專利名稱：針對多種登革病毒亞型的新穎疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及改進的登革疫苗、用于誘導針對登革病毒的免疫反應和用于預防性地 和/或治療性地針對登革病毒免疫個體的改進的方法。背景登革病毒(DENV)是一種新出現的引起登革熱(DF)和嚴重的威脅生命的疾病登革 出血熱/登革休克綜合征(DHF/DSS)的蚊媒病原。DENV是一種小的、包膜的正鏈RNA病毒， 它屬于黃病毒科(Flaviviridae)家族的黃病毒屬。登革病毒的四種不同的亞型或血清型 (DV-1到DV-4)通過岐種埃及伊岐(Aedes aegypti)和白紋伊岐(Aedesalbopictus)的叮 咬傳播給人類。據估計每年出現5千萬至1億的DF病例和250，000至500000的DHF病例。 登革成為了巨大的國際公共衛生問題，因為世界人口的五分之二生活在登革的流行區域并 且每年出現估計5千萬至1億的登革感染病例。此外，在不存在有效干涉的情況下，在世界 的亞熱帶和熱帶區域，25億人處在感染的危險之下。超過100個熱帶國家具有流行性登革病毒感染，并且已證明DHF在大于60個這些 國家中存在。在大多數國家缺乏對DF/DHF的監視并且過去主要集中于DHF;因此只能估計 每年出現的DF病例的數目。然而在1998年，主要的流行病發生遍及亞洲和美國，其中向世 界衛生組織(WHO)報告了 > 120萬例DF/DHF病例。DHF的全球報告在過去20年內已平均 增加五倍。在21世紀初，根據流行病活性，估計每年出現5千萬至1億的DF病例和幾十萬 DHF病例。病死率(CFR)在國家之間有差異，但是在一些國家可以高達10-15%而在另一些 國家< 1%。存在四種登革病毒亞型登革1型(DV-I)、登革2型(DV-2)、登革3型(DV_3)和 登革4型(DV-4)。這些亞型中的每一個在黃病毒家族內形成抗原上不同的亞類。它們是 編碼十種蛋白的包膜的RNA病毒三種結構蛋白和七種非結構蛋白。所述結構蛋白是衣殼 (C)、包膜(E)和預膜前體(preM)。DV的生命周期開始于受體介導的病毒進入細胞的胞吞作 用，接著病毒的包膜蛋白與晚期內含體膜融合，這導致病毒的基因組釋放到細胞質中復制。DV感染可能無癥狀或者以發熱、寒戰、額痛、肌痛、關節痛和疹為特征。隨后感染不 同的血清型可導致包括血漿滲漏或出血(登革出血熱)和休克(登革休克綜合征)的更為 嚴重的疾病表現。雖然多年來已進行廣泛研究來了解DENV感染的病原性，但在特效的抗DV 化合物的研制上沒有取得什么進展。目前在美國沒有批準的針對登革感染的特定抗病毒劑 或疫苗。包膜(E)糖基化蛋白是成熟的登革病毒粒子表面上存在的主要結構蛋白，是一種 I型整合膜蛋白。已證明成熟登革病毒的E蛋白以反向平行方式(頭到尾方向)形成同型 二聚體。每個單體被折疊成三種不同的結構域，即結構域I (DI，中心的N端結構域)、結構域11(011，二聚化結構域)和結構域111(0111，免疫球蛋白(Ig)樣的C端結構域)。E蛋 白的DIII結構域由C端的100個氨基酸(殘基303-395)組成。這個結構域已表明是受體 識別和結合結構域。DIII蛋白中存在的Ig樣折疊通常與具有附著功能的結構有關。這個 結構域垂直地延伸到病毒的表面，具有一個從病毒粒子表面伸出的比E蛋白的任何其他部 分更遠的尖端。此外，研究已證明重組DIII蛋白和產生的抗黃病毒的E蛋白的DIII的抗 體均能抑制黃病毒進入靶細胞。此外，具有E蛋白的DIII的突變的黃病毒顯示出減弱的毒 力或逃避免疫中和的能力。研制安全且有效的針對登革病毒感染的疫苗仍是一個主要的公共衛生目標。假定 免疫性與登革病毒的主要關聯被認為是中和抗體的存在，那么用于比較和優化疫苗候選物 的前提是精確地測量由疫苗誘發的中和抗體反應的能力。來自所有四種血清型的包含減弱 的活病毒的疫苗的組合已顯示導致幾種并發癥(Guy B,Almond JW，Comp ImmunolMicrobiol Infect Dis. 2008年3月；31 (2-3) :239_52)。此外，存在很少的關于基于腺病毒的登革抗原 的遞送的報告。盡管如此，腺病毒系統的這個眾所周知的問題是大多數的人類群體已知具 有抗腺病毒之一的抗體，并且此類預先存在的抗體能夠引起這些基于腺病毒的疫苗失效。因此，仍有必要研制提供針對多種且優選所有四種血清型的登革病毒的廣泛免疫 性或通用免疫性(universal immunity)的疫苗，以及優選地是經濟的且在所有血清型之間 有效的疫苗。此外，存有需要向哺乳動物施用疫苗諸如DNA疫苗或DNA質粒疫苗以在預防 上或治療上提供針對登革病毒的免疫的有效方法。發明概述本發明的一個方面提供能夠表達引發哺乳動物針對多于一種登革病毒亞型的免 疫反應的多肽的核酸構建體。所述核酸構建體由編碼核苷酸序列和與所述編碼核苷酸序列 可操作地連接的啟動子組成。所述編碼核苷酸序列表達所述多肽，其中所述多肽包括來自 至少兩種不同的登革病毒亞型的包膜蛋白的結構域IIKDIII結構域或DIII)。所述啟動子 調節哺乳動物中所述多肽的表達。本發明的另一個方面提供了能夠在哺乳動物中產生針對多種登革病毒亞型的免 疫反應的DNA質粒疫苗。所述DNA質粒疫苗由能夠在所述哺乳動物中表達共有登革抗原的 DNA質粒和藥學上可接受的賦形劑組成。所述DNA質粒由與編碼所述共有登革DIII抗原的 編碼序列可操作地連接的啟動子組成。所述共有登革抗原由登革病毒亞型1、登革病毒亞型 2、登革病毒亞型3或登革病毒亞型4的共有DIII結構域組成。本發明的另一方面提供了引發哺乳動物針對多種病毒亞型的免疫反應的方法，所 述方法包括向所述哺乳動物的組織遞送DNA質粒疫苗，并用能量脈沖以有效允許所述DNA 質粒進入所述細胞的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔，所述DNA質粒疫苗包含能夠在所 述哺乳動物的細胞中表達衍生自所述病毒亞型的多種共有抗原以引發所述哺乳動物的免 疫反應的DNA質粒，所述多種共有抗原包含來自所述至少兩種不同的病毒亞型的抗原結構 域。附圖簡述通過參考附圖，本領域的技術人員可以更好地理解本發明的許多目的和優點，其 中

圖1展示了示出登革病毒基因組的結構以及該登革病毒包膜的三維構象模型的簡圖。圖2展示了示出來自所有四種登革亞型的DIII結構域和通用DIII帶的凝膠照 片。圖3展示了示出人類密碼子優化的通用登革Dili (DV-U)的結構和DV-U-DIII的 共有氨基酸序列的簡圖。圖4a展示了四種質粒的質粒圖譜，所述質粒各自具有一種亞型的DIII結構域。圖4b展示了包含DV-U-DIII的質粒的質粒圖譜。圖5展示了示出在表達來自所有四種亞型和DV-U片段的克隆到pVAX中的DIII 的細胞中的Dili mRNA轉錄物的凝膠照片。圖6展示了在RD細胞中表達DV DIII疫苗構建體的間接免疫熒光分析(IFA)的 照片，所述DV DIII疫苗構建體具有FLAGGED表位。圖7展示了示出DIII產物的體外翻譯的凝膠照片。圖8展示了檢測DIII產生的大腸桿菌(E.coli)溶菌產物和鎳柱純化樣品的 SDS-PAGE 凝膠。圖9展示了 DV接種方案的時間線。圖10展示了光譜讀數的柱狀圖，該圖示出來自接種pDV-U-DIII的小鼠的抗DIII 血清與捕獲到鎳涂覆的ELISA板上的DV-I到DV-4的DIII抗原之間的特異性反應。圖11展示了示出通過蛋白質印跡分析使用來自接種pDV-U-DIII的小鼠的抗DIII 血清對DIII蛋白的免疫檢測的凝膠照片。圖12展示了示出使用來自接種pDV-U-DIII的小鼠的抗DIII血清對單獨和組合 的DIII結構域的特異性染色的照片。圖13展示了示出通過來自接種pDV-U-DIII的小鼠的血清對感染DV_2的Vero細 胞染色的照片。圖14展示了示出針對DV-2的中和抗體滴度的柱狀圖。圖15展示了示出用pDV-U DIII血清對感染登革病毒的細胞染色的照片。圖16展示了示出DV-U DIII血清針對所有四種登革亞型的中和作用的圖。圖17展示了示出B細胞酶聯免疫斑點測定的結果的圖通過pDV-UDIII誘導抗 DIII抗體分泌細胞。優選實施方案的詳細描述給出下述簡略或簡短的定義以幫助理解本發明的優選實施方案。這里所給出的簡 略的定義絕不是詳盡的，它們與本領域理解的定義或字典含義也絕不矛盾。在這里給出簡 略的定義是為了補充或更清晰地界定本領域中已知的定義。定義如本文使用，核苷酸和氨基酸的序列同源性可使用FASTA、BLAST和Gapped BLAST (Altschul等人，Nuc. Acids Res.，1997，25，3389，其通過引用將其全部內容并入本 JC ) L^^PAUP*4. OblO (D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)石角胃。 簡言之，BLAST算法代表基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool), 它適合于確定序列相似性(Altschul等人，J.Mol.Biol.，1990，215，403-410，其通過引 用將其全部內容并入本文)。用于執行BLAST分析的軟件是通過國家生物技術信息中心(//www. ncbi.nlm.nih. gov)公共可利用的。由BLAST算法提供的相似性的一個量度 是最小和概率(P(N))法，它提供了兩條核苷酸序列之間的匹配偶然發生的概率的指示。例 如，如果在檢測核酸與另一種核酸的比較中最小和概率小于大約1、優選地小于大約0. 1、 更優選地小于大約0. 01且最優選地小于大約0. 001，那么認為該核酸與所述另一種核酸是 相似的。可使用 PAUP*4. OblO 軟件(D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts) 計算“相似性的百分比”。計算出共有序列與系統樹(phylogenic tree)中的所有序列相比 的平均相似性。如本文所用，術語“核酸構建體”是指包含編碼蛋白質的核苷酸序列的DNA或RNA 分子。編碼序列或“編碼核酸序列”可包括與調控元件可操作地連接的起始信號和終止信 號，所述調控元件包括能夠在施用了所述核酸分子的個體的細胞中指導表達的啟動子和聚 腺苷酸化信號。如本文使用，術語“可表達的形式”是指包含必要調控元件的核酸構建體，所述調 控元件與編碼蛋白質的編碼序列可操作地連接以使得當所述編碼序列存在于個體的細胞 中時，其將被表達。本文使用術語“恒定電流”來定義由組織或界定所述組織的細胞在遞送到相同組 織的電脈沖的持續期間所接受或經歷的電流。所述電脈沖是從本文所述的電穿孔裝置中遞 送的。這種電流在電脈沖的使用期內在所述組織中保持恒定安培數，因為本文提供的電穿 孔裝置具有反饋元件，優選地具有瞬時反饋。所述反饋元件能夠測量整個脈沖持續期間組 織(或細胞)的阻抗，并引起電穿孔裝置改變其電能輸出(例如增加電壓)，所以相同組織 中的電流在整個電脈沖(微妙數量級)以及從脈沖到脈沖中保持恒定。在一些實施方案中， 反饋元件包括控制器。術語“反饋”或“電流反饋”可被互換使用并且表示所提供的電穿孔裝置的主動反 應，所述反應包括測量在電極之間的組織中的電流并且因此改變由EP裝置遞送的能量輸 出以保持電流在恒定水平。這個恒定水平由使用者在脈沖序列或電處理開始之前預先設 定。優選地，反饋是由電穿孔裝置的電穿孔部件例如控制器完成，因為其中的電路能夠連續 地監測在電極之間的組織中的電流，并將該監測的電流(或組織內的電流)與預設電流比 較，并且能夠連續地進行能量輸出調整以保持監測的電流在預設水平。在一些實施方案中， 所述反饋環路是瞬時的，因為它是模擬閉合環路反饋。如本文可互換使用的術語“電穿孔”、“電滲透”或“電動力學增強”(“EP”)是指 使用跨膜電場脈沖來誘導生物膜中的微觀途徑(孔)；這些微觀途徑的存在允許生物分子 例如質粒、寡核苷酸、siRNA、藥物、離子和/或水從細胞膜的一側通過到另一側。本文使用術語“分散電流”來定義從本文所述的電穿孔裝置的各個針電極陣列中 遞送的電流模式，其中所述模式使得在被電穿孔的組織的任何區域上的電穿孔相關的熱應 激的發生最小化，或者優選地將其消除。如本文使用，術語“反饋機制”是指通過軟件或硬件(或固件)執行的過程，所述 過程接收期望組織的阻抗(在遞送能量脈沖之前、過程中和/或之后)并將其與預設值 (present value)(優選電流)進行比較，并且調整遞送的能量脈沖以達到預設值。當討論 反饋機制時，術語“阻抗”被本文使用并且能夠根據歐姆定律被轉換為電流值，由此能夠與 預設電流比較。在一個優選的實施方案中，“反饋機制”通過模擬閉合環路執行。
本文使用術語“免疫反應”來表示宿主的免疫系統例如哺乳動物的免疫系統的激 活，該免疫系統的激活是對通過所提供的DNA質粒疫苗引入登革抗原例如通用登革抗原的 反應。免疫反應可以是細胞反應或體液反應的形式或二者兼有。本文使用術語“共有”或“共有序列”來表示基于特定登革亞型的多個毒株的比對 分析而構建的合成的核酸序列或對應的多肽序列，其產生亞型1、亞型2、亞型3、亞型4和以 下所述的通用登革的共有登革DIII序列。所述共有通用登革可被用來誘導針對多種登革 病毒亞型或血清型的寬泛的免疫性。本文使用術語“佐劑”來表示加到本文所述的DNA質粒疫苗中以增強由所述DNA質 粒和下文所述的編碼核酸序列所編碼的登革抗原的抗原性的任何分子。術語“亞型”或“血清型”可在本文中互換使用并涉及一種病毒例如登革病毒使用， 并且表示該病毒抗原的遺傳變體以使得一個亞型區別于一個不同亞型地被免疫系統識別。 例如，登革病毒亞型1在免疫學上可區別于登革病毒亞型2。本發明的一個方面提供能夠表達引發哺乳動物針對多于一種登革病毒亞型的免 疫反應的多肽的核酸構建體。所述核酸構建體由編碼核苷酸序列和與所述編碼核苷酸序列 可操作地連接的啟動子組成。編碼核苷酸序列表達多肽，其中所述多肽包括來自至少兩種 不同的登革病毒亞型的DIII結構域。所述啟動子調控哺乳動物中所述多肽的表達。在一些實施方案中，核酸構建體還可以包括與編碼序列的N端末端可操作地連接 并與啟動子可操作地連接的IgE前導序列。優選地，所述IgE前導序列具有SEQ ID NO=Il 的序列。所述核酸構建體還可以包含與所述編碼序列的C端末端相連的聚腺苷酸化序列。 優選地，所述核酸構建體是密碼子優化的。在一些實施方案中，編碼核苷酸序列編碼包括來自登革病毒亞型1、登革病毒亞型 2、登革病毒亞型3和登革病毒亞型4的DIII結構域的多肽。在優選的實施方案中，該編碼 核苷酸序列選自由以下組成的組SEQID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO :5ο在一些實施方案中，該編碼核苷酸序列是表達盒的一部分并且可以包括以下核苷 酸序列SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO :16。 表達盒包括(從5’末端到3’末端)=KpnI位點、IgE前導序列、編碼序列(DIII)、兩個終止 密碼子和PstI位點。掌握可用技術的普通技術人員能夠通過如下方式改變表達盒用可選 的剪接位點代替任一個剪接位點(KpnI或PstI)、用可選的信號傳導前導序列或靶向前導 序列代替IgE前導序列和/或用更多或更少的終止密碼子替代終止密碼子。本發明的另一個方面提供了能夠在哺乳動物中產生針對多種登革病毒亞型的免 疫反應的DNA質粒疫苗。所述DNA質粒疫苗由能夠在所述哺乳動物中表達共有登革抗原的 DNA質粒和藥學上可接受的賦形劑組成。所述DNA質粒由與編碼所述共有登革抗原的編碼 序列可操作地連接的啟動子組成。所述共有登革抗原由登革病毒亞型1、登革病毒亞型2、 登革病毒亞型3或登革病毒亞型4的共有DIII結構域組成。優選地，所述DNA質粒由編碼 共有DIII結構域的共有登革抗原組成，所述共有DIII結構域選自由以下組成的組SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9 禾口 SEQ ID NO : 10。具有序列 SEQ ID NO 10 的共有 Dili 結構域 DV-U-DIII 包含連接四種 Dili 亞型(DV-l-DIII、DV-2_DIII、DV-3_DIII 和DV-4-DIII)的每一種的連接序列，所述連接序列具有序列RGRKRRS，它是已知的切割位點并且允許將DV-U-DIII切割成特定亞型的分離的DIII序列。然而，所述連接序列可以是 具有相似特征的本領域中可用的任何其他的連接序列；并且用這種連接體替換成當前利用 的RGRKRRS屬于本領域的普通技術。在一些實施方案中，該DNA質粒還包括與所述編碼序列的N端末端相連并與啟動 子可操作地連接的IgE前導序列。優選地，所述IgE前導序列具有SEQ ID NO :11的序列。 DNA質粒還可以包括與所述編碼序列的C端末端相連的聚腺苷酸化序列。優選地，DNA質粒 是密碼子優化的。在一些實施方案中，所述藥學上可接受的賦形劑是佐劑。優選地，佐劑選自由 IL-12和IL-15組成的組在一些實施方案中，所述藥學上可接受的賦形劑是轉染促進劑。 優選地，轉染促進劑是聚陰離子、聚陽離子或脂質，以及更優選地是聚L谷氨酸。優選地，聚 L谷氨酸為小于6mg/ml的濃度。優選地，DNA質粒疫苗具有lmg/ml或更大的總DNA質粒濃度。在一些實施方案中，所述DNA質粒包括多種單一 DNA質粒，其中所述多種單一 DNA 質粒的每一種都編碼包含來自登革病毒亞型1、登革病毒亞型2、登革病毒亞型3或登革病 毒亞型4的DIII結構域的多肽。所述DNA質粒疫苗可包括含有以下編碼核苷酸序列的DNA質粒SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 或 SEQ IDNO :5，以及優選 SEQ ID NO :5。在一些實施 方案中，DNA質粒包含以下編碼核苷酸序列中的至少兩種SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3 或 SEQ ID NO :4。在一些實施方案中，DNA 質粒包含 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO 2 ； 在一些實施方案中，DNA質粒包含SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3 ；在一些實施方案中，DNA 質粒包含SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :4 ；在一些實施方案中，DNA質粒包含SEQ ID N0:2和 SEQID NO :3 ；在一些實施方案中，DNA質粒包含SEQ ID NO :2和SEQ IDNO :4 ；在一些實施 方案中，DNA質粒包含SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4 ；在一些實施方案中，DNA質粒包含SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 ；在一些實施方案中，DNA 質粒包含 SEQ ID NO :1、 SEQID NO :2 禾口 SEQ ID NO :4 ；在一些實施方案中，DNA 質粒包含 SEQ IDNO =USEQ ID NO 3 和SEQ ID NO 3 ；在一些實施方案中，DNA質粒包含SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4 ；或者在一些實施方案中，DNA質粒包含SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3禾口 SEQ ID NO :4。優選地，DNA 質粒包含 SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4。在一些實施方案中，DNA質粒疫苗包含表達登革病毒DIII結構域的至少兩種不同 的DNA質粒，所述質粒選自由以下組成的組包含編碼共有登革病毒亞型1的DIII結構域 的序列的DNA質粒、包含編碼共有登革病毒亞型2的DIII結構域的序列的DNA質粒、包含 編碼共有登革病毒亞型3的DIII結構域的序列的DNA質粒和包含編碼共有登革病毒亞型 4的DIII結構域的序列的DNA質粒。在一些實施方案中，DNA質粒疫苗可包括四種共有登 革病毒亞型的DIII結構域(亞型1-4)。在一些實施方案中，共有登革病毒亞型1的DIII結構域具有包括SEQ ID N0:1的 核酸序列。在一些實施方案中，共有登革病毒亞型2的DIII結構域具有包括SEQ ID NO 2 的核酸序列。在一些實施方案中，共有登革病毒亞型3的DIII結構域具有包括SEQ ID NO 3的核酸序列。在一些實施方案中，共有登革病毒亞型4的DIII結構域具有包括SEQ IDNO
104的核酸序列。在一些實施方案中，其中DNA質粒疫苗產生免疫反應的哺乳動物是靈長類。優選 地，哺乳動物是靈長類。免疫反應可以是體液反應或細胞反應，并且優選地二者兼有。本發明的另一方面提供了引發哺乳動物針對多種登革病毒亞型的免疫反應的方 法，所述方法包括向所述哺乳動物的組織遞送DNA質粒疫苗并且用能量脈沖以有效允許所 述DNA質粒進入所述細胞的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔。在一些實施方案中，引發免疫反應的方法包括將DNA質粒疫苗注射到皮內組織、 皮下組織或肌肉組織中的遞送步驟。在一些實施方案中，引發免疫反應的方法還可以包括預先設定期望被遞送到組織 的電流；并且用能量脈沖以等于預設電流的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔。在一些實施方案中，引發免疫反應的方法還包括測量被電穿孔的細胞中的阻抗； 相對于測量的阻抗調整能量脈沖的能量水平以保持電穿孔細胞中的恒定電流。所述測量和 調整步驟優選地發生在所述能量脈沖的使用期內。在一些實施方案中，電穿孔步驟包括根據以分散模式遞送能量脈沖的脈沖序列模 式，將能量脈沖遞送至多個電極。在本發明的一些實施方案中，DNA質粒疫苗能夠還包括佐劑。在一些實施方案 中，佐劑選自由以下組成的組α-干擾素、Y-干擾素、血小板衍生的生長因子(PDGF)、 TNF-α、TNF-β、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK)、上皮胸 腺表達的趨化因子(TECK)、粘膜相關上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL_15、MHC、⑶80、⑶86， 包括信號序列被刪除并任選地包括來自IgE的信號肽的IL-15。可能是有用的佐劑的其 他基因包括編碼以下的基因MCP-1、MIP-I-α、MIP_lp、IL_8、RANTES、L-選擇素、P-選擇 素、E-選擇素、CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、LFA-1、VLA-1、Mac-I、ρ150· 95、PECAM、ICAM-U ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF, G-CSF, IL-4、IL-18 的突變體形式、CD40、CD40L、血管 生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、 Fit、Apo-I、p55、WSL-I、DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、LARD、NGRF, DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、 TRICK2、DR6、胱天蛋白酶 ICE、Fos、c-jun、Sp-U Ap-U Ap_2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、 TRAF6、IkB、無活性 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素反應基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、 TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配體、0x40、0x40 配體、NKG2D、MICA、MICB、 NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPU TAP2以及它們的功能片段。在一些優選的實施 方案中，佐劑選自 IL-12、IL-15、CTACK、TECK 或 MEC。在一些實施方案中，藥學上可接受的賦形劑是轉染促進劑，它可包括以下轉染促 進劑表面活性劑，例如免疫刺激復合物(ISCOMS)；弗氏不完全佐劑；LPS類似物，包括單磷 酰脂質A ；胞壁酰肽；醌類似物；小泡，例如角鯊烯和角鯊烯(squalene and squalene)；透 明質酸；脂質；脂質體；鈣離子；病毒蛋白；聚陰離子；聚陽離子；或納米顆粒或者其他已知 的轉染促進劑。優選地，轉染促進劑是聚陰離子、聚陽離子、包括聚L谷氨酸(LGS)或脂質。 優選地，轉染促進劑是聚L谷氨酸，并且更優選地，聚L谷氨酸以小于6mg/ml的濃度存在于 DNA質粒疫苗中。在一些實施方案中，DNA質粒疫苗中聚L谷氨酸的濃度是小于4mg/ml、小于 2mg/ml、小于 lmg/ml、小于 0. 750mg/ml、小于 0. 500mg/ml、小于 0. 250mg/ml、小于 0. IOOmg/ ml、小于 0. 050mg/ml 或小于 0. OlOmg/ml。
在一些實施方案中，可以將DNA質粒疫苗遞送給哺乳動物以弓丨發免疫反應；優選 地，哺乳動物是靈長類動物，包括人類和非人類的靈長類動物、牛、豬、雞、狗或雪貂。更優選 地，哺乳動物是人類靈長類動物。本發明的一個方面涉及引發哺乳動物針對多種病毒亞型的免疫反應的方法。所述 方法包括向所述哺乳動物的組織遞送DNA質粒疫苗，并且用能量脈沖以有效允許所述DNA 質粒進入所述細胞的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔。DNA質粒疫苗包含能夠在所述哺 乳動物的細胞中表達衍生自所述病毒的亞型的多種共有抗原以引發所述哺乳動物的免疫 反應的DNA質粒，所述多種共有抗原包括來自至少兩種不同病毒亞型的抗原結構域。所述 病毒選自已知具有不同血清型的許多病毒之一，并且優選地所述病毒將具有在不同血清型 之間高度保守的抗原結構域。優選地，所述病毒選自西尼羅病毒、人免疫缺陷病毒、流感病 毒或登革病毒。本發明的一個方面涉及引發哺乳動物針對多種登革病毒亞型的免疫反應的方法。 所述方法包括向所述哺乳動物的組織遞送DNA質粒疫苗，所述DNA質粒疫苗包含能夠在所 述哺乳動物的細胞中表達共有登革抗原以引發所述哺乳動物的免疫反應的DNA質粒，所述 共有登革抗原包含編碼包膜蛋白的結構域III的共有序列，所述包膜蛋白的結構域III來 自至少兩種登革亞型，以及優選地來自所有四種登革亞型。登革亞型包括亞型1、亞型2、亞 型3和亞型4。引發免疫反應的方法包括用能量脈沖以有效允許DNA質粒進入細胞的恒定 電流將所述組織的細胞電穿孔。在一些實施方案中，本發明的方法包括將DNA質粒疫苗注射到皮內組織、皮下組 織或肌肉組織的遞送步驟。優選地，這些方法包括使用體內電穿孔裝置來預先設定期望被 遞送到組織的電流；并且用能量脈沖以等于預設電流的恒定電流將所述組織的細胞電穿 孔。在一些實施方案中，電穿孔步驟還包括測量電穿孔的細胞中的阻抗；相對于測量的阻 抗調整能量脈沖的能量水平以保持電穿孔細胞中的恒定電流；其中所述測量和調整步驟發 生在能量脈沖的使用期內。在一些實施方案中，電穿孔步驟包括根據以分散模式遞送能量脈沖的脈沖序列模 式，將能量脈沖遞送至多個電極。本發明還包括編碼能夠在哺乳動物中引發免疫反應的多肽的DNA片段，所述免疫 反應基本上類似于至少一種登革病毒亞型的非片段的免疫反應。當所述DNA片段應用于 本文提供的特定編碼核酸序列時，它是選自于本發明的各種編碼核苷酸序列(包括SEQ ID N0:l、2、3、4和5)的至少一種的片段，并且可以是以下所述DNA片段中的任一種。在一些 實施方案中，DNA片段可包括30個或更多、45個或更多、60個或更多、75個或更多、90個或 更多、120個或更多、150個或更多、180個或更多、210個或更多、240個或更多、270個或更 多、300個或更多、320個或更多、340個或更多或者360個或更多的氨基酸。在一些實施方 案中，DNA片段可包括免疫球蛋白E(IgE)前導序列的編碼序列。在一些實施方案中，DNA片 段可以包括少于60、少于75、少于90、少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少 于270、少于300、少于320、少于340或少于360個核苷酸。優選地，DNA片段是SEQ ID NO: 1、2、3、4或5的片段，以及更優選地是SEQ ID NO :1、2、3或4的片段。本發明包括由編碼核苷酸序列所編碼的多肽并且可包括具有SEQID NO :6、7、8、9 或10的氨基酸序列的多肽。本發明還包括能夠在哺乳動物中引發免疫反應的多肽片段，所述免疫反應基本上類似于至少一種登革亞型的非片段的免疫反應。當所述多肽片段應用于 本文提供的特定多肽序列時，它們選自于本發明的各種多肽序列(包括SEQ ID N0:5、7、6、 8、9、和10)的至少一種，并且可以是以下所述多肽片段中的任一種。在一些實施方案中，多 肽片段可包括15個或更多、30個或更多、45個或更多、60個或更多、75個或更多、90個或 更多、100個或更多、110個或更多或者120個或更多的氨基酸。在一些實施方案中，多肽片 段可包括少于30、少于45、少于60、少于75、少于90、少于100、少于110或少于120個氨基 酸。優選地，多肽片段是SEQ ID NO :5、6、7、8、9或10的片段，以及更優選地是SEQ ID NO 5、6、7、8或9的片段。在哺乳動物中引發與至少一種登革亞型的非片段的免疫反應基本上類似的免疫 反應的功能片段的確定，可由本領域普通技術人員容易地確定。如由公共可利用的數據庫 例如國家生物技術信息中心(NCBI)所提供的，可分析所述片段以包含至少一個、優選地更 多個抗原表位。此外，可使用小鼠和抗體滴度以及酶聯免疫斑點分析常規地評估免疫反應 研究，例如在下文實施例中所示。疫苗在一些實施方案中，本發明通過提供蛋白質和編碼具有如下表位的蛋白質的遺傳 構建體而提供了改進的疫苗所述表位使得蛋白質特別有效地作為誘導免疫反應所針對的 免疫原。因此，可提供疫苗以誘導治療性或預防性免疫反應。根據本發明的一些實施方案，將根據本發明的疫苗遞送給個體來調節個體免疫系 統的活性并由此增強免疫反應。當編碼所述蛋白質的核酸分子被所述個體的細胞攝取時， 所述核苷酸序列在細胞中被表達并且所述蛋白質由此被遞送給個體。本發明的各方面提供 了將蛋白質的編碼序列遞送到核酸分子例如質粒上的方法。根據本發明的某些方面，提供了預防性和/或治療性免疫個體的組合物和方法。當被細胞攝取時，DNA質粒能夠作為分離的遺傳物質留在細胞中。可選擇地，RNA 可被施用至細胞。還包括提供作為線性微型染色體的遺傳構建體，包括著絲粒、端粒和復制 起點。遺傳構建體包括核酸分子的基因表達所必需的調控元件。所述元件包括啟動子、起 始密碼子、終止密碼子和聚腺苷酸化信號。此外，編碼靶蛋白或免疫調節蛋白的序列的基因 表達通常需要增強子。這些元件必須與編碼期望蛋白的序列可操作地連接，并且調節元件 必須可操作地處于施用它們的個體中。一般認為起始密碼子和終止密碼子是編碼期望蛋白的核苷酸序列的一部分。然 而，這些元件在施用核酸構建體的哺乳動物中必須是有功能的。起始密碼子和終止密碼子 與編碼序列必須處在框內。所使用的啟動子和聚腺苷酸化信號必須是在個體細胞中有功能的。實施本發明尤其是在人遺傳疫苗的生產中使用的啟動子的實例包括但不限于來 自猿猴病毒40(SV40)的啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、人免疫缺陷病毒(HIV) 例如牛免疫缺陷病毒(BIV)長末端重復(LTR)啟動子、莫洛尼(Moloney)病毒、禽類白細胞 增生病毒(ALV)、巨細胞病毒(CMV)例如CMV立即早期啟動子、EB病毒(EBV)、勞斯氏肉瘤 病毒(RSV)的啟動子，以及來自人類基因例如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌 肉肌酸和人金屬硫蛋白(metalothionein)的啟動子；在其他實施方案中，啟動子可以是天 然的或合成的組織特異性啟動子例如肌肉或皮膚特異性啟動子。此類啟動子的實例描述于美國專利申請公布號US20040175727中，其以全文并入本文。實施本發明尤其是在人遺傳疫苗的生產中使用的聚腺苷酸化信號的實例包括但 不限于SV40聚腺苷酸化信號、LTR聚腺苷酸化信號、牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化信號、人 生長激素(hGH)聚腺苷酸化信號和人珠蛋白聚腺苷酸化信號。具體而言，可使用PCEP4 質粒(Invitroger^San Diego, CA)中的SV40聚腺苷酸化信號，稱為SV40聚腺苷酸化信號。除了 DNA表達所需的調控元件之外，其他元件也可以被包括在DNA分子中。此類 其他元件包括增強子。增強子可選自于包括但不限于以下的組人肌動蛋白、人肌球蛋白、 人血紅蛋白、人肌肉肌酸和病毒增強子，例如來自CMV、RSV和EBV的增強子。遺傳構建體可與哺乳動物復制起點一起被提供以便使構建體保持在染色體外，并 且在細胞中產生構建體的多個拷貝。來自Invitrogen (SanDiego，CA)的質粒pVAXl、pCEP4 和pREP4包含EB病毒的復制起點和產生未整合的高拷貝附加型復制的核抗原EBNA-I編碼 區。為了使蛋白質的產生最大化，可選擇很好地適合施用構建體的細胞中基因表達的 調控序列。此外，可選擇在所述宿主細胞中被最有效率地轉錄的編碼所述蛋白質的密碼子。 本領域普通技術人員可生產在細胞中有功能的DNA構建體。在一些實施方案中，可提供其中本文所述蛋白質的編碼序列與IgE信號肽相連的 核酸構建體。在一些實施方案中，本文所述的蛋白質與IgE信號肽相連。在使用蛋白質的一些實施方案中，例如，本領域普通技術人員可使用公知技術生 產并使用公知技術分離本發明的蛋白質。在使用蛋白質的一些實施方案中，例如，本領 域普通技術人員可使用公知技術將編碼本發明的蛋白質的DNA分子插入到在公知表達 系統中使用的可商購獲得的表達載體中。例如，可商購獲得的質粒PSE420 (Invitrogen， San Diego, Calif.)可被用于在大腸桿菌(E. coli)中生產蛋白。例如，可商購獲得的質 粒 pYES2(Invitrogen，San Diego, Calif.)可被用于在酵母的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的生產。例如，可商購獲得的MAXBAC 完整桿狀病毒表達系統 (Invitrogen, San Diego，Calif.)可用于在昆蟲細胞中的生產。例如，可商購獲得的質 粒pcDNA或pcDNA3 (Invitrogen，San Diego, Calif.)可用于在哺乳動物細胞，例如中華倉 鼠卵巢(CHO)細胞中的生產。本領域普通技術人員可使用這些商購表達載體和系統或其 他載體和系統通過常規技術和可容易獲得的起始材料生產蛋白質(參見例如Sambrook等 人，Molecular Cloning a LaboratoryManual (分子克隆實驗指南)，第二版· Cold Spring Harbor Press (1989)) 0因此，可以在原核系統和真核系統中制備期望蛋白，產生蛋白質的 一系列加工形式。本領域普通技術人員可使用其他可商購獲得的表達載體和系統，或者使用公知方 法和容易獲得的起始材料來生產載體。包含必要的調控序列例如啟動子和聚腺苷酸化信號 以及優選地包含增強子的表達系統可容易地獲得并且在本領域中對于各種宿主是已知的。 參見例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning a Laboratory Manual (分子克隆實驗指 南)，第二版.Cold Spring Harbor Press (1989) 0基因構建體包括與啟動子可操作地連接 的蛋白質編碼序列，所述啟動子在轉染構建體的細胞系或靶組織的細胞中是有功能的。組 成型啟動子的實例包括來自巨細胞病毒(CMV)或SV40的啟動子。誘導型啟動子的實例包 括小鼠乳腺白血病病毒或金屬硫蛋白的啟動子。本領域普通技術人員可從容易獲得的起始材料中容易地生產用于用編碼本發明的蛋白質的DNA轉染細胞的遺傳構建體。將包括編碼 蛋白質的DNA的表達載體用來轉化相容的宿主，然后將所述宿主在其中發生外源DNA表達 的條件下培養并保持。通過溶解細胞或者從適當的和本領域技術人員已知的培養基中將產生的蛋白質 從培養物中回收。本領域普通技術人員可使用公知技術來分離使用此類表達系統生產的蛋 白質。使用與以上所述的特定蛋白特異性結合的抗體從自然來源中純化蛋白質的方法可同 樣地應用于通過重組DNA方法產生的純化蛋白質。除了通過重組技術生產蛋白質之外，還可以采用自動化肽合成儀來生產分離的、 基本上純的蛋白。此類技術對于本領域普通技術人員是公知的，并且如果具有替代的衍生 物沒有在DNA編碼的蛋白質的生產中提供的話，此類技術是有用的。可使用幾種公知技術中的任一種遞送核酸分子，所述技術包括有和沒有體內電 穿孔的DNA注射(也稱為DNA接種)，脂質體介導，納米顆粒促進，重組載體例如重組腺病 毒、重組腺病毒相關病毒和重組牛痘苗。優選地，本文所述的核酸分子例如DNA質粒是通過 DNA注射連同體內電穿孔遞送。施用途徑包括但不限于肌內、鼻內、腹膜內、皮內、皮下、靜脈內、動脈內、眼內 和口服以及局部地、經皮、通過吸入或栓劑或者至粘膜組織例如通過灌洗至陰道、直腸、 尿道、頰或舌下的組織。優選的施用途徑包括肌內、腹膜內、皮內和皮下注射。遺傳構建 體可以通過如下手段施用，包括但不限于常規注射器、無針注射裝置、“微彈轟擊基因槍 (microprojectile bombardment gone gun) ”或其他物理方法例如電穿孔(“EP”)、“流體 動力學方法”或超聲。用于促進本發明的DNA疫苗的遞送的優選的電穿孔裝置和電穿孔方法的實例 包括在Draghia-Akli等人的美國專利號7，245,963、Smith等人遞交的美國專利公開 2005/0052630中描述的實例，兩篇文獻的內容通過引用將它們的全部內容并入本文。還優 選下述文獻中提供的用于促進DNA疫苗的遞送的電穿孔裝置和電穿孔方法2007年10月 17號提交的共同待審和共有擁有的美國專利申請系列號11/874072，它依據美國法典第35 條119款要求享有2006年10月17日提交的美國臨時申請序列號60/852，149和2007年 10月提交的60/978，982的權益，所有這些文獻均將其全部內容并入本文。Draghia-Akli等人的美國專利號7，245，963描述了標準電極系統和它們用于促 進將生物分子導入身體或植物內選定組織的細胞中的用途。標準電極系統包括多個針狀電 極；皮下針；提供從程序化恒定電流脈沖控制器到所述多個針狀電極的傳導連接的電連接 器；以及電源。操作者可以抓住裝在支撐結構上的多個針狀電極并將它們牢固地插入到身 體或植物內的選定組織中。然后將生物分子通過皮下針遞送到選定組織中。程序化恒定電 流脈沖控制器被激活，并且恒定電流的電脈沖被應用到多個針狀電極。應用的恒定電流電 脈沖促進生物分子導入到多個電極之間的細胞中。美國專利號7，245，963的全部內容通過 引用并入本文。Smith等人遞交的美國專利公開2005/0052630描述了可被用來有效促進生物分 子導入到身體或植物內選定組織的細胞中的電穿孔裝置。所述電穿孔裝置包括由軟件或固 件指定操作的電動裝置(“EKD裝置”)。EKD裝置基于使用者的控制和脈沖參數的輸入在 陣列中的電極之間產生一系列可程序化的恒定電流脈沖模式，并且允許電流波形數據的存
15儲和獲取。電穿孔裝置還包括具有針狀電極陣列的可替代的電極盤、用于注射針的中心注 射通道以及可移去的引導盤。美國專利公開2005/0052630的全部內容通過引用并入本文。美國專利號7，245，963和美國專利公開2005/0052630中描述的電極陣列和方法 適合用于深深穿入例如肌肉的組織以及其他組織或器官。因為電極陣列的配置，注射針 (遞送選擇的生物分子)也被完全插入到靶器官中，并且注射被垂直施用至由電極預先劃 定的區域中的靶組織。在美國專利號7，245，963和美國專利公開2005/005263中描述的電 極優選地是20mm長以及21厚度(gauge)。以下是本發明的方法的一個實例，并且在以上討論的專利參考文獻中更詳細地被 討論可以配置電穿孔裝置來將產生的恒定電流的能量脈沖遞送至哺乳動物的期望組織， 所述恒定電流類似于使用者的預設電流輸入。電穿孔裝置包括電穿孔部件和電極組件或手 柄組件。電穿孔部件可包括并摻入電穿孔裝置的各種元件中的一個或多個，包括控制器、 電流波形發生器、阻抗測驗器、波形記錄器、輸入元件、狀態報告元件、通信端口、記憶部件、 電源和電源開關。電穿孔部件能夠作為電穿孔裝置的一個元件起作用，并且其他元件是與 電穿孔部件保持聯系的分開的元件(或部件)。在一些實施方案中，電穿孔部件能夠作為多 于一個電穿孔裝置的元件起作用，它還能夠與電穿孔裝置的其他元件保持聯系，所述其他 元件與電穿孔部件是分開的。本發明不受作為機電裝置或機械裝置的零件存在的電穿孔裝 置的元件限制，因為所述元件能夠作為一個裝置或者作為彼此保持聯系的分開的元件起作 用。電穿孔部件能夠遞送在期望組織中產生恒定電流的能量脈沖，并且包括反饋機制。電極 組件包括在空間排布中具有多個電極的電極陣列，其中所述電極組件接收來自電穿孔部件 的能量脈沖并且將此能量脈沖通過電極遞送到期望組織。多個電極中的至少一個在遞送能 量脈沖的過程中是中性的，并且測量期望組織中的阻抗，并且將該阻抗傳遞到電穿孔部件。 反饋機制能夠接收測量的阻抗并且能調整由電穿孔部件遞送的能量脈沖以保持恒定電流。在一些實施方案中，所述多個電極能夠以分散模式遞送能量脈沖。在一些實施方 案中，所述多個電極能夠通過在程序序列下控制電極以分散模式遞送能量脈沖，并且所述 程序序列是由使用者輸入到電穿孔部件中。在一些實施方案中，程序序列包括按順序遞送 的多個脈沖，其中多個脈沖中的每個脈沖是通過至少兩個活性電極和測量阻抗的一個中性 電極遞送，并且其中多個脈沖中的隨后脈沖是通過至少兩個活性電極中不同的一個和測量 阻抗的一個中性電極遞送。在一些實施方案中，反饋機制是通過硬件或軟件執行的。優選地，反饋機制是通過 模擬閉合環路執行的。優選地，這種反饋每50 μ s、20 μ S、10 μ s或1 μ s發生，但優選地是 實時反饋或是瞬時反饋(即如通過用于確定反應時間的可用技術所確定的基本上瞬時的 反饋)。在一些實施方案中，中性電極測量期望組織中的阻抗并且將該阻抗傳遞至反饋機 制，該反饋機制響應該阻抗，并調整能量脈沖以將恒定電流保持在與預設電流類似的值。在 一些實施方案中，反饋機制在遞送能量脈沖的過程中連續地并瞬時地保持恒定電流。藥學上可接受的賦形劑可包括例如運載體、佐劑、載體或稀釋劑這類公共已知并 且可容易獲得的功能分子。優選地，藥學上可接受的賦形劑是佐劑或轉染促進劑。在一些 實施方案中，將核酸分子或DNA質粒遞送至細胞，并且施用多核苷酸功能增強劑或遺傳疫 苗促進劑(或轉染促進劑)。多核苷酸功能增強劑描述于美國系列號5，593，972,5, 962，428 和1994年1月26日提交的國際申請系列號PCT/US94/00899中，這些文獻各自通過引用并入本文。遺傳疫苗促進劑描述于1994年4月1日提交的美國系列號021，579中，其通過引 用并入本文。轉染促進劑能夠與核酸分子一起作為與核酸分子的混合物施用，或者在核酸 分子施用的同時、之前或之后分開施用。轉染促進劑的實例包括表面活性劑，例如免疫刺激 復合物(ISCOMS)；弗氏不完全佐劑；LPS類似物，包括單磷酰脂質A ；胞壁酰肽；醌類似物以 及小泡例如角鯊烯和角鯊烯；并且也可以使用透明質酸與遺傳構建體聯合施用。在一些實 施方案中，DNA質粒疫苗還可以包括轉染促進劑，例如脂質；脂質體，包括卵磷脂脂質體或 本領域其他已知脂質體，為DNA脂質體混合物(參見例如W09324640)；鈣離子；病毒蛋白； 聚陰離子；聚陽離子或納米顆粒；或者其他已知的轉染促進劑。優選地，轉染促進劑是聚陰 離子、聚陽離子，包括聚L谷氨酸(LGS)或脂質。在一些優選的實施方案中，將DNA質粒與佐劑一起遞送，所述佐劑是進一步增強 針對此類靶蛋白的免疫反應的蛋白質的基因。此類基因的實例是那些編碼其他細胞因子 和淋巴因子的基因，所述細胞因子和淋巴因子例如α-干擾素、Y-干擾素、血小板衍生的 生長因子(PDGF)、TNF-α、TNF-β、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、IL-U IL-2、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86和IL-15，包括信號序列被刪除并任選地包括 來自IgE的信號肽的IL-15。可能有用的其他基因包括編碼以下的基因MCP-1、MIP-I 口、 MIP-lp、IL-8、RANTES、L-選擇素、P-選擇素、E-選擇素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM_l、LFA-I、 VLA-I、Mac-I、ρ150· 95、PECAM、ICAM-U ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18的突變體形式、⑶40、⑶40L、血管生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-7、神經生長 因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF 受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、 LARD、NGRF, DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶 ICE、Fos、c_jun、Sp-U Ap-l、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、無活性 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素 反應基因、NFkB、Bax, TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配 體、0x40、0x40 配體、NKG2D、MICA、MICB, NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPl、TAP2 以 及它們的功能片段。根據本發明的DNA質粒疫苗包含的DNA量為從約1納克到100毫克；約1微克到 約10毫克；或者優選地約0.1微克到約10毫克；或者更優選地約100微克到約1毫克。在 一些優選的實施方案中，根據本發明的DNA質粒疫苗包含約5納克到約1000微克的DNA。 在一些優選的實施方案中，DNA質粒疫苗含有約10納克到約800微克的DNA。在一些優選 的實施方案中，DNA質粒疫苗含有約0. 1微克到約500微克的DNA。在一些優選的實施方案 中，DNA質粒疫苗含有約1微克到約350微克的DNA。在一些優選的實施方案中，DNA質粒 疫苗含有約25微克到約250微克的DNA。在一些優選的實施方案中，DNA質粒疫苗含有約 100微克到約1毫克的DNA。根據待使用的施用方式配制根據本發明的DNA質粒疫苗。在DNA質粒疫苗是可注 射的組合物的情況中，它們是滅菌的和/或無熱原的和/或無顆粒的。優選地使用等滲制 劑。一般來說，等滲性的添加劑可包括氯化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在一些情況 中，優選等滲溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水。穩定劑包括明膠和白蛋白。在一些實施方案中， 將血管收縮劑加到制劑中。在一些實施方案中，使得制劑在室溫或環境溫度下穩定延續的 一段時間的穩定劑例如LGS或其他聚陽離子或聚陰離子被加到制劑中。在一些實施方案中，引發哺乳動物針對共有登革抗原的免疫反應的方法包括誘導粘膜免疫反應的方法。此類方法包括向所述哺乳動物施用一種或多種CTACK蛋白、TECK蛋 白、MEC蛋白和它們的功能片段或它們的可表達的編碼序列以及包括以上所述的共有登革 抗原的DNA質粒。一種或多種CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白和它們的功能片段可以在 本文提供的DNA質粒登革疫苗的施用之前、同時或之后施用。在一些實施方案中，向哺乳 動物施用分離的核酸分子，所述核酸分子編碼一種或多種選自由以下組成的組的蛋白質 CTACK, TECK, MEC和它們的功能片段。
實施例在以下實施例中進一步舉例說明了本發明。應當理解這些實施例指出本發明的優 選實施方案時，僅通過舉例說明方式被給出。由以上討論和這些實施例，本領域技術人員能 夠確定本發明的必要特征，并且在不背離本發明的精神和范圍的情況下，能夠對本發明進 行各種變動和改良以使其適合于各種運用和條件。因此，由上述描述，本發明的各種改良以 及本文示出并描述的那些改良對本領域技術人員將是明顯的。此類改良也旨在落入所附權 利要求書的范圍之內。優選地，供本文所述的肌肉或皮膚EP裝置使用的DNA制劑具有小體積的高DNA濃 度，優選包括微克到數十毫克量的、并且優選毫克量的DNA濃度，所述小體積對于遞送到皮 膚是最佳的，優選小注射體積，理想的是25-200微升(yL)。在一些實施方案中，所述DNA 制劑具有高DNA濃度，例如lmg/mL或更大(mg DNA/制劑體積)。更優選地，DNA制劑具有 的DNA濃度提供了在200 μ L的配方中的克量的DNA，并且更優選在100 μ L的配方中克量的 DNA。可使用已知裝置與技術的組合配制或制造供本發明的EP裝置使用的DNA質粒，但 優選地使用在以下文獻中描述的優化的質粒制造技術來制造它們美國申請第12/126611 號，它作為2009年1月1日公開的美國公開第20090004716號而公開。在一些實例中，在 這些研究中使用的DNA質粒能夠以大于或等于lOmg/mL的濃度配制。除了在美國公開第 20090004716號中描述的和在2007年7月3日提交的美國專利第7，238，522號中描述的 裝置和方案之外，制造技術還包括或結合了本領域普通技術人員通常知道的各種裝置和方 案。供本文描述的皮膚EP裝置和遞送技術使用的高濃度質粒允許質粒以相當低的體積施 用到ID/SC空間中并且幫助增強表達和免疫作用。公開文本美國公開第20090004716號和 美國專利第7，238，522號均將其整體在此并入。實施例1 登革DIII表達構建體從GeneBank收集來自不同地理人口的大約15個亞型序列以避免取樣偏倚。所 有使用的序列均是非重組的。利用應用程序Clustal X(l. 81版本)進行登革包膜(登革 E)DIII序列的多重比對，在Clustal X中成對比對參數被設定到動態緩慢-準確程序設 計(slow-accurateprogramming)，使用 10 作為空位開□罰分(gap opening penalty)且 0. 1作為空位延伸罰分(gap extension penalty) 0多重比對參數包括等于0. 2的空位延 伸罰分。在進行多重比對和一些較少的手動調整之后獲得了登革E共有核苷酸序列。使用 推導的氨基酸序列來指導比對空位的引入以使得這些空位在密碼子之間插入。通過使用 GeneOptimizer (GENEART, Germany)進行密碼子優化和RNA優化。將密碼子優化的合成序 列進一步克隆到PVAX哺乳動物表達質粒的KpnI/PstI位點中。
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圖1圖示了登革多肽的結構和登革E的構象特征。登革E由三種不同的結構域 I、II和III組成。從NCBI數據庫選擇登革E DIII結構域的氨基酸序列并對其進行比對 以產生共有序歹Ij :DV-1 Dili (SEQ ID N0:1)、DV_2 DIII(SEQ ID NO :2)、DV_3 DIII(SEQ ID N0:3)和DV-4DIII(SEQ ID NO :4)。集合來自不同毒株的氨基酸序列用于使用Lasergene 7 (DNA Star Inc,Madison, WI)比對。將位于Kozak序列之后的Ig-E前導序列融合到編碼 序列的N端。基于氨基酸序列，使用GeneartInc的軟件工具產生了人類優化的合成基因序 列并將其克隆到PVAX載體中。編碼亞型-1、亞型-2、亞型-3和亞型-4的登革包膜DIII 結構域的表達載體分別稱為pDV-1 DIII、pDV-2 DIII、pDV_3 DIII和pDV_4 Dili。質粒圖 譜在圖4a中提供。構建了組合所有四種DIII結構域(通用的或通用DIII)的構建體并將其稱為 DV-U-DIII (SEQ ID NO :5)，所述四種DIII結構域是由蛋白水解切割序列分開。圖3示出可 讀框的結構以及氨基酸序列的簡圖，以所述氨基酸序列為基礎合成了人類優化的基因。將 DV-U-DIII克隆到pVAX載體中以產生通用表達構建體pDV-U-DIII，其質粒圖譜可見于圖 4b中。實施例2登革DIII結構域在哺乳動物系統中的表達白紋伊蚊C6/36細胞、Vero、HEK293、HeLa、RD和BHK細胞是從美國標準生物品保藏 中心(Manassas，VA)獲得。在28C于5% CO2中，將C6/36細胞保持在補充有10%熱滅活胎牛 血清(FBS)、青霉素G(100U/ml)、鏈霉素(lOOug/ml)、L_谷氨酰胺和非必需氨基酸的伊格爾 最低基礎培養基(EMEM;Gibco BRL)中。在37°C于5% CO2中，將Vero細胞保持在含有115mM HEPES緩沖液，補充有10%熱滅活胎牛血清、青霉素G(100U/ml)、鏈霉素(100ug/ml)、L_谷 氨酰胺和非必需氨基酸的的達爾伯克改良的伊格爾培養基(DMEM)-F12 (GibcoBRL)中。在 37°C于5% CO2中，將HEK293、HeLa和RD細胞保持在補充有10%熱滅活胎牛血清、青霉素 G(100U/ml)、鏈霉素(100ug/ml)的 DMEM 培養基中。所用的病毒包括DENV 1病毒、DENV 2、原型DENV 3 (H 87毒株)和原型DENV 4(H241)。登革病毒的所有實驗使用的臨床病毒分離物和原種在細胞培養物中傳代少于四 次。通過用在Iml的EMEM-2% FBS中稀釋的200ul病毒接種75-cm2組織培養瓶中的單層 C6/36細胞獲得病毒原種。在一小時之后，加入14ml補充有2% FBS的EMEM，并且在28C在 5%的CO2下將細胞培養10天。將上清液從細胞移出并以2000X g離心5分鐘以沉淀細胞 碎片。將上清液等分并儲存在80°C。使DENVl在Vero細胞中生長并傳代，而DENV 4(H241) 在以上所述的C6/36細胞中生長并在Vero細胞中傳代一次。因為基于pVAX的登革DIII疫苗構建體不包括另外的合成表位，所以利用RT-PCR 方法來檢測編碼DIII結構域的mRNA轉錄物的存在。用DIII表達構建體(獨立地，四種血 清型中的每一種和通用血清型)轉染人橫紋肌肉瘤細胞系RD細胞，并且在轉染后兩天，從 轉染的細胞中制備總RNA。使用每種登革病毒血清型的特異性引物，進行RT-PCR來擴增相 應的DIII結構域。圖5是顯示來自轉染細胞的擴增的DIII片段的凝膠照片，所述擴增的 DIII片段是由表示長度為360bp片段的條帶表示。模擬轉染的細胞(用空pVAX載體轉染) 沒有顯示這些擴增的產物。這項研究證實來自轉染細胞的用于DIII表達的mRNA轉錄物的 存在。因此這些DNA構建體表明蛋白質產物的表達。
除了這些基于pVAX的DNA構建體之外，構建了另外一組DNA構建體來表達相 似的蛋白質產物。出于免疫檢測的目的，這些構建體包括登革病毒DIII結構域與合成 FLAG (Sigma Co.)表位的融合體(稱為FLAGGED構建體)。用FLAGGED構建體轉染RD細胞， 并且在轉染后三十六小時，用免疫熒光測定法，使用抗FLAG單克隆抗體(SigmaCo.)分析細 胞。來自pDV-U-DIII的單獨的所有四種DIII結構域和組合的DIII結構域或通用 DIII (或通用登革抗原)的表達模式是相同的，如從蛋白質的細胞質定位模式所證明(參 見圖6)。幾份報告已經很好地證明了全長登革E的表達產生典型的細胞質型。因此，單獨 的DIII的表達模式與全長登革E的表達模式一致。放射標記的登革E DIII蛋白由這些 FLAGGED構建體產生，并且在SDS-PAGE凝膠中分析。這些蛋白質的遷移率與16kDa左右質 量的蛋白質對應，如在圖7的凝膠照片中所示。組合的DIII結構域的分子質量顯示出總體 上約為50kDa。實施例3使用細菌表達和純化系統從所有四種亞型合成和產生DENV E DIII蛋白通過用包括編碼的DIII結構域的pQE載體轉化，在大腸桿菌中表達了代表所有四 種登革血清型的DIII結構域的包膜區(295-415)。登革E-DIII的預測大小是約16kDa。細 菌溶胞產物的SDS-PAGE (SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳)示出在(異丙基β _D_1_硫代半乳吡 喃糖苷)IPTG誘導的大腸桿菌培養物中過量表達的預期大小的蛋白質。IPTG通常用作誘導 β _乳糖苷酶的活性的異乳糖的分子模擬物。此外，在鎳柱(具有結合聚組氨酸標記的重組 蛋白的能力的鎳螯合柱)洗脫的級分中出現的蛋白質條帶的顯現與具有IPTG處理的溶胞 產物的柱中出現的主要條帶的遷移率相對應。來自PQE載體轉化的樣品的未處理(Un)和 IPTG處理(In)的兩種樣品的溶胞產物(圖8，前兩個泳道)沒有顯示對應于DIII結構域 的蛋白質條帶。這個結果證實純化的蛋白質是在IPTG誘導時從pQE載體表達構建體中表 達的登革DIII結構域(圖8)。實施例4用pDV-U-DIII疫苗候選物經EP (使用CELLECTRA)免疫小鼠和DV-U-DI11血清針 對DIII結構域的特異性根據圖9中圖示的方案，用質粒DNA構建體(如以上實施例1中所述)免疫小鼠。將四周鼠齡的Balb/c小鼠的各組(η = 4)用15ug pDV_U DIII和剩余的單個Dili 表達載體肌內免疫。PVAX用作對照載體。在免疫之前，使用通過眼靜脈采血的現有方案收 集免疫前血液樣品。在所有實驗中使用方波脈沖(Draghia-Akli和Smith，2003)并用恒定 電流 CELLECTRA 電穿孔儀(VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, PA)遞送。在小鼠實驗中 使用三電極陣列(3-EA)。3-EA是由三個等腰三角形結構的26規格的實心不銹鋼電極組成， 其中兩個長邊長度為0. 5mm且短邊長度為0. 3mm，這三個電極用不導電的塑料合在一起。小 鼠實驗的特定EP條件是使用恒定電流，0. 1安培，三個脈沖，52毫秒/脈沖，脈沖間隔4秒。 質粒注射與EP之間的滯后時間為約20秒。質粒施用/EP的事件順序如下進行將可處理的電極組件安放在手柄的插孔中， 按壓手柄上的啟動按鈕，進入動物實驗組編號，使用胰島素注射器注射50ul的DNA構建體 (15ug總DNA)質粒，將針立即放到注射部位周圍的區域中，按壓手柄上的啟動按鈕，并且在4秒的倒數計秒之后，遞送脈沖。在電穿孔5秒后，將陣列從肌肉輕輕地移出。在所有處理 過程中，所有的電極被完全插入到肌肉中。所有DNA使用無內毒素的Qiagen柱制備。將動 物圈養在賓夕法尼亞大學的溫度受控的、光循環的設施中，并且動物護理按照美國國家衛 生研究所和賓夕法尼亞大學的指引。通過ELISA測定了在第三次加強免疫之后從單個小鼠獲得的血清樣品的DENV抗 體滴度。所有的小鼠產生抗DIII抗體。由免疫的小鼠產生的抗DENV E DIII的抗體滴度 是通過ELISA測定，使用純化的DIII片段作為捕獲抗原而確定。將抗原捕獲在鎳涂覆的 ELISA板中，然后針對來自接種pDV-U-DIII的小鼠的血清對抗原測試。如在圖10中所示，用 pDV-U-DIII免疫的小鼠的血清展示出高水平的ELISA反應性，而pVAX免疫的小鼠的血清 的反應性可忽略不計(數據未顯示)。就抗DIII結構域的抗體的產生來說，在pDV-U-DIII 接種前和接種后的小鼠之間也存在巨大差異。由單個DIII結構域表達構建體產生的抗體 滴度的水平顯著低于由pDV-U-DIII疫苗候選物引發的抗體滴度。基于這個ELISA數據，我 們決定用從用pDV-U-DIII疫苗候選物免疫的小鼠中收集的抗DIII血清進行后面所有的分 析。檢查了從用pDV-U-DIII構建體免疫的小鼠中收集的血清與所有四種血清型的 DIII結構域反應的能力。將IPTG誘導的細菌溶胞產物以及所有四種血清型的純化的DIII 結構域在SDS-PAGE凝膠中分析，并通過蛋白質印跡分析進行免疫探測，使用pDV-U-DIII血 清作為潛在的抗登革DIII血清。使用綴合HRP的抗小鼠抗體來檢測抗原_抗體復合物，并 使用化學發光系統來檢測免疫反應。D-U血清清楚地識別來自IPTG誘導的溶胞產物以及所 有四種血清型的鎳洗脫的樣品這兩者的DIII蛋白。與DIII抗原特定結合而不與粗制溶胞 產物的其他蛋白樣品結合得出血清與DIII抗原之間的特異性反應的直接證據(參見分辨 的條帶，包括多聚體條帶，在圖11中)。血清識別整體上約16kDa的分子，該質量等同于由 純化的DIII片段顯示的質量。還檢查DV-U-DIII血清來驗證它是否能夠與用所有四種DIII結構域單獨轉染的 細胞中表達的DIII抗原結合。出于這個目的，用這些編碼DIII的pVAX表達構建體瞬時轉 染HeLa細胞，并且在轉染后三十六小時，固定細胞用于免疫熒光分析。首先，使用FuGENE 6轉染試劑(Roche)用登革疫苗構建體和pVAX(lmg/孔)轉 染細胞。在用抗小鼠登革抗體或來自接種PDV-U DIII的小鼠的血清孵育轉染的細胞90 分鐘后，用四甲基羅丹明異硫氰酸酯綴合的第二抗體(Sigma-Aldrich)孵育玻片45分鐘。 將40，6-二氨基-2-苯基吲哚鹽酸鹽(Sigma-Aldrich)加入到第二抗體的溶液中來將細 胞核復染色以顯示出在給定區域中可用的細胞總數的細胞核。使用熒光顯微鏡(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)的三相 Pro 程序(Phase 3 Proprogram)分析圖像。抗DV-U-DIII血清對于未轉染的HeLa細胞和pVAX轉染的HeLa細胞(從ATCC，Va 接受)兩者沒有產生任何顯著的染色。然而，DV-U-DIII血清對于單獨的DIII抗原產生了 高特異性的染色(圖12)。最重要的是，表達DIII的細胞主要展現細胞質定位方式。這一 觀察與用FLAG表位標記的DIII表達載體進行的免疫熒光研究一致，該研究使用靶向融合 FLAG表位的DIII蛋白質的抗FLAG抗體，如圖6所示。實施例5:來自pDV-U-DIII接種的小鼠的抗DIII血清與來自活病毒粒子的天然構象的E的完整DIII結構域的結合檢測DV-U DIII血清抗登革2感染的細胞以觀察該抗DIII血清是否可與登革2 病毒反應。自然地，認為DIII結構域被定位在病毒外表面上的登革E三維構型的峰區中。在BHK-21 (幼倉鼠腎細胞系；ATCC，Manassas, Va)細胞中擴增登革2病毒以達到 高滴度。此外，將這種高滴度病毒原種用來感染Vero細胞(ATTC，Manassas，Va)。在感染四 天后，按以上實施例4中概述的方案，登革2感染的細胞用抗DV-U DIII血清、接著用FITC 綴合的抗小鼠抗體染色。抗DV-U DIII血清對于未感染的細胞不能產生任何不同的染色類 型。這種血清僅與被登革2亞型病毒感染的細胞反應。從接種pVAX的小鼠中收集的血清 也不與感染登革2的Vero細胞和未感染的Vero細胞反應。因此，只有接種DV-U-DIII的 小鼠產生能夠識別登革E的DIII結構域的抗DIII抗體(圖13)。檢測DV-U DII血清抗感染了所有四種登革亞型的細胞以觀察該抗DIII血清是否 可與所有這四種類型的感染細胞反應。使室型玻片(chamber-slide)中生長過夜的Vero細胞用所有四種亞型的高滴度 病毒原種感染。在感染四天后，按照更早概述的方案，登革感染的細胞用抗DV-U DIII血 清、接著用FITC綴合的抗小鼠抗體染色。抗DV-U DIII血清對于未感染的細胞不能產生任 何不同的染色類型。這種血清僅與被登革亞型感染的細胞反應。有趣的是，從接種PVAX的 小鼠中收集的血清也不與感染登革的Vero細胞以及未感染的Vero細胞中任何一個反應。 因此，只有接種DV-U-DIII的小鼠產生能夠識別來自登革病毒粒子的E的DIII結構域的抗 DIII抗體(圖15)。上面的圖片表明受感染的細胞，而底部圖片顯示具有DAPI染色的相同 區域以表明在該區域中可用的細胞的核含量。這一觀察不僅表明在接種DV-U DIII的小鼠 中存在的抗DIII抗體與DIII抗原之間的特異性相互作用，而且表明這種抗體能夠與來自 登革病毒本身的天然構象的E的完整DIII結構域反應。實施例6:抗DIII血清針對各種登革病毒亞型的中和能力使用噬斑中和測定法確定針對pDV-U DIII產生的血清或免疫前血清(對照)對 DENVU DENV2、DENV3和DENV4的感染性的中和能力。使用來自以下的改良方案進行噬斑 減少中禾口試驗Russel 等人(APlaque Reduction Test for Dengue Virus Neutralizing Antibodies (登革病毒中和抗體的噬斑減少試驗).1967.第285-290頁)，Kochel，T. J.等 人(Effect of dengue-1 antibodies on American dengue-2 viral infection anddengue haemorrhagic fever (登革1抗體對美國登革2病毒感染和登革出血熱的作用).The Lancet, 2002. 360(9329)第 310-312頁)和Wu，S.-J. L.等人(Detection of Dengue Viral RNA Using a Nucleic AcidSequence-Based Amplification Assay(使用基于核酸序列的 擴增測定檢測登革病毒RNA). 2001.第2794-2798頁)。將病毒的原種與來自接種pDV-U-DIII的小鼠的抗DIII血清的不同稀釋物混合， 并且將得到的混合物在Eppendorf管中混合到200微升的DlO培養基(補充有10%胎牛 血清的DMEM培養基；Invitrogen)中。將這些混合物在37°C下在培養箱中保持一小時，然 后將其加到細胞(細胞在組織培養物室型玻片上被過夜接種)中以使Vero細胞能夠感染。 在用病毒的混合物孵育一小時后，用PBS徹底地洗滌細胞，并將細胞留在培養箱中另外與 細胞培養基一起孵育四天。這項測定的對照包括(1)未感染的Vero細胞，(2)用病毒原種感染的且未用任何血清處理的細胞，以及(3)用病毒原種感染的且用來自接種pVAX的小鼠 的血清處理的細胞。來自接種pDV-U-DIII的小鼠的抗DIII血清染色感染登革2的細胞而沒有任何模 糊(圖13)。此外，該血清對于未感染的細胞不能產生任何顯著染色。對于沒有用任何血 清處理的病毒原種，觀察到最高數目的染色的感染細胞。發現病毒感染的細胞數目在用抗 DIII血清處理的病毒原種感染的細胞中比在接受未處理的病毒原種的細胞中少。因此，用 抗DIII血清處理病毒原種降低了登革2病毒的滴度，如在圖14中所示的柱狀圖中所觀察 到的。通過使用來自登革1、登革3和登革4亞型的原種代替以上使用的登革2病毒原種 得到類似的中和結果。來自接種P-DV-U DIII的小鼠的抗DIII血清使用所有四種登革亞 型感染的細胞染色而沒有任何模糊。此外，觀察到該血清對于未感染的細胞沒有產生任何 顯著的染色。對于沒有用任何血清處理的病毒原種觀察到最高數目的染色的感染細胞。發 現病毒感染的細胞數目對于用抗DIII血清處理的病毒原種處理的細胞中比接受未處理的 病毒原種的細胞顯著降低。因此，用抗DIII血清處理病毒原種降低了感染性登革病毒粒子 的滴度。因此，來自接種PDV-U DIII的小鼠的血清含有抗DIII抗體，該抗體顯示出針對所 有四種登革亞型的中和能力。此外，測試pDV-U DIII血清的中和作用以確定其對由登革感染所引起的細胞病變 作用的影響。圖16示出使用具有各種登革亞型的DV-UDIII血清產生的中和數據(來自美 國南方研究所(Southern Researchlnstitute) ,Frederick，MD 的數據)。這個圖表明 DV-U DIII血清具有中和所有四種登革病毒亞型至高達1 1100的稀釋系數的能力。從接種 PVAX的小鼠收集的血清不能中和任何一種登革病毒亞型。實施例7針對登革E DIII抗原的B細胞激活 制備了接種DIII-DNA的小鼠的小鼠脾臟來測量B細胞能夠產生針對DIII蛋白的 抗體的頻率。將登革蛋白懸浮液解凍，將該管渦旋以懸浮細小的蛋白微粒。將重懸蛋白的小的 等份試樣溶解在緩沖液TU (62mM Tris-HCl/8M尿素，PH8.0)中以產生10ug/ml溶液。登 革蛋白在這種緩沖液中是可溶的。將IOOul稀釋蛋白的等份試樣(Iug)施加到Pierce HisGrab銅涂覆的高結合容量板(Pierce HisGrab Copper Coated High Binding Capacity Plate)的孔中，并且按照常規方案進一步分析這些抗原涂覆的鎳板(Yan，J.，等人.， Enhanced Cellular Immune Responses Elicited by an Engineered HIV-ISubtype B Consensus-based Envelope DNA Vaccine (由基于工程 HIV-1 亞型 B 共有區的包膜 DNA 疫 苗引發的增強的細胞免疫反應).Mol Ther. 15(2)第411-421頁)。在包含小鼠和猴模型 的未來研究中將應用相同的方案。對于IFN-γ的酶聯免疫斑點測定，具有跨所有四種血清 型的DIII區的10個重疊氨基酸的15mer肽將被用作抗原刺激物。從被激發的小鼠以及猴 受試者的脾臟中收集的細胞將使用這些測定法。酶聯免疫斑點測定的結果與以上所述的DIII抗體ELISA數據一致。在用pDV_U DIII接種的小鼠中觀察到比單獨接受單個DIII結構域的組更高的頻率的DIII特異性小鼠 抗體分泌細胞(圖17)。綜觀來說，此酶聯免疫斑點的結果表明，如ELISA研究所確定，與
23DIII特異性抗體的滴度相對應的高親和力抗原特異性B細胞的激活。實施例7:在獼猴(Rhesus Macaque)中登革中和抗體的產生可以用pDV-U-DIII登革表達構建體接種獼猴。在三次追加免疫之后，可以評定抗 體滴度，并且可以用所有四種登革病毒血清型攻擊該猴。使獼猴在實驗開始之前適應2個月。該研究可如下進行第0周-進行第一次免 疫(質粒劑量施用)和基線采血；第2周進行采血；第3周進行第二次免疫(質粒劑量施 用)；第5周進行采血；第6周進行第三次免疫(質粒劑量施用)和采血；8周進行采血。將這些受試者用濃度約lmg/ml (并且優選約10mg/ml)的pDV-UDIII制劑和 剩余的單個DIII表達載體肌內免疫。pVAX可用作對照載體。在所有實驗中將使用 方波脈沖(Draghia-Akli和Smith, 2003)并用恒定電流CELLECTRA 電穿孔儀(VGX Pharmaceuticals, Blue Bell, PA)遞送。選擇EP條件如下0. 5安培，三個脈沖，52毫秒， 脈沖間隔1秒。
權利要求
一種能夠表達引發哺乳動物針對多于一種登革病毒亞型的免疫反應的多肽的核酸構建體，所述核酸構建體包含表達所述多肽的編碼核苷酸序列，其中所述多肽包括來自至少兩種不同的登革病毒亞型的DIII結構域，在所述哺乳動物中調控所述多肽的表達并且與所述編碼核苷酸序列可操作地連接的啟動子。
2.如權利要求1所述的核酸構建體，還包含與所述編碼序列的N端末端可操作地連接 并且與所述啟動子可操作地連接的IgE前導序列。
3.如權利要求1-2中任一項所述的核酸構建體，還包含與所述編碼序列的C端末端相 連的聚腺苷酸化序列。
4.如權利要求1-3中任一項所述的核酸構建體，其中所述核酸構建體是密碼子優化的。
5.如權利要求1-4中任一項所述的核酸構建體，其中所述編碼核苷酸序列編碼包括來 自登革病毒_亞型1、登革病毒_亞型2、登革病毒-亞型3或登革病毒-亞型4或它們的 組合的DIII結構域的多肽。
6.如權利要求1-5中任一項所述的核酸構建體，其中所述編碼核苷酸序列選自由以下 組成的組:SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO :5。
7.—種能夠在哺乳動物中產生針對多種登革病毒亞型的免疫反應的DNA質粒疫苗，所 述疫苗包含能夠在所述哺乳動物的細胞中以有效引發所述哺乳動物的免疫反應的量表達共有登 革抗原的DNA質粒，所述共有登革抗原包括登革病毒_亞型1、登革病毒_亞型2、登革病 毒-亞型3或登革病毒-亞型4或它們的組合的共有DIII結構域，和 藥學上可接受的賦形劑；所述DNA質粒包含與編碼所述共有登革抗原的編碼序列可操作地連接的啟動子。
8.如權利要求7所述的DNA質粒疫苗，其中所述DNA質粒還包含與所述編碼序列的N 端末端相連并且與所述啟動子可操作地連接的IgE前導序列。
9.如權利要求7-8中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述DNA質粒還包含與所述編 碼序列的C端末端相連的聚腺苷酸化序列。
10.如權利要求7-9中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述DNA質粒是密碼子優化的。
11.如權利要求7-10中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述藥學上可接受的賦形劑 是佐劑。
12.如權利要求11所述的DNA質粒疫苗，其中所述佐劑選自由IL-12和IL-15組成的組。
13.如權利要求7-10中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述藥學上可接受的賦形劑 是轉染促進劑。
14.如權利要求13所述的DNA質粒疫苗，其中所述轉染促進劑是聚陰離子、聚陽離子或 脂質。
15.如權利要求13所述的DNA質粒疫苗，其中所述轉染促進劑是濃度小于6mg/ml的聚2L谷氨酸。
16.如權利要求7-15中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述DNA質粒疫苗具有Img/ ml或更大的總DNA質粒的濃度。
17.如權利要求7-16中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述DNA質粒包括多種單 一 DNA質粒，其中所述多種單一 DNA質粒的每一種編碼包含來自登革病毒-亞型1、登革病 毒-亞型2、登革病毒-亞型3或登革病毒-亞型4或它們的組合的DIII結構域的多肽。
18.如權利要求7-17中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述編碼核苷酸序列包括SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3、SEQ IDNO :4 或 SEQ ID NO :5。
19.如權利要求7-18中任一項所述的DNA質粒疫苗，所述疫苗包含表達登革病毒DIII 結構域的至少兩種不同的DNA質粒，所述質粒選自由以下組成的組包含編碼共有登革病毒-亞型1的DIII結構域的序列的DNA質粒， 包含編碼共有登革病毒-亞型2的DIII結構域的序列的DNA質粒， 包含編碼共有登革病毒-亞型3的DIII結構域的序列的DNA質粒，和 包含編碼共有登革病毒-亞型4的DIII結構域的序列的DNA質粒。
20.如權利要求7-19中任一項所述的DNA質粒疫苗，所述疫苗包含 所述包含編碼共有登革病毒-亞型1的DIII結構域的序列的DNA質粒， 所述包含編碼共有登革病毒-亞型2的DIII結構域的序列的DNA質粒， 所述包含編碼共有登革病毒-亞型3的DIII結構域的序列的DNA質粒，和 所述包含編碼共有登革病毒-亞型4的DIII結構域的序列的DNA質粒。
21.如權利要求7-20中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述共有登革病毒_亞型1 的DIII結構域是SEQ ID NO :1ο
22.如權利要求7-21中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述共有登革病毒_亞型2 的DIII結構域是SEQ ID NO :2。
23.如權利要求7-22中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述共有登革病毒_亞型3 的DIII結構域是SEQ ID NO :3。
24.如權利要求7-23中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述共有登革病毒-亞型4 的DIII結構域是SEQ ID NO :4。
25.如權利要求7-24中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述哺乳動物是非人的靈長類。
26.如權利要求7-25中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述免疫反應是體液反應。
27.如權利要求7-25中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述免疫反應是細胞反應。
28.如權利要求7-25中任一項所述的DNA質粒疫苗，其中所述免疫反應是聯合的體液 反應和細胞反應。
29.一種引發哺乳動物針對多種病毒亞型的免疫反應的方法，包括向所述哺乳動物的組織遞送DNA質粒疫苗，所述DNA質粒疫苗包含能夠在所述哺乳動 物的細胞中表達衍生自所述病毒的亞型的多種共有抗原以在所述哺乳動物中引發免疫反 應的DNA質粒，所述多種共有抗原包括來自所述病毒的至少兩種不同亞型的抗原結構域， 并且用能量脈沖以有效允許所述DNA質粒進入所述細胞的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔。
30.如權利要求29所述的方法，其中所述病毒包括西尼羅病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒或登革病毒。
31.如權利要求29-30中任一項所述的方法，其中所述遞送步驟包括 將所述DNA質粒疫苗注射到皮內組織、皮下組織或肌肉組織中。
32.如權利要求29-31中任一項所述的方法，還包括 預先設定期望被遞送到所述組織的電流；并且用能量脈沖以等于所述預設電流的恒定電流將所述組織的細胞電穿孔。
33.如權利要求29-32中任一項所述的方法，其中所述電穿孔步驟還包括 測量所述電穿孔細胞中的阻抗；相對于所述測量的阻抗調整所述能量脈沖的能量水平以在所述被電穿孔的細胞中保 持恒定電流；其中所述測量和調整步驟發生在所述能量脈沖的使用期內。
34.如權利要求29-33中任一項所述的方法，其中所述電穿孔步驟包括根據以分散模式遞送所述能量脈沖的脈沖序列模式將所述能量脈沖遞送至多個電極。
全文摘要
本發明的一個方面涉及能夠表達引發哺乳動物針對多于一種登革病毒亞型的免疫反應的多肽的核酸構建體和使用它們的方法。另外，存在能夠在哺乳動物中產生針對多種登革病毒亞型的免疫反應的DNA質粒疫苗和使用它們的方法，所述DNA質粒疫苗包含DNA質粒和藥學上可接受的賦形劑。所述DNA質粒能夠在所述哺乳動物的細胞中以有效引發所述哺乳動物的免疫反應的量表達共有登革抗原。
文檔編號A61K39/295GK101909635SQ200980101862
公開日2010年12月8日 申請日期2009年1月12日 優先權日2008年1月11日
發明者M·P·拉馬納桑, N·Y·薩德薩爾 申請人:Vgx藥品有限責任公司