專利名稱：一種基于rt-lamp技術的h3亞型流感快速檢測分型方法
發明內容
本發明涉及一種基于RT-LAMP技術的H3亞型流感快速檢測分型方法。
背景技術：
流行性感冒(Influenza)簡稱流感，是由流行性感冒病毒(Influenza virus)引起的一種急性呼吸道傳染病，潛伏期為1-3天，臨床表現為突然發病、高熱、寒顫、頭痛、肌痛、全身不適。一般患者一周左右可以康復，但對于某些特殊人群，如年齡低于2歲的嬰幼兒，65歲以上的老人，原有基礎疾病或免疫受抑制的病人等，這些人群發生嚴重流感和并發癥的幾率提高，病死率也相應增加。長期以來，流感一直是危害人類健康和公眾安全的嚴重傳染病，每年由此造成的經濟損失也十分巨大。據世界衛生組織估計，每年全球流感患者約為6-12億，其中約有3-5百萬是重癥流感患者，每年約有30-50萬人死于流感。流感病毒在分類上屬于正粘病毒科，根據核蛋白(NP)和基質蛋白(MP)抗原性的不同，分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。A型流感病毒可以感染多種動物，是人類流感和動物流感的主要病原。B型和C型流感癥狀較A型輕，且僅感染人類，其中B型流感常呈地方流行性，C型流感一般散發。A型流感病毒根據其表面蛋白血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的抗原性差異，可分為不同的亞型，目前在水禽中已發現16種HA亞型和9種NA亞型。在過去的一個世紀里，A型流感病毒引發4次人類流感大流行。自1977年以來，在全球流行的人類流感病毒主要是H1N1、H3N2、H1N2和B型病毒。A型病毒不僅血清型復雜，遺傳變異也十分活躍，變異的方式主要有核苷酸點突變積累引起的抗原漂移和不同毒株基因節段重配引起的抗原轉換兩種。研究表明，每1-2年，H1和H3亞型流感病毒在人群免疫壓力下都會發生一次大的抗原漂移，使疫苗接種預防效果和血清學診斷結果大打折扣。
近十多年來，禽流感病毒，包括H5N1、H9N2和H7N7亞型，特別是H5N1亞型病毒，在全球家禽中持續爆發流行。一般認為流感病毒具有宿主限制性，即禽流感病毒一般不易突破宿主種間屏障直接感染人。但近年來發生了多起禽流感病毒感染人并引致疾病乃至死亡的事例，越來越多的證據表明禽流感病毒，特別是H5N1病毒，已經逐步獲得直接感染人的能力。自1997年香港禽流感事件，截止2006年底，全球已有217例感染了H5N1病毒，其中死亡125例。根據以往大流感的經驗和當前高致病性禽流感肆虐的嚴峻現實，H5N1病毒一旦獲得在人際間傳播的能力或與現在流行的人病毒基因重配，就可能引發新的流感大流行。因此必須面對的問題是應該采取何種策略和技術儲備來應對可能到來的大流感。
流感病毒的有效檢測技術對于指導臨床預防和治療流感具有重要意義，同時也是流感監測和控制世界性流感大流行的重要技術支撐。除了流感病毒，臨床上引致人呼吸道疾病的病原體還有很多，包括某些病毒、細菌、支原體、螺旋體、寄生蟲等，因此輕型流感及散發流感在臨床上與普通感冒及其它病原引起的呼吸道疾病較難鑒別，對流感的確診主要依靠實驗室檢測手段。自1933年流感病毒被第一次分離以來，發展出了許多不同的診斷方法，這些方法各有優缺點。目前流感的實驗室診斷方法有病毒分離培養、檢測抗體的血清學方法、檢測抗原的免疫學方法和基于PCR的分子生物學方法。用雞胚或細胞分離培養病毒是流感病毒鑒定的“黃金標準”，敏感性強，但需要3-7天時間，不適合早期診斷。血清學方法可以檢測抗體，主要包括血凝抑制試驗(HI)、補體結合試驗(CF)、酶免疫試驗(EIA)和間接免疫熒光法(IF)等。血清學檢測需要采集患者急性期和康復期雙份血清，屬于回顧性診斷，具有流行病學意義，但對于急性早期診斷意義不大，且敏感性低。直接檢測抗原方法有直接或間接熒光試驗、酶聯免疫試驗等，時間為2小時-1天，適合早期快速診斷，但敏感性低，且不能進行大樣本檢測。分子生物學方法是針對病原核酸分子檢測的一系列試驗手段，主要包括RT-PCR、多重PCR、real-time PCR、NASBA等，這些方法都具有靈敏度高、特異性強、快速的特點，可以對病毒進行定量和分型鑒定，但缺點是不能對大量臨床標本進行同時平行檢測和篩查。
在敏感性、特異性、快速、標本大量檢測及病毒分型等方面，上述所有的檢測方法都存在著一定缺陷，在臨床確診和流行病學監測中的應用都受到限制。RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測技術已被廣泛采用，結果可靠，但熒光定量RT-PCR檢測時間較短，但需要昂貴的檢測儀器，很難在一線檢測單位使用，常規的RT-PCR所需的PCR儀器成本雖比不上定量RT-PCR儀，但成本也可觀，而且所需時間也要2-3小時才能出結果。基因芯片檢測所需相關儀器更為昂貴，還需要專業的技術人員。
發明內容
本發明提供了一種一種基于RT-LAMP技術的H3亞型流感快速檢測分型方法，它不但特異性好，靈敏度高，而且檢測的過程簡單，成本低，耗時短，結果容易判斷，適宜推廣。
本發明采用以下技術方案一種基于RT-LAMP技術的H3亞型流感快速檢測分型方法，它包括以下步驟步驟一，檢索流感病毒基因組序列數據庫，對流感病毒基因組序列數據庫中H3亞型流感病毒的HA基因序列進行序列分析，設計出6條高特異的、高度保守的RT-LAMP專用引物針對靶基因的8個區域，其中4條引物針對靶基因的6個區域，這4條引物為FIP、BIP，F3和B3，其余2條為loop引物LP1，LP2，loop引物LP1，LP2針對靶基因的2個區域；步驟二，收取待檢樣本進行預處理，然后從預處理后的待檢樣本中提取總RNA作為反應模板，總RNA在低溫條件下進行保存待用；步驟三，配置RT-LAMP反應體系，首先在反應管中依次加入反應buffer，dNTPs，然后再加入LAMP專用引物FIP、BIP、F3、B3、LP1和LP2，逆轉錄酶和DNA擴增酶；步驟四，將步驟二中總RNA反應模板混入步驟三所配制的RT-LAMP反應體系置于水浴中，恒溫條件下進行RT-LAMP擴增；步驟五，將步驟四中擴增后的反應產物進行判定，呈陽性則表示樣本中含有H3亞型流感病毒，呈陰性則表示不含有H3亞型流感病毒。
本發明步驟二中采用Trizol法或總RNA提取試劑盒來提取待檢樣本的總RNA。本發明步驟一中各引物的序列表為 本發明步驟二中的預處理的過程為首先對待檢樣本進行稱重，然后再對待檢樣本進行研磨，保存總RNA的溫度為-80℃。
本發明步驟三中各引物的濃度為 本發明所述的步驟四中反應的恒溫的范圍為55-65℃，反應時間范圍為30-60min。本發明步驟五中的判定方法可以采用電泳法、濁度法或熒光法。
本發明具有以下有益效果本發明是將目前先進的LAMP技術與逆轉錄技術進行綜合形成RT-LAMP技術，它可以將逆轉錄與DNA擴增置于同一反應管中，整個反應只需一次加樣過程，無需先逆轉錄成cDNA，再吸出此cDNA作模板進行DNA擴增，因而RT-LAMP技術在客觀上最大程度地減少核酸的污染機會。LAMP法還具有以下優點(1)擴增條件簡便只需在恒定溫度的條件下進行擴增反應，不需要特定的擴增儀及其相關試劑，也不需要預先進行雙鏈DNA的變性；(2)具有高特異性它應用了6個區段、4種引物，并且這6個區段的順序也有規定；因而LAMP法擴增的特異性很高，可以根據是否擴增就能判斷目標基因的存在與否，即能夠進行細菌或病毒的定性檢測；(3)快速、高效地進行擴增整個擴增在不到60min即可完成，若在引物上再進一步改進，可大大提高其擴增效率，擴增時間在原來的基礎上減少1/3～1/2，本發明的loop引物，將RT-LAMP總反應時間控制在45min內；(4)靈敏度高擴增模板可達1～10拷貝；(5)步驟簡單擴增RNA只要在DNA基因擴增試劑的基礎上加上逆轉錄酶，就能夠完全像DNA基因擴增那樣，這樣可以一步就實現RNA擴增；(6)鑒定簡便本發明可采用電泳法、或濁度法或熒光法，檢測比較簡單，結果判定通過肉眼或簡易紫外燈即可作出準確判斷，快速確認樣本中是否含有H3亞型流感病毒，結果也很容易判定，檢測靈敏度近似熒光定量RT-PCR。另外本發明不但耗時短，針對H3亞型流感的RT-LAMP僅45min，成本低，所用試劑比同類熒光定PCR的檢測試劑相比要低，而且敏感性好，它可以針對H3亞型流感的RT-LAMP檢測效果檢測出RT-PCR漏檢的樣本。
圖1為本發明的流程示意圖 圖2為本發明采用電泳法的檢測結果圖 圖3為本發明采用熒光法的檢測結果圖
具體實施例方式 環介導等溫擴增LAMP(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術特點是針對靶基因的6個區域設計了4個特異引物[FIP(F1+F2C)BIP(B1C+B2)，F3，B3，]，利用一種鏈置換DNA聚合酶——Bst(Bacillusstearothermophilus)DNA polymerase，全反應過程在恒溫條件(55-65℃)進行擴增反應。基因的擴增和產物的檢測可一步完成，擴增效率高，可在15～60min擴增109～1010倍；特異性高，所有靶基因序列的檢測可只通過擴增產物的有、無來判別。有、無擴增反應是利用熒光定量PCR儀檢測反應的熒光強度或利用核酸擴增過程中產生的焦磷酸鎂沉淀反應用濁度儀檢測沉淀濁度來判定的。
擴增原理DNA在55-65℃左右處于動態平衡狀態，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。在鏈置換型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2區段的3′末端為起點，與模板DNA互補序列配對，啟動鏈置換DNA合成。F3引物與F2c前端F3c序列互補，以3′末端為起點，通過鏈置換型DNA聚合酶的作用，一邊置換先頭FIP引物合成的DNA鏈，一邊合成自身DNA，如此向前延伸。最終F3引物合成而得的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈。由FIP引物先合成的DNA鏈被F3引物進行鏈置換產生一單鏈，這條單鏈在5′末端存在互補的F1c和F1區段，于是發生自我堿基配對，形成環狀結構。同時，BIP引物同該單鏈雜交結合，以BIP引物的3′端為起點，合成互補鏈，在此過程中環狀結構被打開。接著，類似于F3，B3引物從BIP引物外側插入，進行堿基配對，以3′端為起點，在聚合酶的作用下，合成新的互補鏈。通過上述兩過程，形成雙鏈DNA。而被置換的單鏈DNA兩端存在互補序列，自然發生自我堿基配對，形成環狀結構，于是整條鏈呈現啞鈴狀結構。該結構是LAMP法基因擴增循環的起始結構。至此為止的所有過程都是為了形成LAMP法基因擴增循環的起點結構。LAMP法基因擴增循環首先在啞鈴狀結構中，以3′末端的F1區段為起點，以自身為模板，進行DNA合成延伸。與此同時，FIP引物F2與環上單鏈F2c雜交，啟動新一輪鏈置換反應。解離由F1區段合成的雙鏈核酸。同樣，在解離出的單鏈核酸上也會形成環狀結構。在環狀結構上存在單鏈形式B2c，BIP引物上的B2與其雜交，啟動新一輪擴增。經過相同的過程，又形成環狀結構。通過此過程，結果在同一條鏈上互補序列周而復始形成大小不一的結構。
LAMP擴增產物的檢測(1)熒光定量檢測利用SYBR Green工熒光染料只與雙鏈DNA小溝結合，當它與DNA雙鏈結合時，發出較原先強800～1000倍的熒光的原理，在一個體系內，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。在核酸大量合成時，SYBR Green I能自動摻入雙鏈DNA，通過檢測所產生的熒光強度，獲取Ct值，比照標準曲線，可確定模板DNA的起始拷貝數。(2)副產物——焦磷酸鎂的濁度檢測在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg結合，產生副產物一焦磷酸鎂沉淀。反應方程式如下(DNA)n一+dNTP一(DNA)n一1+P2O7+2Mg一Mg2P2O7(沉淀)，具有極高的特異性，只要用肉眼觀察或濁度儀在400nm光下，檢測沉淀濁度就能夠判斷擴增與否。
在圖1中，本發明為一種基于RT-LAMP技術的H3亞型流感快速檢測分型方法，它是將常規RNA逆轉錄成cDNA技術和LAMP擴增技術進行綜合，實現一步法(逆轉錄和LAMP于同一反應管中直接反應，無需先逆轉錄再進行LAMP擴增)，具體的操作步驟如下 步驟一，檢索流感病毒基因組序列數據庫，對流感病毒基因組序列數據庫中H3亞型流感病毒的HA基因序列進行序列分析，設計出6條高特異的、高度保守的RT-LAMP專用引物針對靶基因的8個區域，其中4條引物針對靶基因的6個區域，這4條引物為FIP、BIP，F3和B3，其余2條為loop引物LP1，LP2，loop引物LP1，LP2針對靶基因的2個區域，各引物的序列表為 各引物的濃度為 步驟二，收取待檢樣本進行預處理，預處理的過程為(1)對待檢樣本進行稱重，(2)對待檢樣本進行研磨，然后從預處理后的待檢樣本中提取總RNA，在待檢樣本中提取總RNA作為反應模板，本發明采用Trizol法或總RNA提取試劑盒來提取總RNA，以Trizol法提取總RNA為例，步驟如下(1)取1.5mLEppendorf管，吸取200μL的樣品液于管中；(2)加入700μLTrizol液，混勻后室溫靜置10min；加入200μL氯仿，震蕩搖勻，室溫靜置10min，4℃12000rpm離心15min；(3)將上清液轉移至新1.5mLEppendorf管中，加入與上清液等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10min，4℃12000rpm離心10min，棄上清；(4)向沉淀中加入1mL 75％乙醇洗滌，4℃ 12000rpm離心5min，棄上清；(5)DEPC水溶解沉淀，得Total RNA溶液，提取的總RNA在-80℃下進行保存待用； 步驟三，配置RT-LAMP反應體系，首先在反應管中依次加入反應buffer，dNTPs，然后再加入LAMP專用引物FIP、BIP、F3、B3、LP1和LP2，逆轉錄酶和DNA擴增酶，下面以配置25μLRT-LAMP反應體系為例 步驟四，將總RNA反應模板混入步驟三所配制的RT-LAMP反應體系，置于水浴中，在55-65℃的溫度條件下進行RT-LAMP擴增，時間為30-60min； 步驟五，將步驟四中的擴增后的反應產物進行判定，呈陽性則表示樣本中含有H3亞型流感病毒，呈陰性則表示不含有H3亞型流感病毒。
本發明采用的判定方法可以采用電泳法、濁度法或熒光法 (1)電泳法參見圖2，從反應管中取出5μl反應產物，于1％核酸電泳膠中，120V電泳20分鐘，在凝膠成像儀中看電泳結果，陽性樣本(含有H3亞型流感病毒)應出現梯帶狀電泳條帶，見圖2中1表示的為陽性，而陰性結果則無任何電泳條帶，見圖2中2表示的為陰性，； (2)濁度法反應完成以，在陽性結果(含有H3亞型流感病毒)的反應管可以見到白色濁物，陰性的則沒有； (3)熒光法參見圖3，在配制反應液時加入適量的本發明所配制的熒光物質，其它的反應液同于上述的RT-LAMP組分及用量，待反應結束后，即可置于紫外燈下，觀察熒光情況，陽性樣本(含有H3亞型流感病毒)應出現綠色熒光，見圖3中1表示的為陽性，而陰性結果則無熒光，見圖3中2表示的為陰性，圖3中2表示的為陰性對照(ddH2O)。
權利要求
1、一種基于RT-LAMP技術的H3亞型流感快速檢測分型方法，它包括以下步驟
步驟一，檢索流感病毒基因組序列數據庫，對流感病毒基因組序列數據庫中H3亞型流感病毒的HA基因序列進行序列分析，設計出6條高特異的、高度保守的RT-LAMP專用引物針對靶基因的8個區域，其中4條引物針對靶基因的6個區域，這4條引物為FIP、BIP，F3和B3，其余2條為loop引物LP1，LP2，loop引物LP1，LP2針對靶基因的2個區域；
步驟二，收取待檢樣本進行預處理，然后從預處理后的待檢樣本中提取總RNA作為反應模板，總RNA在低溫條件下進行保存待用；
步驟三，配置RT-LAMP反應體系，首先在反應管中依次加入反應buffer，dNTPs，然后再加入LAMP專用引物FIP、BIP、F3、B3、LP1和LP2，逆轉錄酶和DNA擴增酶；
步驟四，將步驟二中總RNA反應模板混入步驟三所配制的RT-LAMP反應體系置于水浴中，恒溫條件下進行RT-LAMP擴增；
步驟五，將步驟四中擴增后的反應產物進行判定，呈陽性則表示樣本中含有H3亞型流感病毒，呈陰性則表示不含有H3亞型流感病毒。
2、根據權利要求1中所述的基于RT-LAMP技術的H 3亞型流感快速檢測分型方法，其特征是步驟二中采用Trizol法或總RNA提取試劑盒來提取待檢樣本的總RNA。
3、根據權利要求1中所述的基于RT-LAMP技術的H3亞型流感快速檢測分型方法，其特征是步驟一中各引物的序列表為
4、根據權利要求1中所述的基于RT-LAMP技術的H3亞型流感快速檢測分型方法，其特征是所述的步驟二中的預處理的過程為首先對待檢樣本進行稱重，然后再對待檢樣本進行研磨，保存總RNA的溫度為-80℃。
5、根據權利要求1中所述的基于RT-LAMP技術的H3亞型流感快速檢測分型方法，其特征是所述的步驟三中各引物的濃度為
6、根據權利要求1中所述的基于RT-LAMP技術的H3亞型流感快速檢測分型方法，其特征是所述的步驟四中反應的恒溫的范圍為55-65℃，反應時間范圍為30-60min。
7、根據權利要求1中所述的基于RT-LAMP技術的H3亞型流感快速檢測分型方法，其特征是所述的步驟五中的判定方法可以采用電泳法、濁度法或熒光法。
全文摘要
本發明公開一種基于RT-LAMP技術的H3亞型流感快速檢測分型方法，一、對流感病毒基因組序列數據庫中H3亞型流感病毒的HA基因序列進行序列分析，設計出高特異的、高度保守的RT-LAMP專用引物，6條引物針對靶基因的8個區域，其中4條引物為FIP、BIP，F3和B3，另2條為loop引物LP1，LP2；二、對待檢樣本進行預處理后，提取樣本的總RNA作為反應模板；三、配置RT-LAMP反應體系；四、將RNA模板本混入RT-LAMP反應體系中，置于水浴中，恒溫條件下進行RT-LAMP擴增；五、將擴增后的反應產物進行判定，呈陽性則表示含有H3亞型流感病毒，呈陰性則表示H3亞型流感病毒。
文檔編號C12Q1/70GK101608242SQ200910029320
公開日2009年12月23日 申請日期2009年4月9日 優先權日2009年4月9日
發明者劉奮勇, 顧宏偉 申請人:泰州親和力生物技術有限公司