專利名稱：PRRSV、SIV H9亞型與PCV2多重SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR引物及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種病毒的檢測方法，具體涉及PRRSV、SIV H9亞型與PCV2多重STOR Green I實時熒光PCR引物及其檢測方法。
背景技術：
豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)和豬圓環病毒2型(PCV2)都能夠不同程度的導致妊娠引起種豬不育，即公豬睪丸腫脹，精液質量下降，失去種用能力；母豬表現為不發情，返情，不孕；妊娠母豬發生流產、早產、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔豬發病且導致大量死亡等，給養豬業造成了巨大的經濟損失。SIV能引起人獸共患病的發生和傳播，威脅人類安全。對這類傳染病的有效控制是保證人類公共安全和養豬業健康發展的關鍵因素之一。目前，國內外對以上三種病毒已經有大量的相關研究，建立了病毒分離、ELISA檢測方法、免疫組化法、免疫熒光法等方法，以及以分子生物學為基礎的檢測方法，如PCR、套式PCR和競爭PCR等。但這些方法都存在這樣那樣的缺點病毒分離耗時、原位雜交操作繁瑣等，PCR雖然有較高的特異性和敏感性，但容易出現假陰性結果，而且不能定量，往往漏檢隱性感染的動物，造成疾病的蔓延。TaqMan探針方法能夠定量，但成本較高，不利于推廣。 臨床上，這幾種病毒常常以混合感染的形式出現，靠分離病毒和抗體檢測來確診容易造成假陰性，而且操作繁瑣，對儀器的操作要求較高，所需時間長，亟需一種操作簡單、快速的檢測、準確率高的鑒別方法。

發明內容
本發明要解決的技術問題是PRRSV、SIV H9亞型與PCV2這幾種病毒常常以混合感染的形式出現，靠分離病毒和抗體檢測來確診容易造成假陰性，而且操作繁瑣，提供一種 PRRSV, SIV H9亞型與PCV2多重STOR Green I實時熒光PCR引物及其檢測方法。本發明的技術方案是PRRSV、SIV H9亞型與PCV2多重STOR Green I實時熒光 PCR引物SIV H9亞型引物的序列如下上游引物P1 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘；下游引物P2 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘；PRRSV引物的序列如下上游引物P3:5' -AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘；下游引物P4:5' -CCACAGTGTAACTTATCCTC-3 ‘；PCV2引物的序列如下上游引物P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘；下游引物P6:5' -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3‘。所述引物檢測PRRSV、SIV H9亞型與PCV2的多重STOR Green I實時熒光PCR檢測方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I實時熒光PCR反應體系和反應條件對病毒進行檢測 所述STOR Green I實時熒光PCR反應體系，在25 μ 1體系中加入以下成份
SYBR Premix Ex Taq II14.5 “L
？ VP3^50.5+0.5+0.5μ
p2^4/P60.5+0.5+0.5μ
DNA1+1+1 μL
ddH204.5μΙ>
25 \iL所述反應條件為95°C預變性Imin ；進入循環，95°C變性10s，56°C退火15s，72°C延伸15s，40個循環，反應結束后先加熱至95°C，然后再降至65°C，開始以0. 5°C /sec遞增至94°C檢測熒光信號，進而得出擴增產物的熔解曲線。本發明的有益效果是本發明分別設計擴增PRRSV、SIV H9亞型和PCV2的特異性引物，通過三重STOR Green I實時定量PCR檢測方法能夠同時檢測出PRRSV、SIV H9亞型和PCV2，本發明利用TM值來區分不同的核酸片段，核酸片段的TM值主要與GC含量、序列長度和結構有關。PRRSV的擴增片段基因序列長208bp，達到了 87°C左右；SIV擴增片段209bp，TM值最高，在90°C左右；PCV2的擴增片段為171bp，TM值在85°C左右，PRRSV、SIVH9亞型和PCV2的TM值可以很好的區分。在本發明中，PRRSV擴增片段的TM值、SIV H9亞型擴增片段的TM值和PCV2擴增片段的TM值會在一定的溫度范圍內波動，PRRSV的TM值變化范圍為86. 9-87. 2V，SIV H9亞型的TM值變化范圍為90. 2-90. 50C，PCV2的TM值變化范圍為85. 2-85. 6V,3種病毒的TM值相差較大，因此可以利用熔解曲線的三個特異性的峰對這3種病毒進行鑒別。本發明的敏感性表明，PRRSV、SIV H9亞型和PCV2同時檢出的極限拷貝數分別為187拷貝/ μ L，191拷貝/ μ L，203拷貝/ μ L。本發明的特異性試驗結果良好，只出現三個特異性的峰值，重復性試驗具有很好的穩定性并且本試驗的最大優勢在于能夠同時檢測PRRSV、SIV H9亞型和PCV23種DNA病毒，有利于這3種病毒的鑒別。本發明建立了檢測PRRSV、SIV H9亞型和PCV2多重STOR Green I熒光定量PCR方法，結果表明，該方法具有較好的特異性、重復性和敏感性，為PRRSV、SIV H9亞型和PCV2的檢測提供了一種新的方法，可作為規模化豬場PRRSV、SIV H9亞型和PCV2的凈化檢測方法，建立無PRRSV、SIV H9亞型和PCV2的豬群，同時也為PRRSV、SIV H9亞型和PCV2感染的分子流行病學調查，研究PRRSV、SIV H9亞型和PCV2分子發病機理，PRRSV、SIV H9亞型和PCV2診斷試劑盒的研制與開發，藥物或疫苗的免疫機制提供了試驗依據和技術手段。


圖1是PRRSV部分基因質粒PCR鑒定結果，M. DL 2000Marker, 1.陰性對照，2.目的片段；圖2是SIV H9亞型部分基因質粒PCR鑒定結果，M. DL 2000Marker, 1.陰性對照，2.目的片段；圖3是PCV2部分基因質粒PCR鑒定結果，M. DL 2000Marker, 1.陰性對照，2.目的片段；圖4是復合STOR Green I熒光定量PCR反應熔解曲線分析；圖5是多重STOR Green I熒光定量PCR反應特異性試驗熔解曲線分析；圖6是復合STOR Green I熒光定量PCR反應同濃度重復性試驗熔解曲線分析；圖7是不同濃度重復性試驗熔解曲線分析；圖8是不同濃度重復性試驗熔解曲線分析；圖9是不同濃度重復性試驗熔解曲線分析。
具體實施例方式PRRSV, SIV H9 亞型與 PCV2 多重 STOR Green I 實時熒光 PCR 引物SIV H9亞型引物的序列如下上游引物P1 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘；下游引物P2 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘；PRRSV引物的序列如下上游引物P3 5 ‘ -AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘；下游引物P4 5 ‘ -CCACAGTGTAACTTATCCTC-3 ‘；PCV2引物的序列如下上游引物P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘；
下游引物 P6 5 ‘ -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3 ‘；所述引物檢測PRRSV、SIV H9亞型與PCV2的多重STOR Green I實時熒光PCR檢測方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I實時熒光PCR反應體系和反應條件對病毒進行檢測所述STOR Green I實時熒光PCR反應體系，在25 μ 1體系中加入以下成份
權利要求
1.PRRSV, SIV H9亞型與PCV2多重STOR Green I實時熒光PCR引物，其特征在于SIV H9亞型引物的序列如下上游引物 P1 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘；下游引物 P2 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘；PRRSV引物的序列如下上游引物 P3 5 ‘ AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3 ‘；下游引物 P4 5 ‘ CCACAGTGTAACTTATCCTC-3 ‘；PCV2引物的序列如下上游引物 P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘；下游引物 P6 5 ‘ -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3 ‘。
2.利用權利要求1所述引物檢測PRRSV、SIVH9亞型與PCV2的多重STOR Green I實時熒光PCR檢測方法，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBR Green I實時熒光PCR反應體系和反應條件對病毒進行檢測，其特征在于所述STOR Green I實時熒光PCR反應體系，在25 μ 1體系中加入以下成份
全文摘要
本發明公開了一種PRRSV、SIV H9亞型與PCV2多重SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR·引物，SIV H9亞型引物的序列如下上游引物P15′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′；下游引物P25′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′；PRRSV引物的序列如下上游引物P35′-AAACCAGTCCAGAGGCAAG-3′；下游引物P45′-CCACAGTGTAACTTATCCTC-3′；PCV2引物的序列如下上游引物P55′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；下游引物P65′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。本發明分別設計擴增PRRSV、SIV H9亞型和PCV2的特異性引物，通過三重SYBR Green Ⅰ實時定量PCR檢測方法能夠同時檢測出PRRSV、SIV H9亞型和PCV2，PRRSV、SIV H9亞型和PCV2同時檢出的極限拷貝數分別為187拷貝/μL，191拷貝/μL，203拷貝/μL。本發明的特異性試驗結果良好，只出現三個特異性的峰值，重復性試驗具有很好的穩定性并且本試驗的最大優勢在于能夠同時檢測PRRSV、SIV H9亞型和PCV23種DNA病毒，有利于這3種病毒的鑒別。
文檔編號C12Q1/68GK102373296SQ20111022171
公開日2012年3月14日 申請日期2011年8月4日 優先權日2011年8月4日
發明者劉芳, 崔保安, 李明鳳, 陳紅英, 韓志濤, 魏戰勇 申請人:河南農業大學