專利名稱：禽流感病毒H5N1亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標準物質及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種禽流感病毒H5m亞型Re-5株的陽性血清和陰性血清標準物質及 制備方法，屬于獸用生物制品領域。
背景技術：
英國藥典(BP)的化學對照物質是從1963年才開始提出，由于WHO在英國建立了 國際生物標準物質中心，所以英國一直沿用國際標準物質，而其本國標準物質建立較晚，至 1970年后，歐洲藥典問世，英國除引用國際標準物質外，也用歐洲藥典標準物質，少量使用 本國的標準物質。即使如此，BP1968年版及其增補本再加英國藥典(1968年)收載的數量 已超過260個，1980年版已超過300個，BP1993版收載了 371個。美國藥典委員會可提供 約1805多種藥品標準物質；歐洲藥典委員會有2098種，其中生物制品標準物質有319種。目前，我國已研制出國家一級標準物質1262種，二級標準物質1739種，涉及鋼鐵、 地質、石油、核材料、環境、食品以及臨床檢驗等領域。獸用生物制品的標準物質研究較滯 后，目前只有192種，而獸用生物制品檢驗用標準物質幾乎為零。獸用生物制品標準物質是控制和確定獸用生物制品產品質量、校準驗證檢驗儀器 和方法是否準確的物質標準，是正確診斷傳染病、準確監測免疫情況的物質基礎。禽流感(Al)是我國重點防控的重大動物疫病，禽流感病毒(AIV)H5亞型屬于高致 病性病毒，AIV H5N1亞型Re-5株是針對我國當前流行的高致病性禽流感病毒而研制的。用 該毒株研制的禽流感滅活疫苗是我國目前禽流感防制中應用最廣泛的首選疫苗，這個疫苗 在實際應用中取得了十分顯著的免疫效果，因此近年來我國的禽流感防制非常令人滿意。 但是目前我國尚無禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗用標準物質及其相關研究的報道，國 外國際動物衛生組織(OIE)等參考實驗室也沒有，嚴重影響了前后不同時期檢測數據的一 致性和不同實驗室數據的可比性。近年各級實驗室對禽流感標準物質的需求越來越多，特 別是H5亞型和H9亞型相關的診斷試劑標準物質，因此研制禽流感病毒H5W亞型血凝抑制 抗原標準物質尤為迫切，該標準物質是禽流感H5W亞型準確診斷、對AIV H5N1亞型Re_5 株免疫監測及對其疫苗免疫效果進行正確評價的根本保障，提高禽流感的防控水平。目前我國標準物質的研制主要參考和遵循1987年7月10日國家計量局發布實施 的《標準物質管理辦法》以及一級標準物質技術規范(JJG 1006-94)，但是這個技術規范是 適用于化學成分、物理化學特性及工程技術特性一級標準物質的研制，對于生物制品標準 物質，特別是獸用生物制品標準物質研制目前尚無技術規范可循。因此獸用生物制品標準 物質研制是一項無基礎的研究，填補了該項研究領域的空白。

發明內容
本方面涉及一種禽流感病毒H5m亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標準物質， 陽性血清標準物質有強陽性血清標準物質和弱陽性血清標準物質，此兩種陽性血清標準物質只與禽流感病毒H5W亞型Re-5株抗原呈陽性反應，強陽性血清標準物質的HI價為 彡81og2,弱陽性血清標準物質的HI價為< 81og2而彡41og2 ；此兩種陽性血清與H7和H9 亞型禽流感、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗原均應為陰性反應；陰性血清標準物質在同一條 件下，分別與禽流感、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗，血清對禽 流感H5、H7、H9亞型、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗原均為陰性反應。本發明的技術方案(1)禽流感病毒H5W亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標準物質候選物1)按常規方法用禽流感病毒H5W亞型Re-5株病毒制備的油乳劑滅活疫苗。2)陽性血清標準物質候選物系用青年或成年SPF雞，經肌肉注射禽流感病毒 H5N1亞型R5株油乳劑滅活疫苗，制備強陽性血清候選物，經2次免疫后，選取HI抗體效價 ^ 81og2的免疫雞只，分別采集雞血清并進行半成品檢驗后混合，加入適宜穩定劑后凍干； 制備弱陽性血清候選物僅1次免疫，選取HI抗體效價< 81og2而> 41og2的免疫雞只，分 別采集雞血清并進行半成品檢驗后混合，加入適宜穩定劑后凍干。3)陰性血清系采自SPF雞血，分離血清并進行半成品檢驗，凍干。(2)以上制備的強陽性血清、弱陽性血清和陰性血清標準物質候選物經檢驗、均一 性檢驗及穩定性檢驗及標準物質的標定、定值等一系列的工藝過程而成為強陽性血清、弱 陽性血清和陰性血清標準物質。本發明技術方案的詳細闡述一、禽流感病毒H5W亞型Re-5株陽性血清、弱陽性血清和陰性血清標準物質的制 備1免疫用疫苗的制備(1)病毒液的制備及檢驗按照禽流感病毒H5W亞型Re-5株標準血凝抑制抗原 的制備方法繁殖病毒液，對病毒液進行檢驗1)無菌檢驗每瓶雞胚液分別取樣，按中華人民共和國獸藥典(中國獸藥典委員 會.中華人民共和國獸藥典二〇〇五年版(三部).中國農業出版社，2006，本發明簡稱 《中國獸藥典》)規定的方法進行檢驗，無細菌或霉菌或支原體生長也無外源病毒。2) HA價測定每瓶雞胚液分別取樣，樣品對雞紅細胞凝集價不低于91og2。(2)病毒液的滅活及檢驗1)滅活將上述檢驗合格的胚液以滅菌多層紗布濾過，混合于一個大容器內，按 最終濃度為0. 03%的量加入β-丙內酯，充分混勻，置于4°C滅活24h后取出再置于37°C水 浴終止滅活lh。滅活后將胚液置于2 8°C條件下保存。2)滅活檢驗取10 11日齡SPF雞胚5個，各尿囊腔內接種滅活胚液0. Iml, 37°C孵育72h，收獲雞胚液，測定血凝性(詳見本說明書附錄，下稱《附錄》)，為陰性，并盲傳 1代，測定血凝性，無血凝現象，判為滅活完全。(3)佐劑的選擇選用符合生物制品規定的進口佐劑，如德國產的Marcol52白 油、新加坡產的80和司盤80等為乳化佐劑。(4)保護劑的處理將司盤和白油按6 94的比例混合后加熱至130°C30min，無 菌冷卻后備用；吐溫經高壓滅菌后備用。(5)疫苗的制備先將滅菌后的吐溫按8%的比例加入滅活檢驗合格的病毒液中，將其混勻；將冷卻的白油佐劑定量加入組織搗碎機內，低速開啟組織搗碎機，將混勻吐 溫的病毒液按白油佐劑1/2的量緩慢加入組織搗碎機內，然后將組織搗碎機的轉速提高至 8000r/min運轉lOmin。將制備的油包水型疫苗分裝于疫苗瓶內備用。2陽性血清制備(1)免疫選用3 4月齡SPF雞飼養于負壓隔離器內，用制備的禽流感滅活疫苗 以胸部肌肉注射方式2次接種疫苗，第一次接種劑量為1.0ml/只，間隔21日后進行第二次 接種，劑量為1. 5ml/只，且分點注射。(2)試血于第2次免疫接種后觀日，用翅下靜脈采血方式采集血清，采血同時對 雞和血清對應編號，分別測定HI抗體效價(按《附錄》進行)，挑選HI抗體效價> Qlog2的 SPF雞備用。(3)血清的分離選HI抗體效價彡Qlog2的SPF雞用20ml無菌注射器在負壓隔 離器內進行心臟采血，血液采集完畢后先置于37°C 4h，然后再置于4°C冰箱內過夜，在無菌 室超凈工作臺內提取血清，若血清中混有紅血球，應對其進行無菌離心后混合于同一滅菌 后的容器內。(4)血清半成品的檢驗1)無菌檢驗對混合后的血清取樣，按《中國獸藥典》規定方法進行檢驗，應無細 菌或霉菌生長。若有雜菌污染，應用0.22 μ的濾膜對其進行過濾除菌。2) HI抗體價的測定按《中國獸藥典》紅細胞凝集抑制法進行HI抗體價的測定，結 果應彡91〇由。3)特異性鑒定將待檢血清在同一條件下分別與Η5、Η7和Η9亞型禽流感、雞新城 疫、減蛋綜合征病毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗(按《附錄》進行)，僅與禽流感病毒Η5 亞型抗原呈陽性反應(HI彡71og2)，與H7和H9亞型禽流感、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗 原均應為陰性反應(HI ( 41og2)。4)血清的配制經檢驗合格的血清按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生物 公司生產)和0. 5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學試劑有限公司生產)作為凍干保護劑 并充分攪拌均勻，并按照《中國獸藥典》無菌檢驗法進行檢驗，應無菌生長。5)分裝與凍干將配好的抗原液用安瓿進行分裝，每瓶1ml，分裝后迅速放入凍 干機內進行冷凍真空干燥。凍干后扎鋁蓋、標號后放置-20°C保存。(5)成品檢驗1)物理性狀呈微黃色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁分離，加稀釋液后迅速溶解，溶 解后的外觀應與液體血清相同。2)無菌檢驗按《中國獸藥典》無菌檢驗法進行，應無菌生長。3)效價測定按附錄進行，HI抗體效價應彡81og2。4)特異性檢驗同半成品，應符合規定。
5) PH測定將血清按規格稀釋后，用PH儀測定其pH值，應為7. 9 8. 26)剩余水分測定按《中國獸藥典》剩余水分測定法進行，應低于3%。7)真空度測定按《中國獸藥典》真空度測定法進行，符合規定。8)血清HI抗體效價的定值①定值方法紅細胞凝集抑制試驗96孔微量板法進行測定。
②定值單位由6 8家具有資質且事先經過比對確認其定值能力相同的試驗 室，采用同一方法進行協作標定。③定值要求(a)應對每個被測標準樣品分別做6 8次獨立的測定，測定分兩個單元，每個單 元做三次獨立測定；兩個單元之間相隔不少于3天。所獲得的6個數據應按統計學方法檢 驗異常值，如發現有異常值，應予標明，并補做一次測定。然后報出全部結果。(b)所有用于定值測量的計量器具/測量儀器需經檢定或校準合格，并在有效期 內。④數據處理(a)匯總全部原始數據，考察全部測量數據分布的正態性。(b)在數據服從正態分布或近似正態分布的情況下，將每個實驗室的所測數據的 平均值視為單次測量值，構成一組新的測量數據。用統計學方法從統計上剔除可疑值。計 算出總平均值和標準偏差。(c)當全部數據服從正態分布或近似正態分布情況下，也可視其為一組新的測量 數據。用統計學方法從統計上剔除可疑值，再計算全部原始數據的總平均值和標準偏差。9)均一性檢驗①抽樣數量凍干數量在500支以上時取樣25支；凍干數量在500只以下時取樣 15支。②測量分別稱量每支內容物的凈重量，用統計學方法分析其均一性。10)穩定性檢驗血清分別在-20°C、4°C、37°C條件下保存，并定期進行HA價測 定，每一時間均要進行數次重復測量，用統計學方法剔除可疑值，再計算每次的平均值，該 值與定值的偏差應不大于標準偏差。3.弱陽性血清制備(1)免疫選用3 4月齡SPF雞飼養于負壓隔離器內，用制備的禽流感滅活疫苗 以胸部肌肉注射方式接種疫苗，接種劑量為0. 5ml/只。(2)試血于免疫接種后14 21日，用翅下靜脈采血方式采集血清，采血同時對 雞和血清對應編號，分別測定HI抗體效價(按《附錄》進行)，選取HI抗體效價< 81og2而 ^ 41og2的免疫雞只備用。(3)血清的分離選選取HI抗體效價< 81og2而彡41og2的免疫雞只用20ml無 菌注射器在負壓隔離器內進行心臟采血，血液采集完畢后先置于37°C 4h，然后再置于4°C 冰箱內過夜，在無菌室超凈工作臺內提取血清，若血清中混有紅血球，應對其進行無菌離心 后混合于同一滅菌后的容器內。(4)血清半成品的檢驗1)無菌檢驗對混合后的血清取樣，按《中國獸藥典》進行檢驗，應無細菌或霉菌 生長。若有雜菌污染，應用0.22 μ的濾膜對其進行過濾除菌。2)HI抗體價的測定按附錄進行測定，結果應為大于41og2，小于81og2。3)特異性鑒定將待檢血清在同一條件下分別與H5、H7和H9亞型禽流感、雞新城 疫、減蛋綜合征病毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗(按《附錄》進行)，僅與禽流感病毒H9 亞型抗原呈陽性反應(HI抗體效價< 81og2而> 41og2)，與H7和H5亞型禽流感、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗原均應為陰性反應。(5)血清的配制經檢驗合格的血清按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生 物公司生產)和0. 5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學試劑有限公司生產)作為凍干保護 劑并充分攪拌均勻，并按照《中國獸藥典》無菌檢驗法進行檢驗，應無菌生長。(6)分裝與凍干將配好的抗原液用安瓿進行分裝，每瓶1ml，分裝后迅速放入凍 干機內進行冷凍真空干燥。凍干后扎鋁蓋、標號后放置-20°C保存。(7)成品檢驗1)物理性狀同陽性血清。2)無菌檢驗同陽性血清。3)效價測定按附錄進行，HI抗體效價< 81og2而彡41og2。4)pH測定將血清按規格稀釋后，用PH儀測定其pH值，應為7. 6 8. 2。5)特異性檢驗同陽性血清。6)剩余水分測定同陽性血清。7)真空度測定同陽性血清。8)血清HI抗體效價的定值同陽性血清。9)均一性檢驗同陽性血清。10)穩定性檢驗同陽性血清。4.陰性血清(1)血清分離青年SPF雞飼養于生物安全動物實驗室內的負壓隔離器內，以無 菌注射器在生物安全動物實驗室內的負壓隔離器內進行心臟采血，血液采集完畢后先置于 370C 4h，然后再置于4°C冰箱內過夜，在無菌室超凈工作臺內提取血清，然后混合于同一滅 菌后的容器內。(2)血清半成品的檢驗1)無菌檢驗對混合后的血清取樣，按《中國獸藥典》進行檢驗，應無細菌或霉菌 生長。2)效價測定按附錄進行，HI抗體效價應為陰性。3)特異性將血清在同一條件下(按《附錄》進行)，分別與禽流感、雞新城疫、減 蛋綜合征病毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗，血清對禽流感H5、H7、H9亞型、雞新城疫、減 蛋綜合征病毒抗原均為陰性反應。(3)血清的配制按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生物公司生產)和 0. 5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學試劑有限公司生產)作為凍干保護劑并充分攪拌均 勻，并按《中國獸藥典》無菌檢驗法進行檢驗，應無菌生長。4)分裝與凍干按anl/瓶進行定量分裝，分裝后迅速冷凍真空干燥凍干(按《中 華人民共和國獸用生物制品規程》(中華人民共和國農業部.中華人民共和國獸用生物制 品規程二〇〇〇年版.化學工業出版社，2001，本發明簡稱《規程》)進行。(5)成品檢驗1)物理性狀呈微黃色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁分離，加稀釋液后迅速溶解，溶 解后的外觀應與液體血清相同。2)無菌檢驗按《中國獸藥典》無菌檢驗法進行，應無菌生長。
3)效價測定同陽性血清。4)特異性同陽性血清。5)剩余水分測定按《中國獸藥典》剩余水分測定法進行，應低于3%。6)真空度測定按《中國獸藥典》真空度測定法進行，符合規定。二、H9亞型陽性血清、弱陽性血清和陰性血清標準物質的使用陽性血清和弱陽性血清系用青年SPF雞，經肌肉注射禽流感病毒H5W亞型(R5 株)油乳劑滅活疫苗后，采集SPF雞血清并進行半成品檢驗，加入適宜穩定劑后凍干；陰性 血清系采自SPF雞血，分離血清并進行半成品檢驗，凍干而成。主要用于禽流感病毒H5W亞型Re-5株HI試驗對照。1.標準抗原的稀釋取禽流感H5W亞型Re-5株抗原凍干安瓿1支，啟封后加Iml 生理鹽水恢復原量；先做10倍、20倍稀釋。然后依次進行80、160、240、320、400、480、560倍稀釋。2.紅細胞凝集試驗(1)取96孔V型微量血凝板，每一稀釋度分別取25 μ L加入到孔中，加入生理鹽水 25 μ L，再加入1 %雞紅細胞懸液25 μ Lo(2)對照50 μ L生理鹽水+25 μ L 1 %雞紅細胞懸液。(3)在微量振蕩器振蕩Imin ^iin。(4)室溫(Μ )放置30min，判定結果。將血凝板傾斜70。且靜置10秒左 右開始記錄，凡反應孔底部有紅細胞沉積且沿傾斜面向下呈淚珠狀流淌，呈現與紅細胞對 照孔一樣者為完全不凝集孔(_)；反應孔底部有紅細胞沉積且沿傾斜面緩慢向下呈淚珠狀 流淌者為不完全凝集孔(+)；反應孔底部有紅細胞沉積但不沿傾斜面流淌者為50%凝集 孔(++)；除底部有少許紅細胞外，反應孔其他部位幾乎為完全凝集孔者(+++)；反應孔底部 無紅細胞，整個反應孔完全凝集者為完全凝集孔(#)。(5)結論完全凝集孔對應的最高稀釋度應為300士60倍。3.微量血凝抑制試驗(1)4ΗΑ·抗原的配制與驗證1)抗原稀釋方法將抗原先進行10倍稀釋，再稀釋為含4ΗΑ·血凝素。將配制的4ΗΑ·血凝素用生 理鹽水進行1 2、1 3、1 4、1 5、1 6和1 7稀釋。2)取96孔V型微量血凝板，每一稀釋度分別取25 μ L加入到孔中，加入生理鹽水 25 μ L，再加入1 %雞紅細胞懸液25 μ Lo3)對照50 μ L生理鹽水+25 μ L 1 %雞紅細胞懸液。4)以上試驗做2個平行重復。5)在微量振蕩器振蕩Imin ^iiin。6)室溫04 )放置30min，判定結果。7)判定標準如果配制的抗原液為4HA·，則1 4稀釋度將給出100%凝集點，即 反應孔底部無紅細胞，整個反應孔完全凝集；如果4HA·高于4個單位，可能1 5或1 6 為100%凝集點；如果較低，則可能1 2或1 3為100%凝集點。應根據測定結果適當 調整，其準確稀釋倍數=使100%紅細胞凝集終點的稀釋倍數XM0/4，使抗原工作液確為碰100。( 血清的稀釋1)標準陽性血清的的稀釋血清恢復原量后，依次進行10倍、20倍稀釋；然后 進行然后進行160、240、320、400、480、560倍稀釋。將稀釋好的陽性血清每一稀釋倍數取 0. 025ml，分別加入到V型微量反應板對應孔中。2)陰性血清的稀釋在V型微量反應板中，每孔加0. 025ml生理鹽水；第1孔加 入恢復原量后的陰性血清0. 025ml,反復抽打3 5次混勻；從第1孔吸取0. 025ml血清 加入第2孔，混勻后吸取0. 025ml加入第3孔，如此進行對倍稀釋至第6孔，從第6孔吸取 0. 025ml 棄去。3)被檢血清的稀釋血清恢復原量后，依次進行10倍、20倍稀釋；然后進行160、 240、320、400、480、560倍…依次遞增80倍稀釋。將稀釋好的陽性血清每一稀釋倍數取 0. 025ml，分別加入到V型微量反應板對應孔中。(3) V型微量反應板上所有血清孔加入4HA·的抗原液25 μ L。最后1排設50 μ L 生理鹽水和25 μ L生理鹽水+25 μ L 4ΗΑ100抗原(各4個孔)做對照。(4)充分振蕩后，室溫( )下靜置30min。每孔再加入雞紅細胞懸液 25 μ L，充分振蕩。(5)室溫(Μ )放置30min后判定結果。將血凝板傾斜70°且靜置10秒 左右開始記錄，凡反應孔底部有紅細胞沉積且沿傾斜面向下呈淚珠狀流淌，呈現與紅細胞 對照孔一樣者為完全不凝集孔(_)；反應孔底部有紅細胞沉積且沿傾斜面緩慢向下呈淚珠 狀流淌者為不完全凝集孔(+)；反應孔底部有紅細胞沉積但不沿傾斜面流淌者為50%凝集 孔(++)；除底部有少許紅細胞外，反應孔其他部位幾乎為完全凝集孔者(+++)；反應孔底部 無紅細胞，整個反應孔完全凝集者為完全凝集孔(#)。(6)結論陽性血清為200士40倍，陰性血清稀釋孔為(+)、(++)、(+++)或(#) ；50 μ L生理鹽 水對照孔為㈠，25 μ L生理鹽水+25 μ L 4ΗΑ100抗原孔為(#)，此時試驗方可判為成立。被 校定血清的完全不凝集孔對應的最高稀釋度即為該血清的紅細胞凝集抑制價。本發明的優點本發明涉及禽流感病毒H5W亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標準物質及制備 方法。本標準物質陽性血清和弱陽性血清系用青年或成年SPF雞，經肌肉注射禽流感病毒 H5m亞型(Re-5株)油乳劑滅活疫苗后，采集SPF雞血清并進行半成品檢驗，加入適宜穩定 劑后凍干；陰性血清系采自SPF雞血，分離血清并進行半成品檢驗，凍干；經成品檢驗、均一 性檢驗及穩定性檢驗及標準物質的標定、定值等一系列的工藝過程而制成。該標準物質是 禽流感H5亞型準確診斷、H5N1亞型(Re-5株)的免疫監測及對其疫苗免疫效果進行正確 評價的根本保障，提高禽流感的防控水平。對禽流感H5亞型進行診斷和相關產品檢驗工作 進行評價和質量控制的基本保障。實施例1陽性血清制造及半成品檢驗1.陽性血清制造(1)免疫選用3 4月齡SPF雞飼養于負壓隔離器內，用制備的禽流感滅活疫苗以胸部肌肉注射方式2次接種疫苗，第一次接種劑量為1.0ml/只，間隔21日后進行第二次 接種，劑量為1. 5ml/只，且分點注射。(2)試血于第2次免疫接種后觀日，用翅下靜脈采血方式采集血清，采血同時對 雞和血清對應編號，分別測定HI抗體效價(按《附錄》進行)，挑選HI抗體效價> 91og2 的SPF雞備用。(3)血清的分離選HI抗體效價彡91og2的SPF雞用20ml無菌注射器在負壓隔 離器內進行心臟采血，血液采集完畢后先置于37°C 4h，然后再置于4°C冰箱內過夜，在無菌 室超凈工作臺內提取血清，若血清中混有紅血球，應對其進行無菌離心后混合于同一滅菌 后的容器內。2.陽性血清半成品的檢驗(1)無菌檢驗對混合后的血清取樣，按《中國獸藥典》進行檢驗，應無細菌或霉菌 生長。(2)HI抗體價的測定按附錄進行HI抗體價的測定，結果應> 91og2。(3)特異性鑒定將待檢血清在同一條件下分別與H5、H7和H9亞型禽流感、雞新 城疫、減蛋綜合征病毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗(按《附錄》進行)，僅與禽流感病毒H9 亞型抗原呈陽性反應(HI ^ 71og2)，與H7和H9亞型禽流感、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗 原均應為陰性反應(HI ( 41og2)。(4)血清的配制經檢驗合格的血清按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生 物公司生產)和0. 5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學試劑有限公司生產)作為凍干保護 劑并充分攪拌均勻，并按《中國獸藥典》無菌檢驗法進行檢驗，應無菌生長。(5)分裝與凍干將配好的抗原液用安瓿進行分裝，每瓶lml，分裝后迅速放入凍 干機內進行冷凍真空干燥。凍干后扎鋁蓋、標號后放置-20°C保存。實施例2弱陽性血清制造及半成品檢驗1.弱陽性血清制造(1)免疫選用3 4月齡SPF雞飼養于負壓隔離器內，用制備的禽流感滅活疫苗 以胸部肌肉注射方式接種疫苗，接種劑量為0. 5ml/只。(2)試血于免疫接種后14 21日，用翅下靜脈采血方式采集血清，采血同時對 雞和血清對應編號，分別測定HI抗體效價(按附錄進行)，挑選HI抗體效價為51og2的SPF 雞備用。(3)血清的分離選HI抗體效價51og2的SPF雞用20ml無菌注射器在負壓隔離 器內進行心臟采血，血液采集完畢后先置于37°C 4h，然后再置于4°C冰箱內過夜，在無菌室 超凈工作臺內提取血清，若血清中混有紅血球，應對其進行無菌離心后混合于同一滅菌后 的容器內。2.弱陽性血清半成品的檢驗(1)無菌檢驗對混合后的血清取樣，按《中國獸藥典》進行檢驗，應無細菌或霉菌 生長。若有雜菌污染，應用0.22 μ的濾膜對其進行過濾除菌。(2) HI抗體價的測定按附錄進行HI抗體價的測定，結果應為HI價< 81og2，而 > 41og2。
(3)特異性鑒定將待檢血清在同一條件下分別與H5、H7和H9亞型禽流感、雞新 城疫、減蛋綜合征病毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗(按《附錄》進行)，僅與禽流感病毒H9 亞型抗原呈陽性反應(HI價< 81og2，而> 41og2)，與H7和H9亞型禽流感、雞新城疫、減蛋 綜合征病毒抗原均應為陰性反應。(4)血清的配制經檢驗合格的血清按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生 物公司生產)和0. 5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學試劑有限公司生產)作為凍干保護 劑并充分攪拌均勻，并按《中國獸藥典》無菌檢驗法進行檢驗，應無菌生長。(5)分裝與凍干將配好的抗原液用安瓿進行分裝，每瓶1ml，分裝后迅速放入凍 干機內進行冷凍真空干燥。凍干后扎鋁蓋、標號后放置-20°C保存。實施例3陰性血清制造及半成品檢驗1.陰性血清制造青年SPF雞飼養于生物安全動物實驗室內的負壓隔離器內，以無菌注射器在生物 安全動物實驗室內的負壓隔離器內進行心臟采血，血液采集完畢后先置于37°C 4h，然后再 置于4°C冰箱內過夜，在無菌室超凈工作臺內提取血清，然后混合于同一滅菌后的容器內。2.陰性血清半成品的檢驗(1)菌檢驗對混合后的血清取樣，按《中國獸藥典》進行檢驗，應無細菌或霉菌生長。(2)效價測定按附錄測定HI抗體效價，應為陰性。(3)特異性將血清在同一條件下(按《附錄》進行)，分別與禽流感、雞新城疫、 減蛋綜合征病毒抗原進行紅細胞凝集抑制試驗，血清對禽流感H5、H7、H9亞型、雞新城疫、 減蛋綜合征病毒抗原均為陰性反應。(4)血清的配制按總量的3%加入海藻糖(由北京拜爾迪生物公司生產)和 0.5%的甘氨酸(由天津市科密歐化學試劑有限公司生產)作為凍干保護劑并充分攪拌均 勻，并按《中國獸藥典》無菌檢驗法進行檢驗，應無菌生長。(5)分裝與凍干按aiil/瓶進行定量分裝，分裝后迅速冷凍真空干燥凍干(按照 《規程》方法進行)。實施例4血清成品檢驗1.物理性狀檢驗結果均為微黃色海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。2.無菌檢驗結果檢驗結果見表1，所有凍干制品全部呈陰性。表1無菌檢驗統計表
權利要求
1.一種禽流感病毒H5m亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標準物質，其特征在于(1)陽性血清標準物質有強陽性血清和弱陽性血清標準物質，此兩種陽性血清標準物 質只與禽流感病毒H5m亞型Re-5株抗原呈陽性反應，強陽性血清的HI價> 81og2,弱陽性 血清的HI價< 81og2而> 41og2 ；此兩種陽性血清與H7和H9亞型禽流感、雞新城疫、減蛋 綜合征病毒抗原均應為陰性反應；(2)陰性血清標準物質在同一條件下，分別與禽流感、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗原 進行紅細胞凝集抑制試驗，血清對禽流感H5、H7和H9亞型、雞新城疫、減蛋綜合征病毒抗原 均為陰性反應。
2.一種禽流感病毒H5W亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標準物質的制備方法，其特 征在于(1)按常規方法用禽流感病毒H5W亞型Re-5株病毒制備的油乳劑滅活疫苗；(2)陽性血清標準物質候選物系用青年或成年SPF雞，經肌肉注射禽流感病毒H5W亞 型Re-5株油乳劑滅活疫苗1)制備強陽性血清候選物，經2次免疫后，選取HI抗體效價>81og2的免疫雞只，分別 采集雞血清并進行半成品檢驗后混合，加入適宜穩定劑后凍干；2)制備弱陽性血清候選物僅1次免疫，選取HI抗體效價<81og2而> 41og2的免疫雞 只，分別采集雞血清并進行半成品檢驗后混合，加入適宜穩定劑后凍干；(3)陰性血清系采自SPF雞血，分離血清并進行半成品檢驗，凍干；(4)以上制備的強陽性血清、弱陽性血清和陰性血清標準物質候選物經檢驗、均一性檢 驗及穩定性檢驗及標準物質的標定、定值等一系列的工藝過程而成為強陽性血清、弱陽性 血清和陰性血清標準物質。
3.如權利要求1-2所述的一種禽流感病毒H5W亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標準 物質及制備方法，其特征在于使用的凍干保護劑為按血清總量的3%加入海藻糖和0. 5% 的甘氨酸作為凍干保護劑。
全文摘要
本發明涉及禽流感病毒H5N1亞型Re-5株陽性血清和陰性血清標準物質及制備方法。本標準物質陽性血清(強陽性血清和弱陽性血清)系用青年或成年SPF雞，經肌肉注射禽流感病毒H5N1亞型Re-5株油乳劑滅活疫苗后，采集SPF雞血清并進行半成品檢驗，加入適宜穩定劑后凍干；陰性血清系采自SPF雞血，分離血清并進行半成品檢驗，凍干；經成品檢驗、均一性檢驗及穩定性檢驗及標準物質的標定、定值等一系列的工藝過程而制成。該標準物質是禽流感H5N1亞型準確診斷和H5N1亞型Re-5株的免疫監測及對其疫苗免疫效果進行正確評價的根本保障，提高禽流感的防控水平。對禽流感H5N1亞型進行診斷和相關產品檢驗工作進行評價和質量控制的基本保障。
文檔編號C07K16/18GK102050876SQ201010532298
公開日2011年5月11日 申請日期2010年11月5日 優先權日2010年11月5日
發明者劉景利, 孫建宏, 張從祿, 徐姍姍, 楊帆, 田國彬, 胡井雷, 韓正博 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所