一株hiv-1 crf01_ae亞型毒株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一株HIV-1CRF01_AE亞型毒株及其應用。本發明公開的一株人類免疫缺陷病毒Ⅰ型CRF01_AE亞型(Human Immunodeficiency Virus Type Ⅰ subtype CRF01_AE)病毒，其保藏號為CGMCC No.8787。本發明公開的HIV-1CRF01_AE亞型臨床分離株GX002可廣泛應用于治療艾滋病藥物的篩選，以及HIV-1復制能力相關研究，進而對艾滋病的防治研究具有重要的應用價值和意義。
CGMCC No.8787
2014.02.18
【專利說明】-株HIV-1CRF01_AE亞型毒株及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株Hiv-1CRF01_AE亞型毒株及其應用，屬于生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 由人類免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)引起的人類獲得性 免疫缺陷綜合征（Acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)自1985年傳入中國以來， 在中國的傳播范圍逐漸增大，傳播速率越來越快。其流行先后經歷了傳入期和擴散期，目前 進入快速增長期。根據中國性病艾滋病預防控制中心2014年第一季度的疫情報告，截至 2014年3月31日，全國報告現存或HIV/AIDS455352例，死亡140750例，現存活HIV感染 者275631例，AIDS病人179721例。性傳播成為主要的傳播途徑，占全部感染的大約90% (包括異性和同性）。中國政府對艾滋病防治高度重視，"十一五"起實施了艾滋病及病毒性 肝炎等傳染病防治科技重大專項，在項目的支持下，艾滋病診斷試劑、疫苗和其他生物預防 產品的研發正在快速推進。
[0003]HIV具有高度的變異性，這導致了HIV-1的多樣性，不僅表現在其基于病毒基因堿 基的組成和排列而區分出的繁多的亞型，更表現為即使是同亞型的病毒，其感染能力、復制 能力和對環境的適應能力也大相徑庭，這也導致了病毒在毒力上具有很大差別。而這些將 對艾滋病診斷試劑、疫苗和抗HIV-1藥物的研發和篩選產生深遠影響。
[0004] 病毒的毒力是指病毒感染宿主后能引起終末器官損傷的能力，體現為未經治療的 感染發展為艾滋病的速率。作為影響病毒毒力的主要因素之一，病毒的復制能力表現為在 宿主細胞內病毒顆粒增加的效率。對于抗HIV藥物來說，對臨床分離毒株復制能力的抑制， 是評價藥物藥效的重要標準之一；對于我國HIV-1復制能力相關研究來說，也需要一株高 復制能力的病毒毒株作為標準參考毒株來進行系統完善的比對分析。
[0005] 國家食品藥品監督管理局藥品審評中心（簡稱"國家藥監局藥審中心"）要求，評 價抗HIV藥物藥效必須采用三種病毒（實驗株、臨床分離株、耐藥株）進行體外實驗。目前 為止還沒有應用于艾滋病新藥評價的高復制能力的標準HIV-1臨床分離株，另一方面，我 國的HIV-1復制能力相關研究也因缺少高復制能力的標準HIV-1臨床分離株而受到制約。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一株HIV_1CRF01_AE亞型毒株及其應用，本發明提供的 HIV-1CRF01_AE亞型臨床分離株GX002可以應用于治療艾滋病藥物的篩選，以及HIV-1復制 能力相關研究。
[0007] 本發明提供一株人類免疫缺陷病毒I型CRF01_AE亞型（HumanImmunodeficiency VirusTypeIsubtypeCRF01_AE)病毒，其保藏號為CGMCCNo. 8787;
[0008] 所述病毒的全基因組序列如SEQIDNo.7所示；
[0009] 所述病毒為具有高復制能力的人類免疫缺陷病毒I型CRF01_AE亞型病毒。
[0010] 一種評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的試劑盒也屬于本發明的保護 范圍，該試劑盒包含上述病毒。
[0011] 一種評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的方法也屬于本發明的保護范 圍，包括如下步驟：
[0012] ⑴測定藥物對宿主細胞的半數中毒濃度，記作TC5Q ;
[0013] (2)測定藥物在宿主細胞/HIV-1GX002系統的抗病毒活性，得到藥物對病毒 HIV-1GX002的半數抑制濃度，記作IC5Q ;
[0014] (3)將步驟⑴得到的TC5Q和步驟⑵得到的IC5Q，帶入公式TI=TC5Q/IC5Q，計算 得到藥物的治療指數TI;
[0015] 所述宿主細胞/HIV-1GX002系統中所述HIV-1GX002可以在所述宿主細胞中進行 復制；
[0016] 所述HIV-1GX002為上述病毒。
[0017] 上述方法中，所述宿主細胞為具有輔助受體CCR5或CXCR4的細胞，具體為離體的 人外周血單核細胞。
[0018] 上述任一所述的方法中，所述步驟（1)的測定方法為MTT法；
[0019] 所述步驟（2)中的IC5Q是通過測定藥物在宿主細胞/HIV-1GX002系統的抗病毒活 性的細胞病變效應觀察法得到或通過檢測HIV-1P24抗原得到；
[0020] 所述檢測HIV-1P24抗原所采用的試劑盒的商品名稱為HIV-1P24抗原檢測試劑 盒，該試劑盒購自河北醫科大學生物醫學工程中心。
[0021] 上述病毒在制備評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制作用的產品中的應用也 屬于本發明的保護范圍。
[0022] 上述病毒在制備篩選對HIV-1病毒具有清除和/或抑制作用的產品中的應用也屬 于本發明的保護范圍。
[0023] 上述試劑盒在制備評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制作用的產品中的應用 也屬于本發明的保護范圍。
[0024] 上述試劑盒在制備篩選對HIV-1病毒具有清除和/或抑制作用的產品中的應用也 屬于本發明的保護范圍。
[0025] 上述病毒或上述試劑盒在制備篩選和/或評價藥物在預防和/或治療HIV-1病毒 引起的疾病的效果的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0026] 本發明提供的HIV_1CRF01_AE亞型臨床分離株GX002對艾滋病的防治研究具有 重要的應用價值和意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為以P24抗原濃度為指標測定的HIV-1毒株在人外周血單核細胞 (Peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)上的生長動力學曲線圖。
[0028] 圖2為以逆轉錄酶RT濃度為指標測定的HIV-1毒株在PBMCs上的生長動力學曲 線圖。
[0029] 圖3為GX002前病毒DNA的5 '半分子和3 '半分子PCR擴增產物電泳圖。

【具體實施方式】
[0030] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0031] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0032]HIST0PAQUE-1077 購自SIGMA，產品目錄號為 10771。
[0033]HIV-1P24抗原檢測試劑盒購自河北醫科大學生物醫學工程中心。
[0034]QIAampDNAMiniKit購自德國QiaGen公司，產品目錄號為51306。
[0035]實施例中表 1 所示引物在參考文獻"YongjianLiu,LinLi,ShaominYang,Zuoyi Bao,HanpingLi，ZhengWang,DaominZhuang,SiyangLiu,LiliChen,YishanFan,Min Zhong，LiGao,XiaolinWang,andJingyunLi:IdentificationandCharacterization ofTwoNewHIVTypelUnique(B/C)RecombinantFormsinChina.AIDSResHum Retroviruses. 20llApr;27 (4) : 445-51. " 中公開過。
[0036]pNL4. 3 質粒在文獻"WangC，MitsuyaY，GharizadehB，Ronaghi M，ShaferRW.Characterizationofmutationspectrawithultra-deep pyrosequencing:applicationtoHlV-ldrugresistance.GenomeRes.2007 ； 17 (8) : 1195-201.；HoffmannC,MinkahN,LeipzigJ,WangG,ArensMQ,TebasP,Bushman FD.NAbarcodingandpyrosequencingtoidentifyrareHIVdrugresistance mutations.NucleicAcidsRes. 2007 ;35 (13) :e91. "中公開過，公眾可從中國人民解放軍 軍事醫學科學院微生物流行病研究所獲得。PNL4. 3質粒含有HIV-1B亞型野生株的全基因 組序列，轉染細胞并表達可以得到HIV-1B亞型野生株NL4-3。
[0037]Lipofectamine2000 購自Invitrogen公司。
[0038]NL4-3病毒由pNL4. 3質粒轉染293T細胞表達獲得。該病毒的制備過程如下：用 DMEM培養基（含100IU/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素）重懸293T細胞，得到4X105個細 胞/ml的細胞懸液。將細胞懸液加入6孔培養板，每孔2ml，在C02培養箱中37°C培養24小 時，然后棄除上清，用PBS緩沖液洗絳兩次。按照Lipofectamine2000試劑盒說明書，將質 粒pNL4. 3轉染293T細胞，每孔轉染4微克pNL4. 3,在C02培養箱中37°C培養36小時，收 集上清，將上清用HIV-1P24抗原檢測試劑盒進行P24抗原測定，結果為陽性，該上清即為 HIV-1B亞型野生株NL4-3病毒液，分裝后-80°C保存。
[0039]HIV-1B亞型參考毒株IIIB_LAI病毒在文獻"MontagnierLuc，Krust Bernard,ChamaretSolange,ClavelFrancois,ChermannJeanClaude,BarreSinoussi Francoise，A1izonMarc,SonigoPierre,StewartCole,DanosOlivier,Wain HobsonSimon:Envelopeantigensoflymphadenopathyassociatedvirusand theirapplications.PasteurInstitut，CentreNatRechScientNovember 20, 1986:EP0201540-A1. "中公開過，公眾可以從中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流 行病研究所獲得。
[0040]HIV-lThai-B亞型參考毒株CNHN24 在文獻"WangZ,WangSX,LiuSY,Bao ZY,ZhuangDM,LiL,ZhangCH,ZhangL,LiJY,Lu:ImmunogenicitiesofEnv glycoproteinsfromcirculatingHIV-lisolatesinChinafocusingonthestrategy of"DNAprimeplusproteinboost".ChinMedJ(Engl). 20090ct5 ; 122 (19):2339-45?"中 公開過，公眾可以從中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所獲得。
[0041] 培養PBMCs所用的細胞培養液組成如下：含有體積百分含量10%的胎牛血清， lOOIU/ml青霉素，100iig/ml鏈霉素和lOIU/ml的白介素-2 (Interleukin，IL-2)的RPMI1640培養基。
[0042] Reverse Transcriptase Assay, colorimetric 購自 Roche，產品目錄號為 。
[0043] 培養MT-4和H9細胞系所用的細胞培養液組成如下：含有體積百分含量為10%的 胎牛血清，100IU/ml青霉素，100iig/ml鏈霉素的RPMI1640培養基。
[0044] 逆轉錄酶抑制劑齊多夫定（Zidovudine,AZT)購自SIGMA公司，產品目錄號為 A2169。
[0045] 蛋白酶抑制劑沙奎那韋（Saquinavir，SQV)購自上海迪賽諾生物醫藥有限公司。
[0046]MTT購自SIGMA公司，使用時用PBS配制成5mg/ml的溶液，0. 45um膜過濾備用。
[0047]HIV-13TC耐藥株在文獻"李玨，鮑作義，劉思揚，莊道民，李韓平，劉永建，李 林，楊坤，李敬云.HIV拉米夫定（3TC)耐藥毒株的體外誘導培育和鑒定.中華微生物和 免疫學雜志.2006 ;26 (3) : 220-223. "中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院 微生物流行病研究所獲得，該耐藥株的pol基因發生M184I突變，對拉米夫定（Lamivudine) (又名 3TC(2' -3'deoxy-3' -thiocytidine))的IC5(I 是 0? 018iig/ml，為HIV-lThai-B亞 型參考毒株CNHN24的113777倍。
[0048] MT-4 細胞（傳代人 T 淋巴細胞系）在文獻"Harada S, YamamotoN. Quantitative analysis of AIDS-related virus-carrying cells by plaque-forming assay using an HTLV-I-positive MT_4cell line. Jpn J Cancer Res. 1985Jun;76(6):432_5." 中公開 過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所獲得。
[0049]H9細胞（HIV慢性感染T淋巴細胞系）在文獻"PyleSW1，BessJW，JrRobey WG,FischingerPJ,GildenRV,ArthurL0.Purificationof120000daltonenvelope glycoproteinfromculturefluidsofhumanimmunodeficiencyvirus(HIV)-infected H9cells.AIDSResHumRetroviruses. 1987;3(4):387_400?"中公開過，公眾可從中國人 民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所獲得。
[0050]人外周血單核細胞（Peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)米自多人份 的HIV抗體陰性健康人，5iig/ml植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA)活化3天后使用， 用體積百分含量為10%的胎牛血清，l〇〇IU/ml青霉素，100yg/ml鏈霉素和10IU/ml的白介 素-2 (Interleukin，IL-2)的RPMI1640培養基培養和傳代。
[0051] 實施例中的GX2005002和GX002是同一種病毒株，即保藏號為CGMCCNo. 8787的 病毒株。
[0052] 實施例1、GX002的分離、培養及全長基因組序列的測定
[0053] 一、高復制能力HIV-1CRF01_AE亞型毒株GX002的分離與傳代培養
[0054]( -）將中國廣西壯族自治區某艾滋病人體內獲得的全血以250g離心8分鐘，使 血漿和血細胞分離，棄上層血漿，將下層的血細胞吸入50ml規格的離心管，加入與血漿等 體積的生理鹽水稀釋混勻，得到稀釋后的血細胞懸液；
[0055](二）向另一新的離心管中按體積比為1:1的比例緩慢先后加入分離液 HIST0PAQUE-1077和稀釋后的血細胞，加入稀釋后血細胞時用移液管靠壁緩慢加入，使稀釋 后的血細胞懸液和分離液之間形成明顯的分離液面；
[0056](三）將步驟（二）的離心管以400g離心30分鐘后，液面被分為顏色和濃度不同 的四層，所需的人外周血單核細胞（PBMCs)就在從上至下第二層的白色層中；
[0057](四）將最上面一層液面吸除，盡可能多地收集白色層中的細胞懸液進新的離心 管，用30ml的生理鹽水洗細胞三次，最后一次將分離出的病人體內的PBMCs，用含體積百分 含量10%的胎牛血清（FBS)，100IU/ml的青霉素和100yg/ml的鏈霉素的RPMI1640培養基 重懸至1〇6個細胞/ml，將其與分離于健康供血者血漿的人外周血單核細胞（PBMCs)按數量 比1:1的比例在6孔板中共培養28天，每7天取100ul細胞培養上清（從細胞培養板每孔 中吸取120ul細胞培養液（盡量少吸到底層的細胞）然后250g離心10分鐘）進行P24抗 原濃度檢測（以下P24抗原濃度的檢測均用HIV-1P24抗原檢測試劑盒測定），以觀察病毒 的生長情況，并用分離于健康供血者血液的人外周血單核細胞（PBMCs)替換孔中1/2原來 的細胞；
[0058](五）培養28天后，每孔吸取1ml培養上清接種于10ml規格細胞培養瓶中培養7 天，測定其培養上清液中的P24抗原濃度，收取上清液，分裝入lml規格的凍存管，置于液氮 中凍存；
[0059](六）將凍存后的lml上清液接種于50ml規格細胞培養瓶中用含有體積 百分含量10 %的胎牛血清，l〇〇IU/ml青霉素，100yg/ml鏈霉素和10IU/ml的白介 素-2 (Interleukin，IL-2)的RPMI1640培養基擴大培養，7天后測定培養上清液中的P24含 量，收取上清液，得到各分離株，分別分裝入lml規格的凍存管，置于液氮中凍存。
[0060] 二、高復制能力HIV-1CRF01_AE亞型毒株GX002的生長動力學曲線的制作 [0061]分別取含lngP24抗原的各病毒培養上清（經步驟一分離和擴大培養后所得）， 將其稀釋于〇. 6ml細胞培養液（含有體積百分含量10%的胎牛血清，100IU/ml青霉素， 10〇1^/1111鏈霉素和10幾/1111的白介素-2(11^61'16111^11，11-2)的1^]\01640 培養基）中 接種于24孔板（預先在24孔板上設有每孔1. 8ml濃度為106個細胞/ml的健康供血者的 人外周血單核細胞（PBMCs)重懸液），連續培養18天，每48小時取100ill各病毒培養上 清液測定P24抗原濃度，再取lml的病毒培養上清液，高速離心富集病毒顆粒，用Reverse TranscriptaseAssay,colorimetric測定逆轉錄酶RT的濃度。以感染后時間為橫坐標，分 別以P24抗原濃度和逆轉錄酶RT濃度為縱坐標繪制生長動力學曲線，分別如圖1和圖2所 /_J、i〇
[0062] 圖 1 和圖 2 中，SD2010001、BJ2010002、GX2005002、⑶2005006、⑶2005003 分別代 表步驟一得到的各分離株、CNHN24代表HIV-lThai-B亞型參考毒株CNHN24，IIIB_LAI或IIIB代表HIV-1B亞型參考毒株IIIB_LAI病毒，NL4-3代表NL4-3病毒。
[0063] 并于每次取樣時補入1. 2ml培養基（含有體積百分含量10%的胎牛血清，100IU/ ml青霉素，l〇〇yg/ml鏈霉素和l〇IU/ml的白介素-2(Interleukin，IL-2)的RPMI1640 培 養基），在第7天和第14天取上清后用新鮮的健康供血者的人外周血單核細胞（PBMCs)更 換一半數量的孔中細胞，以維持細胞的生長狀態。
[0064] 上述實驗中，HIV-1B亞型參考毒株NL4-3和IIIB_LAI病毒，以及HIV-lThai-B亞 型參考毒株CNHN24均為對照。
[0065] 圖1表明，步驟一得到的各分離株中，GX2005002病毒的培養上清的P24抗原含量 的峰值最高，GX2005002病毒在PBMCs上培養18天后，GX2005002病毒的培養上清的P24 抗原含量的峰值（25440.OOpg/ml)為對照毒株NL4-3峰值（4208. 32pg/ml)的6. 05倍，為IIIB_LAI峰值（4093. 06pg/ml)的6. 22倍，CNHN24沒有成功感染，失去參考價值。
[0066] 圖2表明，步驟一得到的各分離株中，GX2005002病毒的培養上清的逆轉錄 酶RT含量的峰值最高，GX2005002病毒在PBMCs培養上清液中逆轉錄酶RT含量的峰值 (3390. 50pg/ml)為毒株IIIB_LAI峰值（803. 50pg/ml)的 4. 22 倍，為NL4-3 峰值（507. 5pg/ ml)的6. 68倍，CNHN24沒有成功感染細胞，失去參考價值。
[0067] 圖1和圖2表明，GX2005002病毒為的復制能力較常用的HIV-1B亞型參考毒 株NL4-3和IIIB_LAI病毒的復制能力強，通過分型發現該病毒屬于CRF01_AE亞型，所以 GX2005002是擁有較高復制能力的HIV-1CRF01_AE亞型臨床分離株。
[0068] 三、GX2005002全長基因組的擴增和測序
[0069] 用QIAampDNAMiniKit試劑盒從GX2005002病毒培養所用的PBMCs中提取前病 毒DNA，進行GX2005002毒株全長基因組測定。
[0070]HIV-1全長基因組的擴增策略是分別擴增GX2005002基因組的兩個半分 子-5'half?和3'half，兩者之間有約100bp的重疊區域用于連接。對提取所得的前病毒 DNA進行半套式PCR擴增，以得到包含病毒基因組兩端長末端重復序列（Longterminal repeat,LTR)在內的全部基因組序列信息。
[0071] 具體步驟如下：
[0072] 第一輪反應：
[0073]以前病毒DNA為模板，以U-LTR5-AE(SEQIDNo. 1)和 07Rev8(SEQIDNo. 2)為引 物進行PCR擴增，得到5'半分子第一輪PCR擴增產物（5219bp);
[0074]以前病毒DNA為模板，以 07For7(SEQIDNo. 3)和D-MluI-AE+BC(SEQIDNo. 4) 為引物進行PCR擴增，得到3'半分子第一輪PCR擴增產物（4817bp);
[0075] 第二輪反應：
[0076] 以5'半分子第一輪PCR擴增產物為模板，以U-LTR5-AE(SEQIDNo. 1)和 Revll(SEQIDNo. 5)為引物進行PCR擴增，得到5'半分子第二輪PCR擴增產物（5066bp);
[0077] 以3'半分子第一輪PCR擴增產物為模板，以VIF1(SEQIDNo. 6)和 D-MluI-AE+BC(SEQIDNo. 4)為引物進行PCR擴增，得到3'半分子第二輪PCR擴增產物 (4792bp)。
[0078] 5'半分子第二輪PCR擴增產物和3'半分子第二輪PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電 泳如圖3所示。圖3中第5泳道為5'半分子第二輪PCR擴增產物，長度約為5kb;第11泳 道為3'半分子第二輪PCR擴增產物，長度約為4. 8kb;Marker為DNA分子量標準。
[0079] 將5'端半分子和3'端半分子的第二輪PCR擴增產物分別進行測序后，使用 ContigExpress軟件拼接序列片段，得到完整的GX2005002毒株全基因組序列，如SEQID No. 7所示。
[0080] 下述實施例中將GX2005002簡稱為GX002。
[0081] 表1HIV-1CRF01_AE亞型毒株GX002全長基因組序列擴增引物
[0082]

【權利要求】
1. 一株人類免疫缺陷病毒 I 型 CRF01_AE 亞型（Human Immunodeficiency Virus Type I subtype CRF01_AE)病毒，其保藏號為 CGMCC No.8787。
2. -種評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的試劑盒，該試劑盒包含權利要 求1所述的病毒。
3. -種評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制效果的方法，包括如下步驟： (1) 測定藥物對宿主細胞的半數中毒濃度，記作TC5(I ; (2) 測定藥物在宿主細胞/HIV-1GX002系統的抗病毒活性，得到藥物對病毒 HIV-1GX002的半數抑制濃度，記作IC5Q ; (3) 將步驟⑴得到的TC5(I和步驟⑵得到的IC5(I，帶入公式TI = TC5(I/IC5(I，計算得到 藥物的治療指數TI ; 所述宿主細胞/HIV-1GX002系統中所述HIV-1GX002可以在所述宿主細胞中進行復 制； 所述HIV-1GX002為權利要求1所述的病毒。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述宿主細胞為離體的人外周血單核細 胞。
5. 根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述步驟⑴的測定方法為MTT法； 所述步驟（2)中的IC5Q是通過測定藥物在宿主細胞/HIV-1GX002系統的抗病毒活性的 細胞病變效應觀察法得到或通過檢測HIV-1P24抗原得到。
6. 權利要求1所述的病毒在制備評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制作用的產品 中的應用。
7. 權利要求1所述的病毒在制備篩選對HIV-1病毒具有清除和/或抑制作用的產品中 的應用。
8. 權利要求2所述的試劑盒在制備評價藥物對HIV-1病毒的清除和/或抑制作用的產 品中的應用。
9. 權利要求2所述的試劑盒在制備篩選對HIV-1病毒具有清除和/或抑制作用的產品 中的應用。
10. 權利要求1所述的病毒或權利要求2所述的試劑盒在制備篩選和/或評價藥物在 預防和/或治療HIV-1病毒引起的疾病的效果的產品中的應用。
【文檔編號】C12R1/93GK104328091SQ201410549312
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】韓婧婉, 劉思揚, 莊道民, 李韓平, 梁淑家, 李敬云 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所, 廣西壯族自治區疾病預防控制中心