一種番鴨細小病毒lamp檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒，該試劑盒包括：反應液甲：含有10×等溫反應緩存液、dNTPs、硫酸鎂、內引物1、內引物2、外引物1、外引物2及甜菜堿；反應液乙：Bst DNA 聚合酶，反應液丙：含雙抗的滅菌PBS。本發明提供的試劑盒最低檢測限為10fg，其靈敏性是RT?PCR的10倍。本發明試劑盒具有良好的特異性、靈敏性、快速高效、且結果判定簡單等優點，能較好的滿足最番鴨細小病毒的現場檢測，為基層檢測提供了新的技術平臺，能較好的滿足目前對養殖場現場檢測的迫切需要。
【專利說明】
一種番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒
技術領域
[0001]本發明涉及病原微生物檢測技術領域，具體說是涉及一種番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒(Muscovy Duck Parvovirus，MDPV)引起的以腹瀉和喘氣為主要癥狀的急性或亞急性傳染病。該病主要危害30日齡以內的雛番鴨，特別是1-3周齡的雛番鴨，因此俗稱“三周病”。該病傳播迅速，常造成整群發病并死亡，發病率和死亡率都很高。日齡較大的雛鴨一般癥狀較輕，病死率較低，但病愈后大部分生長發育受阻成為僵鴨，料肉比增大，已經成為危害我國養鴨業發展最為嚴重的傳染病之一。
[0003]現階段，該病的傳統檢測方法有血清中和試驗、瓊脂擴散試驗、ELISA等，但是這些檢測方法存在靈敏性低、周期長、重復性差、不易標準化等缺點，在實際應用中不易大范圍的推廣使用。現有的PCR以及熒光定量PCR檢測方法，一定程度上克服了上述的困難，但是往往需要使用昂貴的實驗設備和試劑、經過專門培訓的的操作人員等諸多弊端，不能適應基層獸醫站或養殖場臨床一線簡便、快速檢測的需要。
[0004]環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermal amplificat1n，LAMP)是利用一種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴增功能的鏈置換DNA聚合酶(即Bst DNA聚合酶)，在等溫條件下進行核酸的變形和自動循環的鏈置換核酸擴增反應，整個反應不需要特殊的儀器設備，一臺能夠控溫的水浴鍋就能完成。伴隨LAMP反應的進行，產生的焦磷酸根離子能夠與體系中添加的鎂離子形成乳白色的焦磷酸鎂沉淀，方便結果的判定，無須傳統核酸電泳染色紫外觀察的繁瑣步驟，不僅節省了時間也保護了操作者和環境。LAMP具有簡便、快速、靈敏、特異的優勢，尤其適用于基層和現場一線對快速檢測的需要。本發明采用環介導等溫擴增技術研制一種番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒，具有十分重要的社會意義和經濟意義。
[0005]
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供“一種番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒”，該試劑盒具有特異性強、靈敏性高、不易造成污染、操作簡便、成本低廉、快速得出結果的番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒，以滿足基層和現場對快速檢測番鴨細小病毒的需要。
[0007]為了實現上述目的，本發明所采用的主要技術方案是，一種番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括:
反應液甲:含有10X等溫反應緩存液、dNTPs、硫酸鎂、內引物1、內引物2、外引物1、外引物2及甜菜堿；
反應液乙:Bst DNA聚合酶，
反應液丙:含雙抗的滅菌I3BS。
[0008]進一步的技術方案是，所述10X等溫反應緩存液含有pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂及I %曲拉通X-1OO。
[0009]進一步的技術方案是，試劑盒中包括:
反應液甲:含有10 X等溫反應緩存液、1mM dNTPs、25mM硫酸鎂、20μΜ的內引物1、20μΜ的內引物2、20μΜ的外引物1、20μΜ的外引物2及5Μ甜菜堿；
反應液乙:Bst DNA聚合酶8U/yL;
反應液丙:含雙抗的滅菌I3BS;
所述內引物I序列為:
CGCTCCCTACATATTGAGGGTTATACAGTTCTGGACATTACTAAAAATCG所述內引物2序列為:CAACAAAAGAAATGCCATATGGCTCCTCGGCTATGTTGGTCT所述外引物 I 序列為:AGACTATTTGATTGGAAAAGACC所述外引物2序列為:GGTACAGCATGGGCAATA。
[0010]進一步的技術方案是，所述10X等溫反應緩存液含有200mM pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、10mM氯化鉀、10mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和及I %曲拉通X-100。
[0011]進一步的技術方案是，所述反應液甲每管23yL，其組成為:10XBstbuffer 2.5μL、10mM dNTPs4.5yL、5M Betainel.5yL、25mM MgS044.5yL^20yM FIP/BIP2.5μ?、20μΜ F3/B30.5yL、|—A4yL。
[0012]本發明還公開了采用上述試劑盒的檢測方法，該檢測方法包括如下步驟:
(1)DNA的提取:
1)、用滅菌棉拭子旋轉插入鴨泄殖腔采集糞便殘渣及分泌物；
2)、取出后投放于含雙抗的滅菌PBS反應液丙所在離心管中，輕輕搖動使其溶解；
3)、4°C、12000rpm離心15min，取上清，再用0.22μηι微孔濾膜過濾；
4)、參照EasyPureviral DNA/RNA kit提取試劑盒說明書，對步驟3)中的病毒液進行核酸抽提，所得即為待檢DNA樣品；
(2)PCR擴增:
25yL體系:23yL反應液甲，Bst DNA聚合酶IyL及模板IyL混勻，短暫離心構成25yL反應體系；
PCR反應條件:將水浴鍋預熱至60°C，反應管半浸入水中，恒溫反應60min，水浴鍋加熱至85°C滅活5min，取出反應管觀察結果；
(3)判斷結果:
肉眼觀察反應管清晰度判定，如反應管渾濁呈淡乳白色，則說明待檢樣品中含有番鴨細小病毒;如果反應管保持澄清透明，說明待檢樣品不含番鴨細小病毒。
[0013]本發明與現有技術相比具有如下優點:
1、由于本發明所設計采用的兩對特異性引物來自番鴨細小病毒基因中高度保守的區段，采用該引物對能準確、快速、方便的判別病料中是否含有番鴨細小病毒。
[0014]2、特異性強:所檢測的陰性對照病毒均無陽性結果出現，與PCR結果相一致。
[0015]3、靈敏度高:普通PCR檢測最低限度為10fg數量級，而采用本發明檢測方法，檢測限最低可達到I Ofg，是普通PCR的1倍。
[0016]4、時效性強:普通PCR檢測整個過程在3-4 h左右才能得出判斷結果，而采用本發明檢測方法，只需1.5小時即可做出判斷結果。
[0017]5、環保無污染:普通PCR結束后還要進行瓊脂糖凝膠電泳，使用EB等對人和環境造成損害的染料，而采用本發明檢測方法，無需昂貴的PCR儀，只需能夠控溫的普通水浴鍋即可，反應結束后可直接通過肉眼觀察溶液是否變渾濁而直接判定。同時有效地避免了因為開蓋造成的氣溶膠污染，確保了每次實驗結果的準確性。
【附圖說明】
[0018]圖1是應用本發明番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒的檢測方法特異性試驗結果圖。
[0019]其中:M、DL2000 DNA Marker，1、番鴨細小病毒，2、鴨瘟病毒，3、鴨肝炎病毒，4、新城疫病毒，5、小鸛痕病毒。
[0020]圖2— I是應用本發明番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒的檢測方法敏感性試驗結果圖。
[0021]圖2— 2是應用本發明番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒的檢測方法敏感性試驗量化結果圖。
其中:M、DL2000 DNA Marker，N、negative(陰性對照)，1、10ng/yL，2、lng/yL，3、10pg/yL，4、10pgAiL，5、lpgAiL，6、100fgAiL，7、10fgAiL，8、lfgAiL。
[0022]圖3— I是PCR方法檢測番鴨細小病毒敏感性試驗結果圖。
[0023]圖3— 2是PCR方法檢測番鴨細小病毒敏感性試驗量化結果圖。
其中:M、DL2000 DNA Marker，N、negative(陰性對照)，1、10ng/yL，2、lng/yL，3、10pg/yL，4、10pgAiL，5、lpgAiL，6、100fgAiL，7、10fgAiL，8，lfgAiL。
[0024]圖4是番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒陰性及陽性結果判定標準。
[0025]圖中:陽性結果對應管中液體呈現淡乳白色，陰性結果對應管中液體呈現原有的澄清透明狀態。
【具體實施方式】
[0026]下面通過非限制性實施例，進一步闡述本發明，理解本發明。
[0027]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0028]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明均可從商業途徑得到。
實施例
[0029]實施例1:番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒的配制
一種番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒包括:反應液甲:含有10 X等溫反應緩存液、1mMdNTPs、25mM硫酸鎂、20μΜ的內引物1、20μΜ的內引物2、20μΜ的外引物1、20μΜ的外引物2、
5Μ甜菜堿。
[0030]所述10 X等溫反應緩存液含有200mM pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、10mM氯化鉀、10mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和I %曲拉通X-100。
[0031]其中，反應液甲每管23yL，其組成為:10XBstbuffer 2.5yL、10mM dNTPs4.5yL、5M Betainel.5yL、25mM MgS(k4.5μ?、20μΜ FIP/BIP2.5μ?、20μΜ F3/B30.5yL、雙蒸水4yL。
[0032]內引物I序列為:
CGCTCCCTACATATTGAGGGTTATACAGTTCTGGACATTACTAAAAATCG 內引物2序列為:
CAACAAAAGAAATGCCATATGGCTCCTCGGCTATGTTGGTCT外引物 I 序列為:AGACTATTTGATTGGAAAAGACC外引物2序列為:GGTACAGCATGGGCAATA反應液乙:Bst DNA聚合酶8U/yL，
反應液丙:含雙抗的滅菌PBS。(直接購買即可)
實施例2:采用上述試劑盒的檢測方法，該檢測方法包括如下步驟:
(1)DNA的提取:
1)、用滅菌棉拭子旋轉插入鴨泄殖腔采集糞便殘渣及分泌物；
2)、取出后投放于含雙抗的滅菌PBS反應液丙所在離心管中，輕輕搖動使其溶解；
3)、4°C、12000rpm離心15min，取上清，再用0.22μηι微孔濾膜過濾；
4)、參照EasyPureviral DNA/RNA kit提取試劑盒說明書，對步驟3)中的病毒液進行核酸抽提，所得即為待檢DNA樣品；
(2)PCR擴增:
25yL體系:23yL反應液甲，Bst DNA聚合酶IyL及模板IyL混勻，短暫離心構成25yL反應體系；
PCR反應條件:將水浴鍋預熱至60°C，反應管半浸入水中，恒溫反應60min，水浴鍋加熱至85°C滅活5min，取出反應管觀察結果；
(3)結果判斷:
1)肉眼判斷法:肉眼觀察反應管清晰度判定，如反應管渾濁呈淡乳白色，則說明待檢樣品中含有番鴨細小病毒;如果反應管保持澄清透明，說明待檢樣品不含番鴨細小病毒。
[0033]
2)瓊脂糖凝膠電泳判定法:瓊脂糖凝膠電泳，如對應泳道出現特異性的梯形條帶，則說明待檢樣品中含有番鴨細小病毒;如對應泳道未出現特異性的梯形條帶，則說明待檢樣品不含番鴨細小病毒。
[0034]經多次重復，肉眼觀察法不僅克服了瓊脂糖凝膠電泳法在操作過程中存在的費事費力等諸多弊端，而且在結果判定上兩種判定結果也完全一致。
[0035]實施例3:LAMP檢測法的特異性試驗
如圖1所示:分別取IyL番鴨細小病毒、新城疫病毒、鴨肝炎病毒、小鵝瘟病毒和鴨瘟病毒的核酸為模板，按照實施例2中番鴨細小病毒LAMP反應程序進行反應并觀察結果。
[0036]結果見圖1，對番鴨細小病毒的檢測為陽性結果(有特異性梯形條帶)，而對新城疫病毒、鴨肝炎病毒、小鵝瘟病毒和鴨瘟病毒的檢測均為陰性(無特異性梯形條帶)。
[0037]實施例4: LAMP檢測法的靈敏性試驗
將番鴨細小病毒DNA按 10 倍遞增稀釋成 10ng/yL、lngAiL、100pgAiL、10pgAiL、lpgAiL、100fg/yL、1fg/yL、Ifg/yL。
[0038]分別取IyL各稀釋度數的番鴨細小病毒DNA為模板，按照前述番鴨細小病毒LAMP反應程序進行反應并觀察結果。
[0039]結果見圖2 — 1、圖2 — 2，番鴨細小病毒LAMP檢測方法的檢測限為10fg。
[0040]實施例5:PCR擴增及結果對照番鴨細小病毒PCR反應組成如下:
50yL反應體系:含25mM MgSO4 2.5yL,10XPCR buffer 5yL,10mM dNTPs 2yL，Taq 聚合酶(51])0.541^，
上游引物:5- TATGGATCCATGGCAGAGGGAGGAAGC -3 IyL，
下游引物:5- TAAGAGCTCCAGATTCTGAGTCAAATACC -3 IyL，
不同濃度番鴨細小病毒0嫩模板(10呢/^、1即/^、10(^/4^、1(^/^、]^/^、100把/yL、10fgAiL、lfgAiL)lyL，35yL 雙蒸水。
[0041 ] PCR反應條件:940C預變性2分鐘，然后進入94 V變性I分鐘，57 °C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘的循環，共進行35個循環，最后再經72°C延伸10分鐘。
[0042]結果見圖3 — 1、圖3 — 2，番鴨細小病毒PCR檢測方法的檢測限為lOOfg。
[0043]番鴨細小病毒LAMP結果見圖3 — 1、圖3 — 2，番鴨細小病毒PCR檢測方法的檢測限為10fg0
[0044]番鴨細小病毒LAMP檢測可視化結果，番鴨細小病毒LAMP檢測反應結束后，直接肉眼觀察，結果見圖4，陽性結果對應管中液體呈現淡乳白色，陰性結果對應管中液體呈現原有的澄清透明狀態。
[0045]番鴨細小病毒LAMP檢測法的檢測限為1fg，而PCR檢測法的檢測限為lOOfg，可見本發明LAMP檢測法比PCR檢測法更為靈敏，完全可以替代傳統的PCR檢測方法。
[0046]實施例6:臨床病料檢測從2015年3月到2016年I月，共收集來自國家水禽基因庫的50個樣品，利用本發明的試劑盒對50份樣品進行檢測診斷，診斷結果顯示，僅有6例為番鴨細小病毒，陽性率為12%ο同時分別采用RT-PCR法和ELISA法進行檢測，結果陽性率與試劑盒檢出陽性率一致。
[0047]綜上所述，本發明所設計采用的兩對特異性引物來自番鴨細小病毒基因中高度保守的區段，建立一種LAMP檢測番鴨細小病毒的方法。通過上述實驗實施例證明，該試劑盒及方法具有靈敏性高、其靈敏性是RT-PCR的10倍，特異性好的特點，是一種成本低、檢測準確、操作快速、方便的番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒，為基層檢測提供了新的技術平臺，能較好的滿足目前對養殖場現場檢測的迫切需要。
[0048]
[
序列表
〈110〉江蘇農牧科技職業學院
〈120〉一種番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒
〈160〉 6
〈210〉 I
〈211〉 50
〈212〉 DNA
〈213〉內引物I
〈400〉 CGCTCCCTACATATTGAGGGTTATACAGTTCTGGACATTACTAAAAATCG〈210〉 2〈211〉 42〈212〉DNA
〈213〉內引物2
〈400〉CAACAAAAGAAATGCCATATGGCTCCTCGGCTATGTTGGTCT
〈210〉3
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉外引物I
〈400〉AGACTATTTGATTGGAAAAGACC
〈210〉4
〈211〉18
〈212〉DNA
〈213〉外引物2
〈400〉GGTACAGCATGGGCAATA
〈210〉5
〈211〉27
〈212〉DNA
〈213〉PCR上游引物
〈400〉TATGGATCCATGGCAGAGGGAGGAAGC
〈210〉6
〈211〉29
〈212〉DNA
〈213〉PCR下游引物
〈400〉TAAGAGCTCCAGATTCTGAGTCAAATACC 。
【主權項】
1.一種番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括: 反應液甲:含有1X等溫反應緩存液、dNTPs、硫酸鎂、內引物1、內引物2、外引物1、外引物2及甜菜堿； 反應液乙:Bst DNA聚合酶， 反應液丙:含雙抗的滅菌PBS。2.根據權利要求1所述的一種番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述1X等溫反應緩存液含有PH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂及1 %曲拉通X-100。3.根據權利要求1所述的一種番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中包括: 反應液甲:含有10 X等溫反應緩存液、1mM dNTPs、25mM硫酸鎂、20μΜ的內引物1、20μΜ的內引物2、20μΜ的外引物1、20μΜ的外引物2及5Μ甜菜堿； 反應液乙:Bst DNA聚合酶8U/yL; 反應液丙:含雙抗的滅菌PBS; 所述內引物I序列為: CGCTCCCTACATATTGAGGGTTATACAGTTCTGGACATTACTAAAAATCG 所述內引物2序列為: CAACAAAAGAAATGCCATATGGCTCCTCGGCTATGTTGGTCT 所述外引物I序列為: AGACTATTTGATTGGAAAAGACC 所述外引物2序列為: GGTACAGCATGGGCAATA 。4.根據權利要求3所述的一種番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述10X等溫反應緩存液含有200mM pH值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷鹽酸鹽、10mM氯化鉀、10mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和及I %曲拉通X-100。5.根據權利要求3所述的一種番鴨細小病毒LAMP檢測試劑盒，其特征在于，所述反應液甲每管23yL，其組成為:10XBst buffer 2.5yL、10mM dNTPs4.5yL、5M Betainel.5yL、25mMMgS044.5yL、20yM FIP/BIP2.5yL、20yM F3/B30.5yL、雙蒸水4yL。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950786SQ201610347110
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月24日
【發明人】王永娟, 朱善元, 胡成, 左偉勇, 王安平, 洪偉鳴, 吳雙, 秦楓
【申請人】江蘇農牧科技職業學院