)屬(shu)于強制(zhi)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)，滅(mie)(mie)活(huo)(huo)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)是目前使(shi)用的(de)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)主體，但(dan)其(qi)也(ye)有如抗(kang)體產生(sheng)慢、免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)期(qi)(qi)短、抗(kang)原譜(pu)窄，滅(mie)(mie)活(huo)(huo)不徹底(di)等不足(zu)之處。現在，許多研究人員正在改進和研究新的(de)滅(mie)(mie)活(huo)(huo)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)，如新的(de)流(liu)行毒株，生(sheng)產工(gong)藝(yi)，使(shi)抗(kang)原更純，免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)效(xiao)果更好，佐(zuo)劑更有效(xiao)，滅(mie)(mie)活(huo)(huo)更加可靠等，但(dan)每項(xiang)工(gong)藝(yi)的(de)研究周期(qi)(qi)和驗證周期(qi)(qi)都比較長。而豬群常規的(de)口(kou)蹄疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)次(ci)數一(yi)般要免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)2～3次(ci)，但(dan)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)保護持續期(qi)(qi)僅3～4個(ge)月，加強免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)后保護效(xiao)力也(ye)最高僅為70～80％。因此，口(kou)蹄疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)存(cun)在很大的(de)質量提升空間，免(mian)(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)增強劑改進是可行技(ji)術途徑之一(yi)。
黃芪多糖可顯著(zhu)增(zeng)強(qiang)非(fei)特異性免疫功(gong)(gong)能(neng)和(he)體(ti)液免疫功(gong)(gong)能(neng)，黃芪多糖能(neng)誘導機(ji)體(ti)產(chan)生干擾(rao)素，干擾(rao)病毒(du)在(zai)機(ji)體(ti)內(nei)的(de)復制，提(ti)高機(ji)體(ti)的(de)免疫功(gong)(gong)能(neng)；并能(neng)強(qiang)化和(he)刺(ci)激淋巴細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)網(wang)狀內(nei)皮層細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)生成，增(zeng)強(qiang)網(wang)狀內(nei)皮層細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)巨噬細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)吞噬功(gong)(gong)能(neng)，并對體(ti)液、粘膜(mo)和(he)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)免疫有(you)很好的(de)促進(jin)和(he)調節作(zuo)用(yong)。作(zuo)為(wei)(wei)飼(si)料添(tian)加劑在(zai)動物養殖上的(de)應用(yong)，具有(you)促進(jin)動物生長，提(ti)高機(ji)體(ti)抵抗力(li)(li)等效(xiao)力(li)(li)。其作(zuo)為(wei)(wei)天然(ran)產(chan)品具有(you)來(lai)源豐富、價(jia)(jia)格低廉(lian)、長期使用(yong)對組織(zhi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)毒(du)副作(zuo)用(yong)小、殘留低。然(ran)而在(zai)飼(si)料或飲水中添(tian)加量較(jiao)大，基本(ben)用(yong)量至少(shao)為(wei)(wei)克/天，造(zao)成較(jiao)大的(de)浪費且(qie)免疫增(zeng)強(qiang)效(xiao)力(li)(li)不確實或者較(jiao)難評(ping)價(jia)(jia)。
toll樣受體(tlr)是存在(zai)于哺乳動物免(mian)疫(yi)細胞的一類跨膜蛋白，其(qi)主(zhu)要免(mian)疫(yi)學功能(neng)是監視(shi)與(yu)識(shi)別各種(zhong)不同(tong)的病原微生(sheng)物相關分子(tlr激動劑)，快速誘發先天(tian)性免(mian)疫(yi)反(fan)應(ying)，為抗原特異性獲得性免(mian)疫(yi)反(fan)應(ying)打下基礎。tlr激動劑應(ying)用(yong)于獸用(yong)疫(yi)苗研究(jiu)多處(chu)于實驗室階段，大量研究(jiu)結果表明tlr激動劑可(ke)以用(yong)于疫(yi)苗免(mian)疫(yi)增(zeng)強(qiang)劑。在(zai)疫(yi)苗中添加tlr激動劑，例(li)如(ru)cpg、polyi:c、咪(mi)喹(kui)莫特等，均有明顯的免(mian)疫(yi)增(zeng)強(qiang)效力。其(qi)中tlr4激動劑已于2009年批(pi)準應(ying)用(yong)于乙(yi)型肝(gan)炎和人乳頭瘤病毒疫(yi)苗。
現存的主(zhu)要(yao)應用(yong)瓶頸是(shi)多數tlr激動(dong)劑制造成本太高問題。
技術實現要素：
發(fa)(fa)明目的(de)：本發(fa)(fa)明所要解決(jue)的(de)技術(shu)問題是提(ti)供(gong)了一(yi)種復方免疫增強(qiang)(qiang)劑(ji)。本發(fa)(fa)明在(zai)于提(ti)供(gong)一(yi)種復方免疫增強(qiang)(qiang)劑(ji)，使(shi)用微量(liang)tlr激(ji)動劑(ji)，配合使(shi)用微量(liang)中(zhong)藥免疫增強(qiang)(qiang)劑(ji)黃芪(qi)多糖(tang)可以產生協(xie)同增效作用，不(bu)僅降低(di)了單獨使(shi)用tlr激(ji)動劑(ji)類免疫增強(qiang)(qiang)劑(ji)的(de)成本，也(ye)提(ti)高了免疫效力，更好的(de)提(ti)高了口(kou)蹄(ti)疫疫苗的(de)免疫效果，對(dui)于仔豬可以一(yi)針保護到出欄，同時縮短(duan)抗體(ti)產生的(de)窗口(kou)期至7天，抗體(ti)持(chi)續(xu)期延(yan)長至8個月以上，顯著(zhu)降低(di)養豬成本。
本發(fa)明還(huan)要解決的技(ji)術問題是提供了復方免疫增(zeng)強劑的制備方法(fa)。
本發(fa)明還要解(jie)決的技術問題是提供(gong)了含復方免疫(yi)增強劑的口(kou)蹄疫(yi)滅活疫(yi)苗。
本發明還要解決(jue)的技術(shu)問題是提供了含復(fu)方(fang)免(mian)疫增強劑的口蹄疫滅活疫苗(miao)的制備方(fang)法。
技(ji)術(shu)方(fang)(fang)案(an)：為了解(jie)決上述問題，本發明的技(ji)術(shu)方(fang)(fang)案(an)是提供一種復(fu)方(fang)(fang)免(mian)疫(yi)增(zeng)強劑(ji)，所述復(fu)方(fang)(fang)免(mian)疫(yi)增(zeng)強劑(ji)含有單磷(lin)酰脂(zhi)a5～520μg/ml、胞壁酰二肽10～520μg/ml、β-葡聚(ju)糖1～520μg/ml和黃芪多糖0.05～5.2mg/ml。
其(qi)中(zhong)，作(zuo)為優選，上述免疫增強劑含有單磷酰(xian)脂(zhi)a單磷酰(xian)脂(zhi)a5～500μg/ml、胞壁酰(xian)二肽10～500μg/ml、β-葡聚糖1～500μg/ml和黃芪多(duo)糖0.05～5.0mg/ml。
其(qi)中，作為優選，所述免疫增強劑含有單磷酰脂a100～500μg/ml、胞壁酰二(er)肽100～500μg/ml、β-葡聚糖50～500μg/ml和黃芪多糖1～5.0mg/ml。
本發明內容還包括上述的免疫(yi)增強劑的制(zhi)備方(fang)法，包括以下步驟：
1).配制(zhi)含有單磷酰脂質a、胞壁(bi)酰二肽、β-葡聚糖和黃芪多糖的溶(rong)(rong)液，與吐(tu)溫-80混合，得到成(cheng)水相溶(rong)(rong)液；
2).將白油(you)(you)和司盤-80混合(he)，得到油(you)(you)相(xiang)溶液(ye)；
3).將所述水相溶液與油相溶液混合乳化(hua)后得到含(han)復(fu)方免(mian)疫(yi)增強劑的伴侶疫(yi)苗。
本發明內容還(huan)包(bao)括上述(shu)的(de)(de)免疫(yi)(yi)增強劑在制備(bei)疫(yi)(yi)苗方面(mian)的(de)(de)應用。
本發明內(nei)容(rong)還包括上述(shu)的一種含有所述(shu)的含復(fu)方免疫(yi)增(zeng)強劑(ji)的口蹄疫(yi)滅活疫(yi)苗。
其中，上述口蹄疫(yi)滅活(huo)(huo)疫(yi)苗還(huan)包括滅活(huo)(huo)的抗原溶液。
其中(zhong)，上(shang)述口蹄疫滅活疫苗中(zhong)的(de)滅活的(de)抗原溶(rong)液與復方免疫增強劑(ji)的(de)體積(ji)比為9:1～8:1。
其(qi)中，上述滅活的抗(kang)原溶液為(wei)含(han)o，a，亞i型口蹄疫(yi)滅活抗(kang)原、多肽或(huo)其(qi)他基因工(gong)程(cheng)表(biao)達(da)產物(wu)中的一種或(huo)幾(ji)種。
本發明內容還包(bao)括上(shang)述含復方(fang)免(mian)疫增強劑(ji)的口(kou)蹄疫滅(mie)活疫苗(miao)的制備方(fang)法，包(bao)括以下步驟：
1)將復(fu)方免疫增強劑與滅活的(de)抗(kang)原溶液(ye)混合(he)，再與吐溫-80混合(he)得(de)到水相溶液(ye)；
2)將白(bai)油(you)和司盤-80混(hun)合，得到油(you)相溶液；
3)將所(suo)述水相(xiang)溶液(ye)與油相(xiang)溶液(ye)充分混合(he)即得含(han)復方免疫增強劑(ji)的口(kou)蹄(ti)疫滅活疫苗。
有益效果(guo)：本發明相對于現有技(ji)術，具有以(yi)下優點：
1、本發明(ming)研制(zhi)了一(yi)種復方免(mian)疫增(zeng)強劑，將(jiang)其與口蹄(ti)疫滅活疫苗混合后(hou)使用可以有效的(de)提高疫苗的(de)效力，不但可以提高抗體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)合格(ge)率(lv)和平均抗體(ti)(ti)(ti)(ti)水平，還可以明(ming)顯的(de)縮短抗體(ti)(ti)(ti)(ti)產生的(de)窗口期至7天(tian)，同時提高抗體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)持續期至7個月以上。
2、黃芪(qi)多糖來源豐富、價格低(di)廉、長期使(shi)用(yong)對組(zu)織細胞毒副作用(yong)小(xiao)、殘留低(di)，添(tian)加少量(liang)(liang)黃芪(qi)多糖可以明顯降(jiang)低(di)其他三種toll樣受(shou)體激動(dong)劑的用(yong)量(liang)(liang)，降(jiang)低(di)了(le)90％的生產成本，但免疫(yi)效力卻沒有下降(jiang)。
3、本發明的(de)復方免疫增強劑和口蹄疫滅活疫苗(miao)聯合使用，可(ke)以(yi)明顯(xian)提高疫苗(miao)的(de)免疫效力，豬(zhu)場(chang)可(ke)以(yi)根(gen)據自身情況減(jian)(jian)少疫苗(miao)免疫次數，從而減(jian)(jian)少養殖成本，減(jian)(jian)少豬(zhu)群應激。
附圖說明
圖1含復方免疫(yi)增強劑(ji)疫(yi)苗免疫(yi)后的(de)平均抗體水平及抗體持續期；具體為各(ge)組(zu)含不同復方免疫(yi)增強劑(ji)組(zu)分的(de)o型fmd滅活(huo)疫(yi)苗免疫(yi)仔豬后不同時(shi)間點的(de)平均液(ye)相阻斷
elisa抗體(ti)水(shui)平(ping)。
具體實施方式
下(xia)面(mian)結合(he)附圖對(dui)本發明作更(geng)進一步的說明。
實施例1：復方免疫增(zeng)強劑、口蹄(ti)疫疫苗的制備
1、實驗材料
單磷酰脂質a縮寫為mpl。
胞壁酰二肽縮(suo)寫為(wei)mdp。
mpl、mdp和β-葡聚糖均購(gou)自invivogen公司(si)。
黃(huang)芪多糖購(gou)自陜西(xi)正大生物科技(ji)有限公司。
isa206購自賽百克(ke)公(gong)司，白(bai)油，司本，吐溫為本實驗室(shi)自行采購。
滅活的豬o型口蹄疫病毒(du)液(毒(du)株為(wei)豬o型口蹄疫病毒(du)緬甸98株)，經二乙烯亞胺滅活，146s含量為(wei)5.87μg/ml，內蒙古(gu)金宇集團(tuan)惠贈(zeng)。
商品化的(de)口蹄(ti)疫o、a、亞i三價疫苗購自內(nei)蒙古金宇集(ji)團。
6-7周齡健(jian)康易感仔豬，液相阻斷elisa抗體滴度≤1:8。
本發明(ming)采(cai)用口蹄疫液(ye)相(xiang)阻斷elisa試劑盒(蘭州獸醫研究所)檢測液(ye)相(xiang)阻斷elisa抗體滴(di)度。
1、免疫增強(qiang)劑的配置
免疫(yi)增強劑的主要成(cheng)份為：單磷酰(xian)脂質a(mpl)，胞壁酰(xian)二肽(mdp)，β-葡(pu)聚糖和黃芪多(duo)糖。其制備方法為將各主要成(cheng)份溶解于ph8.0的0.1mtris-hcl中。
復方免疫增強劑(ji)1：配(pei)置mpl、mdp、β-葡(pu)聚糖和黃芪多糖終濃(nong)度(du)分別為5μg/ml、10μg/ml、1μg/ml和0.05mg/ml。
復方免疫增強(qiang)劑2：配置mpl、mdp、β-葡聚糖和(he)黃芪(qi)多糖終濃度分別為(wei)100μg/ml、100μg/ml、50μg/ml和(he)1mg/ml。
復方(fang)免疫增強劑3：配置mpl、mdp、β-葡聚(ju)糖和黃芪多糖終濃(nong)度分別為500μg/ml、500μg/ml、500μg/ml和5mg/ml。
復(fu)方免疫增強劑4：配置mpl、mdp、β-葡聚(ju)糖(tang)和黃芪多糖(tang)終濃(nong)度分(fen)別(bie)為5μg/ml、10μg/ml、1μg/ml和20mg/ml。
復方免疫增強劑5：配置(zhi)mpl、mdp、β-葡(pu)聚糖和黃芪多糖終濃度分別為500μg/ml、500μg/ml、500μg/ml和20mg/ml。
免疫增強劑6：配置(zhi)黃芪多糖終(zhong)濃度為20mg/ml。
免疫增強(qiang)劑(ji)7：配置黃芪(qi)多糖終濃度(du)為5mg/ml。
免疫(yi)增強劑8：配置mpl、mdp、β-葡聚糖終濃度分(fen)別為2mg/ml、40mg/ml、0.2mg/ml。
將配制好(hao)的復方免疫增強劑過濾(0.22μm濾器)除(chu)菌后分裝至(zhi)青瓶中(zhong)，4℃保存(cun)。
口蹄疫疫苗制備方法
第一種方法：制(zhi)備(bei)(bei)復(fu)(fu)(fu)方免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)增強(qiang)劑伴(ban)侶(lv)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)，即(ji)復(fu)(fu)(fu)方免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)增強(qiang)劑與(yu)吐溫按照(zhao)體(ti)積(ji)(ji)比(bi)為96:4，充分(fen)混合(he)均勻做(zuo)為水(shui)相；白油(you)與(yu)司本按照(zhao)體(ti)積(ji)(ji)比(bi)96:4混合(he)均勻作為油(you)相；按照(zhao)水(shui)相：油(you)相體(ti)積(ji)(ji)比(bi)為1:2進行疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)制(zhi)備(bei)(bei)，制(zhi)備(bei)(bei)成的(de)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)即(ji)為復(fu)(fu)(fu)方免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)增強(qiang)劑伴(ban)侶(lv)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)。復(fu)(fu)(fu)方免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)增強(qiang)劑伴(ban)侶(lv)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)使用前按照(zhao)體(ti)積(ji)(ji)比(bi)1:9與(yu)商品化疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)充分(fen)混勻即(ji)可。
第二種方法(fa)：將復方免疫(yi)增強劑與滅活的豬o型口(kou)蹄(ti)疫(yi)病毒(du)液(ye)按照(zhao)體(ti)積比為1:9充分(fen)(fen)混(hun)合，制(zhi)備為水(shui)相(xiang)溶液(ye)。先將isa206和水(shui)相(xiang)溶液(ye)分(fen)(fen)別放(fang)置于室溫，大約30分(fen)(fen)鐘(zhong)。將isa206放(fang)入乳(ru)化(hua)罐(guan)中(zhong)，在200轉(zhuan)/分(fen)(fen)，將水(shui)相(xiang)溶液(ye)放(fang)入乳(ru)化(hua)罐(guan)中(zhong)，攪拌均勻；在2000轉(zhuan)/分(fen)(fen)攪拌10分(fen)(fen)鐘(zhong)，得到疫(yi)苗，其中(zhong)水(shui)相(xiang)與isa206的體(ti)積比為46:54。
采用上述兩(liang)種(zhong)方法制(zhi)備(bei)的疫苗，在復方免疫增(zeng)強劑終(zhong)濃度相(xiang)同(tong)的條件下，免疫效果上基本(ben)一致，只是(shi)方便(bian)生產(chan)上不(bu)同(tong)需求(qiu)的用戶使用。
本(ben)實施例中(zhong)，復方免(mian)疫增強劑(ji)的各組分可以在給出范(fan)圍內靈活配比，在此不(bu)一一列(lie)舉。
實施(shi)例2：復方(fang)免(mian)(mian)疫(yi)增強劑對口(kou)蹄疫(yi)滅活疫(yi)苗的免(mian)(mian)疫(yi)效力評價(jia)
1、疫苗制備
本實施例(li)按照實施例(li)1的第二種方法制備口蹄(ti)疫疫苗(miao)：
將(jiang)復(fu)方免(mian)疫(yi)(yi)增強劑(ji)1與(yu)滅活抗原按(an)照1:9混(hun)合后(hou)做(zuo)為(wei)(wei)水(shui)相(xiang)溶液，將(jiang)isa206放入乳(ru)化罐(guan)(guan)中，在200轉(zhuan)/分，將(jiang)水(shui)相(xiang)溶液放入乳(ru)化罐(guan)(guan)中，攪拌均(jun)勻(yun)，在2000轉(zhuan)/分攪拌10分鐘，制備成的口蹄疫(yi)(yi)滅活疫(yi)(yi)苗(miao)稱為(wei)(wei)含(han)復(fu)方免(mian)疫(yi)(yi)增強劑(ji)的fmd滅活疫(yi)(yi)苗(miao)1：簡稱fmd1。
復方免(mian)(mian)疫(yi)增強(qiang)劑(ji)2、3、4、5、6、7的疫(yi)苗制備(bei)方法同復方免(mian)(mian)疫(yi)增強(qiang)劑(ji)1，制備(bei)獲得含復方免(mian)(mian)疫(yi)增強(qiang)劑(ji)的fmd滅活疫(yi)苗2、3、4、5、6、7：簡稱fmd2、3、4、5、6、7。
將(jiang)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)增(zeng)(zeng)強(qiang)劑8與滅活(huo)抗原(yuan)按照1:1混合后，制備(bei)成的口蹄疫(yi)(yi)(yi)滅活(huo)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)稱(cheng)為含復(fu)方免(mian)疫(yi)(yi)(yi)增(zeng)(zeng)強(qiang)劑的fmd滅活(huo)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)8：簡稱(cheng)fmd8(按照專(zhuan)利(li)zl201310042983.0進(jin)行制備(bei)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)，將(jiang)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)增(zeng)(zeng)強(qiang)劑與滅活(huo)的豬口蹄疫(yi)(yi)(yi)病毒液按照體(ti)積(ji)比1:1混合，得(de)到水(shui)相(xiang)溶液。將(jiang)isa206和水(shui)相(xiang)溶液分(fen)別放(fang)(fang)(fang)置于室(shi)溫，大約(yue)30分(fen)鐘。將(jiang)isa206放(fang)(fang)(fang)入(ru)乳化罐中(zhong)，在200轉/分(fen)，將(jiang)水(shui)相(xiang)溶液放(fang)(fang)(fang)入(ru)乳化罐中(zhong)，攪(jiao)拌均勻，在2000轉/分(fen)攪(jiao)拌10分(fen)鐘，得(de)到疫(yi)(yi)(yi)苗(miao))。
將(jiang)0.1mph8.0的(de)tris-hcl與滅活抗原按照(zhao)1:9混合(he)后(hou)做為水相(xiang)溶液(ye)，將(jiang)isa206放入(ru)乳化罐中(zhong)，在(zai)(zai)200轉(zhuan)/分(fen)，將(jiang)水相(xiang)溶液(ye)放入(ru)乳化罐中(zhong)，攪拌(ban)均勻，在(zai)(zai)2000轉(zhuan)/分(fen)攪拌(ban)10分(fen)鐘，制備(bei)成(cheng)的(de)口蹄疫(yi)滅活疫(yi)苗稱為fmd對照(zhao)疫(yi)苗。
2、分組、免疫和抗體檢測
實(shi)驗分組(zu)及免疫(yi)：將健(jian)康易(yi)感(gan)仔豬隨機分組(zu)，每(mei)(mei)組(zu)10頭，共(gong)6組(zu)。每(mei)(mei)組(zu)疫(yi)苗各(ge)免疫(yi)一組(zu)健(jian)康易(yi)感(gan)仔豬，免疫(yi)劑量為2ml。
免疫后采血：
對免疫(yi)后的(de)抗(kang)體產生(sheng)情況進行監(jian)測(ce)：免疫(yi)后第7天(tian)、14天(tian)、21天(tian)和第28天(tian)，對各組健康易感仔豬采血分離血清(qing)，蘭(lan)獸研液相阻斷elisa抗(kang)體檢(jian)測(ce)試劑盒檢(jian)測(ce)疫(yi)苗免疫(yi)后的(de)抗(kang)體產生(sheng)情況和窗(chuang)口期(qi)；
對免疫(yi)后(hou)豬只進行抗(kang)體(ti)持續(xu)(xu)期(qi)監(jian)測(ce)：分別(bie)在免疫(yi)后(hou)28天(tian)(tian)、60天(tian)(tian)、90天(tian)(tian)、120天(tian)(tian)、150天(tian)(tian)、180天(tian)(tian)和210天(tian)(tian)分別(bie)采血，蘭獸研(yan)液(ye)相續(xu)(xu)斷elisa抗(kang)體(ti)檢測(ce)試劑盒檢測(ce)疫(yi)苗免疫(yi)后(hou)的抗(kang)體(ti)產(chan)生情況；
(當液相阻斷elisa抗體滴度大于等于26為抗體合格。)
免疫(yi)后(hou)抗體合格(ge)率如表(biao)1，表(biao)2所示。
免疫后的平均抗體水平如圖1所示。
表1各(ge)組仔豬(zhu)免疫后抗體合格率
備注：表(biao)1中7dpv、14dpv、21dpv、28dpv分(fen)別(bie)代表(biao)免(mian)(mian)疫(yi)后(hou)7天、免(mian)(mian)疫(yi)后(hou)14天、免(mian)(mian)疫(yi)后(hou)21天、免(mian)(mian)疫(yi)后(hou)28天；上/下數字分(fen)別(bie)代表(biao)：抗體達到合格線的豬的頭(tou)(tou)數/免(mian)(mian)疫(yi)豬的頭(tou)(tou)數；
從表1可以看出，免疫fmd對照疫苗的仔豬，在免疫后7天抗體10頭免疫豬的抗體僅有2頭達到合格線，合格率為2/10；單獨添加黃芪多糖為免疫增強劑的組別fmd6，在高劑量水平有一定的免疫增強作用，但是效果也不理想，明顯較fmd1/fmd2/fmd3組差(合格率8/10，8/10及9/10)；單獨的低劑量黃芪多糖組(fmd7)的免疫增強效果更差；高劑量的黃芪多糖與不同劑量的mpl、mdp和β-葡聚糖復配后(fmd4/fmd5)，沒有明顯的免疫增強作用，但更低劑量的黃芪多糖與低劑量的mpl、mdp和β-葡聚糖復配后(fmd1/fmd2/fmd3)，可以明顯縮短抗體的窗口期至7天，7天即可達到80％以上的抗體達到合格線以上(液相阻斷elisa抗體大于26)，且不降低抗(kang)體(ti)的合(he)格(ge)率(lv)(與(yu)fmd8比較)。fmd6組，也有明顯的免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)增強(qiang)水平，但(dan)是(shi)在(zai)抗(kang)體(ti)產生的窗口期上(shang)要比fmd1/fmd2/fmd3相對延(yan)后(hou)7天(tian)(tian)，在(zai)免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)后(hou)14天(tian)(tian)的抗(kang)體(ti)合(he)格(ge)率(lv)與(yu)復方(fang)(fang)免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)增強(qiang)劑(ji)1/2/3(fmd1/fmd2/fmd3)相當(dang)，在(zai)免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)后(hou)14天(tian)(tian)的抗(kang)體(ti)合(he)格(ge)率(lv)與(yu)對應的復方(fang)(fang)免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)增強(qiang)劑(ji)1，2，3(fmd1/fmd2/fmd3)組免(mian)(mian)(mian)(mian)疫(yi)后(hou)7天(tian)(tian)合(he)格(ge)率(lv)相當(dang)。
表2各組仔豬(zhu)免(mian)疫(yi)后抗體(ti)持(chi)續期(qi)內的(de)抗體(ti)合格率
從表2可(ke)以看(kan)出，復方免(mian)(mian)疫(yi)(yi)增(zeng)強劑(ji)配方1，2，3即fmd1/fmd2/fmd3三(san)組免(mian)(mian)疫(yi)(yi)后均(jun)可(ke)明(ming)顯延長疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)的(de)抗(kang)體持續期，監測至免(mian)(mian)疫(yi)(yi)后7個月抗(kang)體合格率(lv)無明(ming)顯下降，維持在(zai)10/10；而(er)fmd對(dui)照(zhao)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)最高(gao)合格率(lv)基本在(zai)3/10，單獨的(de)黃(huang)芪多(duo)糖(tang)組(fmd6/fmd7)，有一定的(de)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)增(zeng)強作用(yong)，但(dan)效果不(bu)明(ming)顯，與(yu)fmd對(dui)照(zhao)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)差異不(bu)顯著(zhu)。
從圖1可以看出，復方免疫增強劑1，2，3(fmd1/fmd2/fmd3)組及免疫增強劑8(fmd8)組可以明顯提高fmd疫苗的免疫效力，縮短抗體產生的窗口期，在免疫后7天，平均液相阻斷elisa抗體水平已高于26，遠遠高于對照疫苗組的23，提(ti)高(gao)平均(jun)抗(kang)體(ti)水平和抗(kang)體(ti)持續期。單獨的黃(huang)(huang)芪多糖(fmd6/fmd7)和高(gao)劑量黃(huang)(huang)多糖與(yu)mpl、mdp和β-葡(pu)聚(ju)糖配伍組(zu)(fmd4/fmd5)沒(mei)有明顯的免疫增強(qiang)效(xiao)果。
因此，由于復方免疫(yi)增強劑中添加了一定劑量(liang)的(de)黃芪多糖與mpl、mdp和β-葡聚糖的(de)協同效(xiao)應(ying)，能夠(gou)顯著提高(gao)仔豬對抗(kang)原的(de)免疫(yi)應(ying)答，提高(gao)抗(kang)體合格率和提早抗(kang)體產(chan)(chan)生時間，進而縮短疫(yi)苗(miao)(miao)產(chan)(chan)生抗(kang)體的(de)窗口期(qi)至免疫(yi)后7天，提高(gao)疫(yi)苗(miao)(miao)的(de)免疫(yi)效(xiao)果。
本(ben)實施例中，免疫(yi)增強劑的各組分可以在給出(chu)范圍內靈活配比，在此(ci)不一(yi)一(yi)列舉。
實施例(li)3：配制(zhi)復方免(mian)疫增強劑伴侶(lv)疫苗
1、復(fu)方免疫增強劑的配制：
復方(fang)免(mian)疫增強(qiang)劑的(de)(de)主(zhu)要成份為(wei)：單(dan)磷酰脂質a，胞壁酰二(er)肽(tai)，β-葡聚糖和黃芪(qi)多糖。其制備(bei)方(fang)法為(wei)將各主(zhu)要成份溶解于ph8.0的(de)(de)0.1mtris-hcl。
復(fu)方免(mian)疫增強(qiang)劑(ji)9：配(pei)置mpl、mdp、β-葡聚(ju)糖和(he)黃芪(qi)多糖終濃度分別為(wei)5.2μg/ml、10.4μg/ml、1.04μg/ml和(he)0.052mg/ml。
復(fu)方免疫增(zeng)強劑10：配置mpl、mdp、β-葡聚糖(tang)(tang)和(he)黃芪多糖(tang)(tang)終濃度(du)分別為104μg/ml、104μg/ml、52μg/ml和(he)1.04mg/ml。
復方免疫增強劑11：配(pei)置mpl、mdp、β-葡聚糖(tang)和(he)黃芪多糖(tang)終(zhong)濃度分別(bie)為520μg/ml、520μg/ml、520μg/ml和(he)5.2mg/ml。
將配(pei)制好的復(fu)方免疫增強劑過(guo)濾(0.22μm濾器)除(chu)菌后分裝(zhuang)至青瓶中，4℃保存。
2、復(fu)方(fang)免疫增強劑(ji)的伴侶疫苗(miao)制備：
(1)、將復(fu)方免疫(yi)增強(qiang)劑與吐(tu)溫(wen)按(an)照96:4進行混勻(yun)，制備為(wei)水相。
(2)、將(jiang)白油與司(si)本按照96:4進行充分(fen)混合。
(3)、將水相與油(you)相按照(zhao)體積比1:2充分混合制(zhi)備(bei)為(wei)含復發免(mian)疫(yi)(yi)增強(qiang)(qiang)劑(ji)(ji)的伴侶疫(yi)(yi)苗。按照(zhao)此方(fang)法(fa)制(zhi)備(bei)好復方(fang)免(mian)疫(yi)(yi)增強(qiang)(qiang)劑(ji)(ji)伴侶疫(yi)(yi)苗分別(bie)根據有復方(fang)免(mian)疫(yi)(yi)增強(qiang)(qiang)劑(ji)(ji)9、10、11制(zhi)備(bei)而來(lai)命名(ming)為(wei)復方(fang)免(mian)疫(yi)(yi)增強(qiang)(qiang)劑(ji)(ji)伴侶9、10、11。
3、使用方法
取300μl含復方免(mian)疫(yi)增強劑的伴侶疫(yi)苗(miao)(miao)與1頭份疫(yi)苗(miao)(miao)充分混合(he)后免(mian)疫(yi)。
本實施例中，復(fu)方免(mian)疫增(zeng)強劑的各組分可以在給出(chu)范圍內靈(ling)活配比(bi)，使用(yong)體積也可依據實際需要調(diao)整，在此(ci)不一一列舉(ju)。
實(shi)施例4復方免疫增強(qiang)劑伴侶疫苗(miao)對商品化o、a、亞i三價(jia)苗(miao)的免疫效力評價(jia)
1、疫苗制備：
復方免(mian)疫(yi)增強劑伴侶疫(yi)苗采用實(shi)施(shi)例3中制(zhi)備(bei)的三種伴侶疫(yi)苗。
三價疫苗(miao)(miao)為o，a，亞(ya)i三價滅活(huo)疫苗(miao)(miao)(精品苗(miao)(miao))批(pi)號5235039，20151224
2、分組、免疫和抗體(ti)檢測
實(shi)驗分組(zu)及免疫：將(jiang)健康易感仔豬隨機分組(zu)，每組(zu)10頭，共4組(zu)。
每組(zu)疫苗(miao)各免疫一組(zu)健康易(yi)感仔豬。
表3疫苗免疫及分組
免疫后采血：
對(dui)(dui)免疫(yi)后的抗體(ti)產(chan)生(sheng)情況進行監測：免疫(yi)后第7天、14天、21天和(he)第28天，對(dui)(dui)各組健康易感仔豬(zhu)采血分離血清，蘭獸研(yan)液(ye)相阻斷elisa抗體(ti)檢(jian)測試劑盒檢(jian)測疫(yi)苗免疫(yi)后的抗體(ti)產(chan)生(sheng)情況和(he)窗口(kou)期(qi)；
對免(mian)疫(yi)(yi)后(hou)免(mian)疫(yi)(yi)增(zeng)強(qiang)效果較好的(de)復方免(mian)疫(yi)(yi)增(zeng)強(qiang)劑組進行抗體持(chi)續期(qi)監測(ce)：分(fen)別在免(mian)疫(yi)(yi)后(hou)28天(tian)、60天(tian)、90天(tian)、120天(tian)、150天(tian)、180天(tian)和210天(tian)分(fen)別采血，蘭獸研(yan)液相續斷elisa抗體檢(jian)測(ce)試劑盒(he)檢(jian)測(ce)疫(yi)(yi)苗免(mian)疫(yi)(yi)后(hou)的(de)抗體產生情況；
(o型液相阻斷elisa抗體滴度大于等于26為抗體合格，a和亞i型液相阻斷elisa抗體滴度大于等于27為抗體合格。)
免(mian)疫后抗體合(he)格率(lv)如表4，表5所示。
表4各組仔(zi)豬免疫后(hou)抗體合格(ge)率
從表(biao)4可(ke)以(yi)看出，免(mian)(mian)疫三價疫苗(miao)(miao)的仔豬，在免(mian)(mian)疫后7天三個血(xue)清型的抗體(ti)合(he)格率僅為20％，30％和10％；而免(mian)(mian)疫了復方免(mian)(mian)疫增強劑伴(ban)侶疫苗(miao)(miao)9/10/11+三價疫苗(miao)(miao)的仔豬，在免(mian)(mian)疫后7天即可(ke)達到(dao)合(he)格率為70～90％，窗口期明(ming)顯(xian)縮短；液(ye)相阻斷elisa抗體(ti)合(he)格率也明(ming)顯(xian)升高。
表5各組(zu)仔豬免疫后抗體(ti)持續期內的(de)抗體(ti)合(he)格率
從表(biao)5可以看出(chu)(chu)，免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)三(san)價疫(yi)(yi)(yi)苗的仔豬的抗(kang)體從免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)后(hou)90日(ri)齡開始出(chu)(chu)現緩(huan)慢(man)下降(jiang)；而(er)免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)了(le)復方免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)增強(qiang)劑(ji)伴侶疫(yi)(yi)(yi)苗9/10/11+三(san)價疫(yi)(yi)(yi)苗的仔豬，在免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)后(hou)28天(tian)后(hou)抗(kang)體水平(ping)基(ji)本(ben)穩定，持(chi)續至7個月沒(mei)有(you)明顯的下降(jiang)趨勢；添加了(le)復方免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)增強(qiang)劑(ji)伴侶疫(yi)(yi)(yi)苗的免(mian)(mian)疫(yi)(yi)(yi)組，明顯延長了(le)疫(yi)(yi)(yi)苗的抗(kang)體持(chi)續期。
綜上，復方免(mian)疫(yi)增強劑(ji)伴(ban)侶疫(yi)苗(miao)對o，a，亞i三價口蹄疫(yi)滅活疫(yi)苗(miao)的(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)效(xiao)力有明(ming)顯的(de)(de)(de)提(ti)高作用。對o，a，亞i三種(zhong)血清(qing)型(xing)的(de)(de)(de)抗體均有明(ming)顯的(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)增強作用，且明(ming)顯縮短疫(yi)苗(miao)抗體產(chan)生(sheng)的(de)(de)(de)窗口期(qi)，提(ti)高疫(yi)苗(miao)的(de)(de)(de)抗體持續期(qi)。
實施例5復方免(mian)疫(yi)增強劑(ji)伴(ban)侶(lv)疫(yi)苗(miao)對商品(pin)化多肽疫(yi)苗(miao)的免(mian)疫(yi)效力評價(jia)
1、疫苗制備：
復方免疫增(zeng)強劑(ji)伴(ban)侶疫苗采(cai)用實施例3中(zhong)制備(bei)的三(san)種伴(ban)侶疫苗。
多肽疫苗批(pi)號(hao)：(2014)090297522
2、分組、免疫和抗體(ti)檢測
實驗分組(zu)及(ji)免疫：將健康易感(gan)仔豬隨機分組(zu)，每組(zu)10頭，共4組(zu)。
每組(zu)疫苗(miao)各免疫一組(zu)健康(kang)易感仔(zi)豬。
表6疫苗免疫及分組
免疫后采血：
對(dui)免(mian)疫(yi)后(hou)的抗體(ti)產生(sheng)情況進(jin)行監測：免(mian)疫(yi)后(hou)第7天(tian)(tian)、14天(tian)(tian)、21天(tian)(tian)和第28天(tian)(tian)，對(dui)各(ge)組健康(kang)易(yi)感仔豬采(cai)血分離血清，蘭獸研液(ye)相阻斷elisa抗體(ti)檢測試(shi)(shi)劑(ji)盒及豬口蹄疫(yi)病(bing)毒vp1結構蛋白抗體(ti)酶聯(lian)免(mian)疫(yi)吸(xi)附試(shi)(shi)驗診斷試(shi)(shi)劑(ji)盒(多肽(tai)抗體(ti)檢測試(shi)(shi)劑(ji)盒，購自上海申聯(lian)公司)，分別檢測疫(yi)苗免(mian)疫(yi)后(hou)的抗體(ti)產生(sheng)情況；
對(dui)免(mian)疫(yi)后(hou)免(mian)疫(yi)增(zeng)(zeng)強(qiang)效果較好的復方免(mian)疫(yi)增(zeng)(zeng)強(qiang)劑組進行抗體持(chi)續(xu)期(qi)監測：分別在免(mian)疫(yi)后(hou)28天、60天、90天、120天、150天、180天和(he)210天分別采血(xue)，蘭獸(shou)研液相阻(zu)斷elisa抗體檢(jian)測試劑盒檢(jian)測疫(yi)苗免(mian)疫(yi)后(hou)的血(xue)清抗體產(chan)生情況(kuang)；
(當液相阻斷elisa抗體滴度大于等于26為抗體合格，多(duo)肽抗體檢測采用試劑盒判定標準判定陰(yin)陽(yang)性。)
免(mian)疫后兩(liang)種試(shi)劑盒檢測的抗體(ti)合格率如表(biao)7，表(biao)8所示(shi)。
表7各組仔(zi)豬(zhu)免疫后抗(kang)體合格率
從表(biao)7可(ke)以看出，免(mian)疫(yi)(yi)(yi)多(duo)肽(tai)苗的(de)仔豬(zhu)，在(zai)(zai)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)后7天后多(duo)肽(tai)抗體合格(ge)率為(wei)(wei)4/10，但液相(xiang)(xiang)阻(zu)(zu)斷(duan)(duan)(duan)(duan)elisa抗體合格(ge)率為(wei)(wei)0；而免(mian)疫(yi)(yi)(yi)了(le)復方免(mian)疫(yi)(yi)(yi)增強劑(ji)伴侶(lv)疫(yi)(yi)(yi)苗9/10/11+多(duo)肽(tai)苗的(de)仔豬(zhu)，在(zai)(zai)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)后7天多(duo)肽(tai)苗的(de)抗體合格(ge)率為(wei)(wei)8/10或者9/10，液相(xiang)(xiang)阻(zu)(zu)斷(duan)(duan)(duan)(duan)elisa抗體抗體的(de)合格(ge)率也可(ke)以提高(gao)至5/10或6/10左右(you)；在(zai)(zai)蘭獸研的(de)液相(xiang)(xiang)阻(zu)(zu)斷(duan)(duan)(duan)(duan)elisa抗體檢測試劑(ji)盒(he)中可(ke)見，液相(xiang)(xiang)阻(zu)(zu)斷(duan)(duan)(duan)(duan)elisa抗體水(shui)平與攻毒保護具有一定(ding)的(de)相(xiang)(xiang)關性(xing)，特別是抗體水(shui)平越高(gao)，保護效力越好。復方免(mian)疫(yi)(yi)(yi)增強劑(ji)伴侶(lv)疫(yi)(yi)(yi)苗可(ke)以明顯縮短(duan)多(duo)肽(tai)苗抗體產生的(de)窗口期，提高(gao)液相(xiang)(xiang)阻(zu)(zu)斷(duan)(duan)(duan)(duan)elisa抗體的(de)合格(ge)率。
表8各組仔豬(zhu)免(mian)疫(yi)后(hou)抗體(ti)持(chi)續期內的抗體(ti)合(he)格率
從表(biao)8可(ke)以(yi)看出(chu)，免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)多肽苗(miao)(miao)的(de)仔(zi)豬(zhu)的(de)抗(kang)體從免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)后90日齡開始出(chu)現緩慢下降；而免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)了復方免(mian)增強劑伴侶(lv)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)9/10/11+多肽疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)的(de)仔(zi)豬(zhu)，在免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)后21天(tian)后抗(kang)體水平基本穩(wen)定，可(ke)維持至7個月無明顯的(de)下降趨勢；添加(jia)了復方免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)增強劑伴侶(lv)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)的(de)免(mian)疫(yi)(yi)(yi)(yi)組，明顯延長了疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)的(de)抗(kang)體持續期。
綜上，復方免(mian)疫(yi)(yi)增強劑伴侶疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)對(dui)口蹄(ti)疫(yi)(yi)多肽疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)的(de)免(mian)疫(yi)(yi)效力(li)有(you)明(ming)(ming)(ming)顯(xian)的(de)提(ti)高作用。且(qie)明(ming)(ming)(ming)顯(xian)可以提(ti)高液相(xiang)阻斷elisa抗(kang)體的(de)合格(ge)率，且(qie)明(ming)(ming)(ming)顯(xian)縮(suo)短疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)抗(kang)體產生的(de)窗口期，提(ti)高疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)的(de)抗(kang)體持續期。
以上所述僅是本(ben)(ben)發(fa)明的(de)優選(xuan)實(shi)施方式(shi)，應當指出(chu)(chu)：對于(yu)本(ben)(ben)技術(shu)(shu)領域的(de)普通技術(shu)(shu)人(ren)員(yuan)來說(shuo)，在不脫離本(ben)(ben)發(fa)明原理的(de)前提下，還可以做(zuo)出(chu)(chu)若干改進和(he)潤(run)飾，這些改進和(he)潤(run)飾也應視為本(ben)(ben)發(fa)明的(de)保護范(fan)圍。