本發(fa)明屬于(yu)基因工程疫(yi)苗技術領域，具體涉及一(yi)種表達(da)h9亞型禽(qin)流(liu)感病毒ha基因的(de)重組火雞皰疹病毒株。

背景技術：

我(wo)國(guo)自1994年首次(ci)報道從雞群(qun)中分離到h9亞型(xing)禽流感(gan)病(bing)毒(du)(avianinfluenzavirus，aiv)以來，該(gai)(gai)亞型(xing)禽流感(gan)在(zai)我(wo)國(guo)一(yi)直呈地方性(xing)流行，嚴重危害我(wo)國(guo)養(yang)禽業的發(fa)展。h9亞型(xing)aiv傳播能力強，流行范圍廣，感(gan)染(ran)家(jia)禽主要(yao)表現為產(chan)蛋(dan)下(xia)降，該(gai)(gai)亞型(xing)病(bing)毒(du)雖然對雞低(di)致(zhi)病(bing)性(xing)，但并發(fa)或繼發(fa)感(gan)染(ran)其他(ta)病(bing)原可引起高發(fa)病(bing)率和死亡率，給我(wo)國(guo)養(yang)禽業造成(cheng)巨大的經濟損失。

目前滅(mie)活(huo)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)的(de)(de)使用成為預(yu)防和控制(zhi)禽流感的(de)(de)主要手段，但(dan)常規的(de)(de)滅(mie)活(huo)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)存(cun)在(zai)著一些難以(yi)克(ke)服的(de)(de)缺陷：滅(mie)活(huo)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)生產費(fei)(fei)時費(fei)(fei)力，且油(you)乳(ru)佐劑(ji)會引(yin)起局部的(de)(de)不(bu)(bu)良反應(ying)，導致動(dong)物不(bu)(bu)適和肉質下降(jiang)；不(bu)(bu)能誘導有(you)效的(de)(de)細胞免疫(yi)(yi)(yi)應(ying)答和粘膜免疫(yi)(yi)(yi)igg抗體的(de)(de)產生，因(yin)(yin)而(er)無法有(you)效地抑(yi)制(zhi)呼吸道(dao)中流感病毒(du)的(de)(de)復制(zhi)；免疫(yi)(yi)(yi)效率低下，免疫(yi)(yi)(yi)劑(ji)量大，不(bu)(bu)能與(yu)自然感染(ran)區分，影響(xiang)禽流感的(de)(de)監控，而(er)且存(cun)在(zai)著散毒(du)的(de)(de)危險(xian)等。因(yin)(yin)此(ci)，急需研制(zhi)新型禽流感疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)來克(ke)服現(xian)有(you)疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)的(de)(de)不(bu)(bu)足。而(er)基(ji)因(yin)(yin)重組活(huo)載(zai)體疫(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)在(zai)很大程度上可以(yi)避免上述(shu)情況。

目前(qian)用于(yu)構(gou)建重組(zu)病(bing)毒的(de)(de)(de)活載(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)有(you)很多，如馬立(li)克(ke)氏病(bing)毒(mdv-1)、火雞皰(pao)疹病(bing)毒(hvt)、新城(cheng)疫病(bing)毒(ndv)、鴨(ya)瘟(wen)病(bing)毒(dev)、傳染性喉(hou)氣管炎(yan)病(bing)毒(iltv)、雞痘(dou)病(bing)毒(fpv)等(deng)。與(yu)其(qi)他禽病(bing)毒載(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)相(xiang)比，hvt具(ju)(ju)(ju)有(you)很多獨特的(de)(de)(de)優(you)勢。其(qi)優(you)勢主要包括：hvt有(you)20多個可(ke)供外(wai)(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)插入(ru)的(de)(de)(de)復制非必需區，因(yin)(yin)此其(qi)復制非必需區可(ke)以(yi)(yi)(yi)插入(ru)較長(chang)外(wai)(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)，有(you)利于(yu)構(gou)建多價重組(zu)活疫苗(miao)，其(qi)中(zhong)已報(bao)道(dao)的(de)(de)(de)復制非必需區有(you)us1、us2、us3、us6、us10、us7、ul23、ul44、ul45、ul46、tk、pk等(deng)；hvt可(ke)在雞體(ti)(ti)(ti)(ti)內(nei)持(chi)續(xu)感染，為外(wai)(wai)源(yuan)(yuan)基(ji)(ji)因(yin)(yin)的(de)(de)(de)表達提供良(liang)好(hao)的(de)(de)(de)活載(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)，可(ke)以(yi)(yi)(yi)刺激機體(ti)(ti)(ti)(ti)持(chi)續(xu)的(de)(de)(de)產生抗體(ti)(ti)(ti)(ti)；hvt作為疫苗(miao)對雞無致病(bing)性，不影響其(qi)生產性能，安全性好(hao)；hvt可(ke)刺激機體(ti)(ti)(ti)(ti)產生堅強(qiang)(qiang)的(de)(de)(de)細胞(bao)免疫反(fan)應(ying)，且持(chi)續(xu)時間長(chang)，接種一(yi)次可(ke)達到終(zhong)生免疫的(de)(de)(de)效(xiao)果；hvt具(ju)(ju)(ju)有(you)很強(qiang)(qiang)的(de)(de)(de)細胞(bao)結合特性，可(ke)以(yi)(yi)(yi)在細胞(bao)間傳播；以(yi)(yi)(yi)hvt為載(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)工程(cheng)苗(miao)可(ke)以(yi)(yi)(yi)突破(po)母(mu)源(yuan)(yuan)抗體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)干(gan)擾等(deng)。因(yin)(yin)此，以(yi)(yi)(yi)hvt為載(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)工程(cheng)苗(miao)具(ju)(ju)(ju)有(you)廣(guang)闊(kuo)的(de)(de)(de)應(ying)用前(qian)景。

就(jiu)aiv而言，ha蛋(dan)白作為主(zhu)(zhu)要免(mian)疫保護(hu)性抗原(yuan)，是體液免(mian)疫的靶抗原(yuan)，主(zhu)(zhu)要誘導(dao)機體產(chan)生中和抗體，因此如何能夠以火雞皰疹病(bing)毒(hvt)為載(zai)體進行(xing)h9亞(ya)型禽流感病(bing)的活疫苗研究成為一項亟待攻(gong)克的難(nan)題。

技術實現要素：

本(ben)發明的目的是(shi)提供(gong)一種表達h9亞型禽(qin)流(liu)感病(bing)毒(du)ha基因重(zhong)組火雞(ji)皰疹(zhen)病(bing)毒(du)株，該病(bing)毒(du)株可用(yong)于家(jia)禽(qin)中誘導針對h9亞型aiv的保護性免疫應答。

本發(fa)明首先提(ti)供一(yi)種在火雞皰(pao)疹(zhen)(zhen)病毒中插入(ru)外源基因的方(fang)法，是(shi)將外源基因插入(ru)火雞皰(pao)疹(zhen)(zhen)病毒(hvt)的兩(liang)個插入(ru)位(wei)點us2和us10，

更(geng)具(ju)體的，所述的插入位點(dian)位于hvt基因組us2區(qu)的140276nt-140285nt之(zhi)間。

本發明再(zai)一(yi)(yi)方面提供一(yi)(yi)種重組火(huo)雞皰(pao)疹病(bing)毒，是通過(guo)在火(huo)雞皰(pao)疹病(bing)毒的(de)(de)us2區和(he)us10區分別(bie)插入h9亞(ya)型(xing)禽(qin)流感病(bing)毒ha基因和(he)h9亞(ya)型(xing)禽(qin)流感病(bing)毒的(de)(de)ha2基因構建(jian)的(de)(de)；

本(ben)發明所提(ti)供的(de)表達h9亞型(xing)禽流感病(bing)毒(du)ha基因重組火雞皰疹病(bing)毒(du)(rhvt-h9-ha)株(zhu)，于2017年(nian)1月18日保藏在位于中國武漢(han)、武漢(han)大(da)學(xue)的(de)中國典型(xing)培養物保藏中心，保藏編(bian)號為cctccno:v201707。

本(ben)發(fa)明的rhvt-h9-ha株用于表達ha基因蛋白，

本發明的(de)rhvt-h9-ha株的(de)另一方面的(de)用(yong)途是(shi)用(yong)于制備疫(yi)苗(miao)；

本(ben)發明以(yi)(yi)火雞皰(pao)疹病毒(hvt)fc-126疫苗毒株為載體，分(fen)(fen)別(bie)以(yi)(yi)其復制非必需區(qu)us2和(he)(he)us10為插入位點(dian)，構建表達(da)(da)egfp標記基(ji)(ji)因(yin)的(de)重(zhong)組病毒rhvt-egfp。本(ben)發明選擇(ze)h9亞型禽流感病毒yz140706株的(de)ha基(ji)(ji)因(yin)完整(zheng)的(de)開放閱讀(du)框(kuang)和(he)(he)ha2基(ji)(ji)因(yin)分(fen)(fen)別(bie)構建表達(da)(da)盒，再次利用同源重(zhong)組原理(li)，用上述(shu)兩(liang)個基(ji)(ji)因(yin)表達(da)(da)盒分(fen)(fen)別(bie)替換重(zhong)組病毒rhvt-egfp的(de)標記基(ji)(ji)因(yin)egfp，分(fen)(fen)別(bie)篩選出表達(da)(da)完整(zheng)ha基(ji)(ji)因(yin)和(he)(he)部(bu)分(fen)(fen)ha基(ji)(ji)因(yin)的(de)重(zhong)組hvt。

免(mian)疫(yi)保(bao)護(hu)評價結果表明(ming)，本發(fa)明(ming)的rhvt-h9-ha株對(dui)h9亞型禽流感病(bing)毒，可(ke)以提(ti)供100％攻(gong)毒保(bao)護(hu)。

附圖說明

圖1：轉移的構建模(mo)式(shi)圖；

圖(tu)2：重組病毒rhvt-h9-ha的構建示(shi)意圖(tu)；

圖(tu)3：ha基因及其表達盒pcr電泳圖(tu)；

圖4：重組病毒rhvt-egfp的熒(ying)光圖；

圖5：重組病毒rhvt-h9-ha的噬斑圖；

圖6：鑒定重組病毒rhvt-h9-ha外源基因表達的ifa試驗；

圖7：鑒定重組病毒rhvt-h9-ha外源基(ji)因表達(da)的western-blot試(shi)驗圖片；

圖8：hvt親本毒(du)(du)和重組病毒(du)(du)在(zai)cef上的生長曲(qu)線圖。

具體實施方式

下面以構(gou)建表達(da)ha基因(yin)完整開放閱讀框的(de)重(zhong)組hvt為(wei)例，對本發明(ming)進行詳細(xi)的(de)描述，。

實施例1

1實驗材料

1.1毒(du)株、菌(jun)株和(he)質粒

hvtfc-126疫苗株由揚(yang)州大學農業部畜禽傳染病(bing)重點(dian)開放實驗室保存。

h9亞型aiva/chicken/yangzhou/14/0706(h9n2)株(yz140706株)由(you)揚(yang)州大學農業(ye)部畜(chu)禽傳染病(bing)重點開放(fang)實(shi)驗(yan)室保藏(zang)。

感(gan)受態細(xi)胞trans-t1購自北京全式金生物技術(shu)有(you)限(xian)公(gong)司(si)；雞胚成纖維(wei)細(xi)胞系(df-1)由青島易邦生物工程有(you)限(xian)公(gong)司(si)保藏。

質粒(li)：peasy-t3，peasy-blunt，peasy-m1購自(zi)北京(jing)全式(shi)金生物科(ke)技有限(xian)公司(si)；pcr2.1、pt-egfp由本(ben)揚州大學農業部畜(chu)禽傳染病(bing)重點開放實(shi)驗室保存(cun)，其中pt-egfp包含表(biao)達綠色熒光蛋白(gfp)的表(biao)達盒，表(biao)達盒兩端分別有notⅰ和avrⅱ酶切位點。

2實驗方法

2.1中間轉移載(zai)體pfr的構建

2.1.1同源(yuan)臂引物(wu)的設計

選擇hvt的(de)us2區插入(ru)外源(yuan)基(ji)因，參照genbank中登錄的(de)hvtfc126株(登錄號(hao)：af291866)的(de)全基(ji)因序列(lie)，用primerpremier5.0引(yin)物(wu)(wu)設(she)計軟件設(she)計兩對引(yin)物(wu)(wu)，分別pcr擴增(zeng)fwd、rev同源(yuan)臂(bei)。fwd同源(yuan)臂(bei)上游引(yin)入(ru)kpnⅰ酶(mei)切位(wei)(wei)點，下(xia)(xia)游引(yin)入(ru)speⅰ和avrⅱ酶(mei)切位(wei)(wei)點。rev同源(yuan)臂(bei)上游引(yin)入(ru)notⅰ酶(mei)切位(wei)(wei)點，下(xia)(xia)游引(yin)入(ru)apaⅰ酶(mei)切位(wei)(wei)點。引(yin)物(wu)(wu)序列(lie)如下(xia)(xia)：

fwd-f:5'-gaaggtaccttctaaatggaaagaaaacaaggcg-3'

fwd-r:5'-aaaactagtcctaggacgttccccagctgcaggggctt-3'

rev-f:aaagcggccgcgagccgataatttgatatacgc

rev-r:tattgggcccggagcgagagatgaaagaatact

引(yin)物用(yong)超純水稀釋至10μm，-20℃保(bao)存(cun)備用(yong)。

2.1.2轉(zhuan)移載體(ti)pfr的構建

以hvtfc-126株感染(ran)cef病變細(xi)胞的總dna為(wei)模(mo)板，分(fen)別(bie)以fwd-f/fwd-r和rev-f/rev-r為(wei)引物擴增fwd、rev同源臂，回收目的片段。回收產物與peasytm-t3克(ke)隆載體進行連(lian)接轉化。測序鑒定(ding)正確的克(ke)隆，分(fen)別(bie)命(ming)名為(wei)pt-fwd和pt-rev，提取質(zhi)粒，置于(yu)-20℃冰箱(xiang)保存備用(yong)。

將質粒(li)pt-fwd和(he)(he)(he)pcr2.1用kpnⅰ、speⅰ進行酶切，1％凝膠(jiao)電泳(yong)后(hou)切膠(jiao)回(hui)(hui)收pt-fwd載(zai)體(ti)中(zhong)的(de)(de)fwd片段(duan)(duan)和(he)(he)(he)線(xian)(xian)性化(hua)pcr2.1載(zai)體(ti)。將回(hui)(hui)收后(hou)的(de)(de)fwd片段(duan)(duan)和(he)(he)(he)線(xian)(xian)性化(hua)載(zai)體(ti)pcr2.1連接(jie)，構建(jian)質粒(li)p-f。將質粒(li)pt-rev和(he)(he)(he)p-f用notⅰ和(he)(he)(he)apaⅰ進行酶切，1％凝膠(jiao)電泳(yong)后(hou)切膠(jiao)回(hui)(hui)收pt-rev載(zai)體(ti)中(zhong)的(de)(de)rev片段(duan)(duan)和(he)(he)(he)線(xian)(xian)性化(hua)載(zai)體(ti)p-f，將回(hui)(hui)收后(hou)的(de)(de)rev片段(duan)(duan)和(he)(he)(he)線(xian)(xian)性化(hua)載(zai)體(ti)p-f連接(jie)，構建(jian)質粒(li)p-fr。

2.2真核表達載體pt-cmv-ha的構建(jian)

2.2.1引物設計

參照(zhao)genbank中登錄(lu)的(de)(de)h9亞型(xing)aiv的(de)(de)ha基因序列(lie)和peasy-m1載(zai)體序列(lie)，用primerpremier5.0軟件(jian)設計兩對引(yin)物，分別用于pcr擴(kuo)增ha基因和peasy-m1載(zai)體表(biao)達盒。ha基因下游去掉(diao)終止密碼子后，添(tian)加v5標(biao)簽(qian)。擴(kuo)增peasy-m1載(zai)體表(biao)達盒引(yin)物的(de)(de)5’端引(yin)入notⅰ位點(dian)，引(yin)物3’端引(yin)入avrⅱ位點(dian)。

cmv-pa-f:5’-gtatagcggccgccgatgtacgggccagatatacg-3’

cmv-pa-r:5’-gaaatcctaggtggggataccccctagagccc-3’

ha-f：5’-aagatggagacagtatcactaataac-3’

ha-r:5’-tatacaaatgttgcatctgcaagac-3’

ha2-f:5’-aagatgtctgctaggtcttatcaaa-3’

ha2-r:5’-gatccaaatgttgcaatcgcaagac-3’

引物用超純(chun)水稀釋至10μm，-20℃保存備(bei)用。

2.2.2ha基因的(de)擴增

取(qu)禽(qin)流感病(bing)毒h9亞型yz140706株無菌尿囊液400μl，提取(qu)rna，以ha-f/ha-r為(wei)引物，進行(xing)rt-pcr，反應結(jie)束后(hou)進行(xing)1％瓊脂糖凝(ning)膠電泳(yong)，回收(shou)目的(de)條帶，回收(shou)產物放置(zhi)-20℃冰箱保存備用；其中ha基因的(de)核苷酸(suan)序(xu)列為(wei)seqidno:1，ha2的(de)核苷酸(suan)序(xu)列為(wei)seqidno:2。

2.2.3pcr產物(wu)連(lian)接與陽性克隆的(de)鑒定

將上述回收的目的片段定(ding)向(xiang)連接(jie)到真核表達載(zai)體peasy-m1中，pcr鑒(jian)定(ding)陽性(xing)克隆送測(ce)序，測(ce)序正確的克隆命名(ming)為pm1-h9-ha。

2.2.4克(ke)隆載體pt-cmv-ha的構建

以(yi)質粒(li)pm1-h9-ha為模(mo)板，以(yi)cmv-pa-f/cmv-pa-r為引物(wu)，pcr擴增ha基因(yin)表達盒。反應結束后，pcr產物(wu)進行1％瓊脂糖(tang)凝膠(jiao)電泳。回收大小約為3000bp左右目的(de)條帶(dai)。回收產物(wu)連接peasytm-t3克(ke)隆載(zai)體，鑒定正確的(de)陽性克(ke)隆命名為pt-cmv-h9-ha。

2.3轉移載體pfr-egfp和pfr-ha的(de)構建

質粒pt-egfp、pt-cmv-h9-ha和p-fr用notⅰ、avrⅱ進行(xing)雙酶切(qie)(qie)。1％凝膠電泳后(hou)，回(hui)收notⅰ-egfp-avrⅱ、notⅰ-h9-ha-avrⅱ片段，與同(tong)樣經notⅰ、avrⅱ酶切(qie)(qie)的(de)線性(xing)化載體p-fr進行(xing)連接。構建的(de)陽(yang)性(xing)克隆分別(bie)命名為(wei)pfr-egfp、pfr-h9-ha。

2.4轉(zhuan)移(yi)載體(ti)的鑒定(ding)表達

2.4.1載(zai)體pfr-egfp的鑒(jian)定

將構建成功的轉移(yi)載(zai)體pfr-egfp瞬(shun)時轉染到長至80％的df1細(xi)胞培(pei)養(yang)皿中(zhong)，繼(ji)續培(pei)養(yang)18～24h后，熒(ying)光顯微鏡下觀察(cha)綠(lv)色熒(ying)光蛋白的表達(da)情況。

2.4.2載體pfr-h9-ha的鑒(jian)定

①western-blot試(shi)驗

轉移載體(ti)pfr-h9-ha轉染df1細胞(bao)，繼續培養24h后收(shou)集細胞(bao)。western-blot試驗(yan)鑒定蛋白表(biao)達(da)。

②間接免疫熒光試驗(ifa)

轉(zhuan)移載體pfr-h9-ha瞬時轉(zhuan)染(ran)于鋪有(you)df1細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)96孔板(ban)中，24h后進(jin)行(xing)簡接免疫(yi)熒(ying)光(guang)(guang)，倒(dao)置熒(ying)光(guang)(guang)顯(xian)微鏡(jing)下觀察轉(zhuan)染(ran)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)情況。

2.5表(biao)達egfp的(de)重組火雞(ji)皰疹病毒(rhvt-egfp)構建

2.5.1hvtfc-126株基因組的(de)提取

按常規(gui)方(fang)法制備cef，hvtfc-126毒株接(jie)種于長滿(man)單(dan)層cef的(de)細胞(bao)(bao)瓶中(zhong)，37℃、5％co2細胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)(yang)箱(xiang)(xiang)中(zhong)培(pei)養(yang)(yang)60～84h，待(dai)80％的(de)細胞(bao)(bao)產生典型蝕斑病變(bian)后(hou)，收集細胞(bao)(bao)，用于提取(qu)病毒dna。具體(ti)操作步驟如下：棄掉培(pei)養(yang)(yang)液(ye)，pbs洗三次(ci)，每t75細胞(bao)(bao)瓶加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)5mlpk(20mmtris-hcl，ph8.0；0.5％sds；150mmnacl；2mmedta，ph8.0；0.2mg/ml胰蛋白(bai)酶)溶(rong)(rong)液(ye)，37℃培(pei)養(yang)(yang)箱(xiang)(xiang)靜(jing)置2h；細胞(bao)(bao)裂解物(wu)轉移至(zhi)50ml離(li)(li)心(xin)(xin)管中(zhong)，加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)1/2體(ti)積的(de)飽(bao)和(he)酚(fen)(使蛋白(bai)變(bian)性)，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)顛倒混勻(yun)，作用1min；加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)1/2體(ti)積的(de)的(de)氯仿/異(yi)戊醇(24:1)溶(rong)(rong)液(ye)，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)混勻(yun)，8000r/min離(li)(li)心(xin)(xin)15min；吸取(qu)上(shang)(shang)清(qing)于新(xin)離(li)(li)心(xin)(xin)管中(zhong)，再次(ci)加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)等體(ti)積的(de)氯仿/異(yi)戊醇抽(chou)提雜(za)蛋白(bai)，8000r/min離(li)(li)心(xin)(xin)5min；吸取(qu)上(shang)(shang)清(qing)于新(xin)離(li)(li)心(xin)(xin)管中(zhong)，加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)2倍體(ti)積預冷的(de)無水乙(yi)醇和(he)1/10體(ti)積的(de)3m醋酸鈉(ph5.2)，-20℃靜(jing)置30min；4500r/min離(li)(li)心(xin)(xin)5min，棄上(shang)(shang)清(qing)，加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)10ml預冷的(de)70％乙(yi)醇清(qing)洗dna沉淀物(wu)，4500r/min離(li)(li)心(xin)(xin)10min，棄上(shang)(shang)清(qing)，瞬離(li)(li)吸干上(shang)(shang)清(qing)；自(zi)然干燥(zao)后(hou)，加(jia)(jia)(jia)適量te緩沖(chong)液(ye)溶(rong)(rong)解dna；紫外分光光度(du)計測定(ding)dna的(de)濃度(du)及純度(du)，4℃保存(cun)備用。

2.5.2表達egfp的(de)重(zhong)組病(bing)毒拯救(jiu)

轉染前制(zhi)(zhi)備(bei)次(ci)代cef細(xi)胞，細(xi)胞生長于加入m199培(pei)養基(含3％類胎(tai)牛血清)的60mm培(pei)養皿中，待(dai)細(xi)胞長至(zhi)鋪滿單層的80％時，配制(zhi)(zhi)轉染體(ti)系，進(jin)行(xing)轉染。采用磷酸鈣共沉淀法拯(zheng)救重組(zu)病毒(du)，配制(zhi)(zhi)體(ti)系如下：

上述(shu)體系(xi)混勻(yun)后，從管(guan)底緩(huan)慢(man)加入2mcacl231μl；緩(huan)慢(man)加入2×hbsp溶液(10mg/mlherpes；0.74mg/mlkcl；16mg/mlnacl；0.25mg/mlna2hpo4；2mg/ml葡萄糖，ph值調至6.96)250μl，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)顛倒混勻(yun)，室溫靜(jing)置30min；向制備次代(dai)cef的(de)60mm培(pei)養皿中加入上述(shu)混合(he)物，37℃，5％co2條件下繼續培(pei)養。轉染細胞培(pei)養4h后，配(pei)制甘油休克液，對細胞進行(xing)休克。配(pei)制2.5ml體系(xi)如下：

取出細(xi)胞培(pei)(pei)(pei)(pei)養皿，棄掉培(pei)(pei)(pei)(pei)養基，用m199培(pei)(pei)(pei)(pei)養基洗(xi)(xi)滌(di)細(xi)胞2～3次(ci)；加(jia)甘油(you)休克液靜置1min；再次(ci)用m199培(pei)(pei)(pei)(pei)養基清洗(xi)(xi)細(xi)胞2～3次(ci)；加(jia)適量(liang)3％m199培(pei)(pei)(pei)(pei)養基(含3％類胎牛血(xue)清)；37℃，5％co2條件(jian)下培(pei)(pei)(pei)(pei)養5～7d，熒(ying)光(guang)顯微鏡下觀察，挑選帶有綠色熒(ying)光(guang)的病(bing)毒蝕斑。

2.5.3重組病(bing)毒rhvt-egfp的純化

熒光(guang)顯(xian)微鏡下(xia)(xia)觀察(cha)轉(zhuan)染細(xi)胞(bao)，用記號筆標注出帶(dai)有綠色熒光(guang)的病毒(du)蝕斑，胰(yi)酶(mei)消化法挑取標記的病變(bian)細(xi)胞(bao)，接種于次代cef單(dan)層細(xi)胞(bao)上，37℃，5％co2條(tiao)件下(xia)(xia)培養3～4d；重復上述步驟，至(zhi)所(suo)有蝕斑均顯(xian)示(shi)熒光(guang)，完全純(chun)化的重組病毒(du)命名為rhvt-egfp。

2.6表(biao)達h9亞(ya)型aiv重組火雞皰疹病(bing)毒的構建

將重(zhong)組(zu)(zu)(zu)病(bing)毒(du)rhvt-egfp接種(zhong)于原代(dai)cef細胞上(shang)，待80％細胞出現特(te)征性病(bing)變時，提取(qu)細胞基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)，提取(qu)步驟同(tong)上(shang)。依(yi)據同(tong)源重(zhong)組(zu)(zu)(zu)原理，將轉(zhuan)(zhuan)移(yi)載(zai)體(ti)(ti)pfr-h9-ha與(yu)rhvt-egfp基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)磷酸(suan)鈣法轉(zhuan)(zhuan)染次(ci)代(dai)cef細胞，轉(zhuan)(zhuan)染方法同(tong)上(shang)。若(ruo)rhvt-egfp基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)dna與(yu)轉(zhuan)(zhuan)移(yi)載(zai)體(ti)(ti)在(zai)細胞內發生同(tong)源重(zhong)組(zu)(zu)(zu)，即轉(zhuan)(zhuan)移(yi)載(zai)體(ti)(ti)中(zhong)(zhong)ha基(ji)因(yin)(yin)表(biao)達盒將重(zhong)組(zu)(zu)(zu)病(bing)毒(du)rhvt-egfp基(ji)因(yin)(yin)組(zu)(zu)(zu)中(zhong)(zhong)的(de)egfp表(biao)達盒替(ti)換(huan)，產生新的(de)重(zhong)組(zu)(zu)(zu)病(bing)毒(du)蝕斑(ban)(ban)將不含有綠色熒光。篩選(xuan)不帶熒光的(de)病(bing)毒(du)蝕斑(ban)(ban)，采用有限稀釋法不斷篩選(xuan)純(chun)化(hua)，直至培養(yang)皿中(zhong)(zhong)所有蝕斑(ban)(ban)均不帶有熒光，拯救成功重(zhong)組(zu)(zu)(zu)病(bing)毒(du)命(ming)名為rhvt-h9-ha；于2017年1月(yue)18日保藏在(zai)位于中(zhong)(zhong)國(guo)武漢(han)、武漢(han)大學的(de)中(zhong)(zhong)國(guo)典(dian)型培養(yang)物保藏中(zhong)(zhong)心，保藏編號為cctccno:v201707。

2.7重組病毒的(de)傳代及(ji)鑒定(ding)

2.7.1pcr鑒(jian)定

rhvt-h9-ha在cef連續傳20代(dai)，每隔5代(dai)次，以rhvt-h9-ha基因組為模板，以ha-f和ha-r為引物進行pcr，均可擴增出1700bp左右的目的條帶，表明ha基因成功插入到hvt基因組中(zhong)，并未出現基因丟失現象。

2.7.2western-blot試驗鑒(jian)定

重組(zu)病毒rhvt-h9-ha接(jie)種原代(dai)cef細胞(bao)(bao)，3～4d后收集病變細胞(bao)(bao)制備蛋白(bai)(bai)樣(yang)(yang)品(pin)。western-blot檢測蛋白(bai)(bai)表達(da)情(qing)況，試驗中用(yong)h9亞型(xing)禽流感(gan)病毒陽性(xing)(xing)(xing)血(xue)清作為一(yi)抗(kang)，用(yong)hrp標記(ji)的(de)(de)羊抗(kang)雞igg作為二抗(kang)。試驗中設置(zhi)陰(yin)性(xing)(xing)(xing)對照(用(yong)rhvt-egfp細胞(bao)(bao)毒制備蛋白(bai)(bai)樣(yang)(yang)品(pin))。增(zeng)強型(xing)化學發光(guang)法(fa)(ecl)顯色，結果表明，由接(jie)種rhvt-h9-ha的(de)(de)cef制備的(de)(de)蛋白(bai)(bai)樣(yang)(yang)品(pin)可以擴增(zeng)出預期的(de)(de)特(te)異性(xing)(xing)(xing)條帶，而陰(yin)性(xing)(xing)(xing)對照樣(yang)(yang)品(pin)未出現特(te)異性(xing)(xing)(xing)條帶出現。

2.7.3間(jian)接免疫熒光試驗(ifa)鑒定

將重組病(bing)(bing)毒rhvt-h9-ha接(jie)種(zhong)于長滿單層cef的96孔細胞培養板中，37℃，5％co2條(tiao)件下培養，待細胞出(chu)現典型蝕(shi)斑后(hou)，將培養液棄掉(diao)，用(yong)80％丙酮固定10min，pbs洗(xi)(xi)3次(ci)，每個(ge)空中加(jia)入50μl(1:100稀(xi)釋)flag單抗，37℃恒溫(wen)培養箱中孵育(yu)1h，用(yong)pbs洗(xi)(xi)3次(ci)，每孔加(jia)50μlfitc標記抗鼠igg熒(ying)光抗體，放置37℃恒溫(wen)培養箱中孵育(yu)1h，用(yong)pbs洗(xi)(xi)3次(ci)，在倒置熒(ying)光顯微鏡下觀(guan)察，rhvt-h9-ha感染孔出(chu)現特異性綠(lv)色熒(ying)光，而hvt感染孔無(wu)熒(ying)光，表(biao)明(ming)rhvt-h9-ha病(bing)(bing)毒株中ha基因能(neng)夠正確的表(biao)達。

2.8重組(zu)病(bing)毒對h9亞型aiv的免疫保(bao)護評(ping)價(jia)

將120只1日齡spf雞隨機分成6組，分別為rhvt-us2-h9-ha組、rhvt-us10-h9-ha組、rhvt-us2-h9-ha2組、rhvt-us10-h9-ha2組、滅活疫苗免疫組、攻毒對照組；其中rhvt-us2-h9-ha組于1日齡時通過頸部皮下接種5000pfu保藏編號為cctccno:v201707的重組疫苗、rhvt-us10-h9-ha組于1日齡時通過頸部皮下接種5000pfurhvt-us10-h9-ha、rhvt-us2-h9-ha2組于1日齡時通過頸部皮下接種5000pfurhvt-us2-h9-ha2、rhvt-us10-h9-ha2組于1日齡時通過頸部皮下接種5000pfurhvt-us10-h9-ha2，滅活疫苗免疫組于14日齡時通過肌肉注射接種1羽份的青島易邦生物工程有限公司滅活疫苗ybf003株，攻毒對照組均接種無菌pbs。各組于28日齡用1×10⁵eld50劑(ji)量的h9亞型aiv經(jing)滴鼻點眼途(tu)徑(jing)進(jin)行攻毒(du)(du)(du)。攻毒(du)(du)(du)后3d、5d，各(ge)試驗組(zu)隨機(ji)抽取10只雞(ji)(ji)采集喉頭、泄(xie)殖腔(qiang)棉拭樣品，監(jian)測(ce)各(ge)組(zu)試驗雞(ji)(ji)的排(pai)毒(du)(du)(du)情況(kuang)，從表(biao)中可(ke)以看出rhvt-us2-h9-ha組(zu)于攻毒(du)(du)(du)后3d、5d均不排(pai)毒(du)(du)(du)，攻毒(du)(du)(du)保(bao)護(hu)(hu)率(lv)可(ke)達100％，而rhvt-us2-h9-ha2組(zu)、rhvt-us10-h9-ha組(zu)、rhvt-us2-h9-ha2組(zu)有(you)部(bu)分雞(ji)(ji)排(pai)毒(du)(du)(du)，攻毒(du)(du)(du)對照組(zu)全部(bu)排(pai)毒(du)(du)(du)，保(bao)護(hu)(hu)率(lv)為0。

每組(zu)隨機挑選10羽spf雞，從1日齡開(kai)始(shi)，每隔7天采血(xue)，分離血(xue)清(qing)用(yong)于血(xue)凝抑制(zhi)試驗抗體(ti)效(xiao)(xiao)價的測定；通(tong)過抗體(ti)效(xiao)(xiao)價的監測來揭示雞群免(mian)疫重組(zu)疫苗后外源基因(yin)在體(ti)內的表達水平。

免疫(yi)評價結果(guo)表明，在hvt基(ji)因組的(de)us2區，構建的(de)表達ha基(ji)因完整開放閱讀框的(de)重組hvt可以提供(gong)更好的(de)免疫(yi)保護效果(guo)。

2.9重組病毒在體外生(sheng)長特性評價

將hvt親(qin)本毒(du)(du)(fc126株)、表(biao)(biao)達禽(qin)流感(gan)ha基(ji)(ji)因(yin)的(de)(de)(de)重(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)病(bing)(bing)毒(du)(du)(保(bao)藏編號為cctccno:v201707的(de)(de)(de)重(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)病(bing)(bing)毒(du)(du)rhvt-us2-h9-ha、rhvt-us10-h9-ha、rhvt-us2-h9-ha2、rhvt-us10-h9-ha2)以100pfu的(de)(de)(de)毒(du)(du)量接種(zhong)于(yu)長(chang)滿(man)單層細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)35mmdish中，37℃，5％co2條件下培(pei)養(yang)(yang)，分別(bie)在(zai)病(bing)(bing)毒(du)(du)感(gan)染的(de)(de)(de)不(bu)同(tong)時間點(0h，24h，48h，72h，84h和(he)96h)用胰(yi)酶消化法(fa)收集(ji)細(xi)胞(bao)(bao)，檢測病(bing)(bing)毒(du)(du)滴度(du)：用m199培(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)將收集(ji)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)毒(du)(du)定(ding)容(rong)至1ml，采用有限稀釋(shi)法(fa)對病(bing)(bing)毒(du)(du)液(ye)進(jin)行(xing)10倍連續稀釋(shi)，設置6個(ge)稀釋(shi)度(du)；分別(bie)接種(zhong)于(yu)長(chang)滿(man)單層細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)24孔培(pei)養(yang)(yang)板中，每個(ge)稀釋(shi)度(du)做3個(ge)重(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)復；96h后顯微鏡下觀(guan)察細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)(yang)板，計(ji)算(suan)不(bu)同(tong)時間點的(de)(de)(de)病(bing)(bing)毒(du)(du)滴度(du)，從而(er)繪制出hvt和(he)重(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)病(bing)(bing)毒(du)(du)在(zai)cef上(shang)的(de)(de)(de)生(sheng)長(chang)曲線(圖8)。結果表(biao)(biao)明，在(zai)us2區構建表(biao)(biao)達完整ha基(ji)(ji)因(yin)開放閱讀框(kuang)的(de)(de)(de)重(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)組(zu)病(bing)(bing)毒(du)(du)rhvt-h9-ha具有更好的(de)(de)(de)體(ti)外生(sheng)長(chang)特性。

sequencelisting

<110>揚(yang)州大學(xue)青(qing)島易邦生物工程有限公(gong)司

<120>一(yi)種(zhong)表達h9亞型禽流感病毒ha基因的重組火(huo)雞皰(pao)疹病毒株

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.5

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<211>1683

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<213>1

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