專利名稱：：起搏通道基因亞型hcn2重組慢病毒載體的構建方法
技術領域：
：本發明涉及一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構建方法。技術背景哺乳動物基因組編碼四種HCN基因，分別命名為HCN1HCN4。這四種異構體在心臟中均已發現，但不同種屬、不同心臟組織和發育不同階段這些異構體的表達存在差異不同種屬成年動物竇房結均優勢表達HCN4，約占竇房結總體HCN的80%。在四種異構體中HCN1，2，4是心臟中的主要部分，HCN3只在胚胎起搏細胞中有低水平表達。起搏活性小的區域(如心室肌)，HCN2的表達占優勢；而起搏活性髙的區域HCN4的表達占優勢。目前對于生物起搏的研究集中于HCN2和HCN4。目前的研究大多使用腺病毒表達系統來初步探討生物起搏的可行性；雖然此類研究也獲得了較大的成就，但由于腺病毒表達系統具有髙免疫原性，其病毒基因組游離于宿主基因組外，所以只能瞬時表達外源基因，國外體內的研究僅僅持續了3-10天，這就限制了它的發展。慢病毒是逆轉錄病毒的一種，具有逆轉錄病毒的基本結構，但也有不同于逆轉錄病毒的組份和特性，該病毒既可以感染分裂細胞又可以感染非分裂細胞；其病毒基因組可以整合于宿主基因組中，長時間、穩定表達外源基因并具有較低的免疫原性，這是其最為突出的優點。可見慢病毒可能是基因治療的最佳載體，以后的發展趨勢也許是利用慢病毒為載體，結合細胞治療和基因治療；把起搏基因HCNl-4轉到干細胞中，增加起搏細胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。而構建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎。
發明內容本發明的目的是提供一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構建方法，將帶有HCN2基因的穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2與慢病毒一起建立HCN2重組病毒載體，成為慢性心律失常的細胞治療和基因治療的基礎。本發明的技術方案是一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構建方法，包括將帶有HCN2基因的穿梭質粒與病毒系統一起建立HCN2重組病毒載體，所述穿梭質粒為pCDHl-GFP-HCN2，所述病毒為慢病毒。本發明進一步的技術方案是一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構建方法，包括將帶有HCN2基因的穿梭質粒與病毒系統一起建立HCN2重組病毒載體，所述穿梭質粒為pCDHl-GFP-HCN2，所述病毒為慢病毒；所述穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2的構建方法包括以下步驟(1)將目的片段HCN2基因從pcDNA3-HCN2中切下，連接入Pucl9質粒中，構建質粒Pucl9-HCN2;(2)將目的片段HCN2基因從質粒Pucl9-HCN2中切下，連接入pcDNA3.1A質粒中，構建質粒pCDNA3.1A-HCN2;(3)將目的片段HCN2基因從pcDNA3.1A-HCN2中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質粒中，構建穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2。所述構建方法還包括將穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2與慢病毒系統混合重組后的HCN2慢病毒載體包裝質粒共轉染293T細胞，獲得病毒液。本發明優點是慢病毒是逆轉錄病毒的一種，其既可以感染分裂細胞又可以感染非分裂細胞；其病毒基因組可以整合于宿主基因組中，長時間、穩定表達外源基因并具有較低的免疫原性。構建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎。如果把帶有起搏基因HCN2的片段重組到慢病毒中，進而再轉到干細胞中，可以增加起搏細胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。圖1為慢病毒包裝系統質粒圖譜圖2為轉染293T細胞24小時后的熒光照片(放大倍數250x);圖3為Westernblot蛋白電泳圖，轉染轉染細胞；空未轉染細胞；圖4為HCN2real-timeRT-PCR實時定量檢測結果曲線；圖5為HCN2重組慢病毒載體的構建及轉染流程示意圖；圖6a為本發明陽性克隆質粒的測序報告第一部分；圖6b為本發明續圖6a的陽性克隆質粒測序報告的第二部分。具體實施方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述實施例一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構建方法，包括將帶有HCN2基因的穿梭質粒與病毒系統一起建立HCN2重組病毒載體，所述穿梭質粒為pCDHl-GFP-HCN2，所述病毒為慢病毒將全長約3.0kb的hHCN2目的序列從pCDNA3-hHCN2質粒(我們實驗室以前構建)卸載下來，最終裝載到帶有免疫熒光蛋白的質粒pCDHl-MCS1-EF1-copGFP上，構建穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2,所述穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2的構建方法包括以下步驟(1)將目的片段HCN2基因從pcDNA3-HCN2中切下，連接入Pucl9質粒中，構建質粒Pucl9-HCN2;(2)將目的片段HCN2基因從質粒Pncl9-HCN2中切下，連接入pcDNA3.1A質粒中，構建質粒pCDNA3.1A-HCN2;(3)將目的片段HCN2基因從pcDNA3.1A-HCN2中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質粒中，構建穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2。所述構建方法還包括將穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2與慢病毒系統混合重組后的HCN2慢病毒載體包裝質粒共轉染293T細胞，獲得病毒液。具體實施例一、穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2的構建hHCN2的目的序列插入于pcDNA3載體上，插入的位點為EcoRI和XbaI,首先用EcoRI和XbaI從pCDNA3-hHCN2質粒切下目的片段連接到Pucl9載體中，再用EcoRI和HindIII從質粒Pucl9切下目的片段連接到pcDNA3.1(A)載體中，再用XbaI單酶從質粒pc隱3.1(A)雙切至ljpCDH卜MCSl-EFl-copGFP中。最終將陽性質粒送上海生工進行基因測序鑒定，觀察hHCN2基因是否插入穿梭質粒。1.準備工作pCDNA3-hHCN2、Pucl9、pcDNA3.1(A)pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質粒的抽提采用堿裂解法小量抽提質粒。首先配置以下溶液溶液I(P1)溶液II(P2)溶液III(P3)BufferPl(resuspensionbuffer)50mMTris-Cl，pH8.0:10mMEDTA;15-25。C。BufferP2(lysisbuffer)200mMNaOH,19GSDS(w/v)15-25。C。BufferP3(neutralizationbuffer)3.0M乙酸鉀(potassiumRNaseA(10mg/ml)用前煮沸IO分鐘滅活。a)抽質粒的前一晚接菌于3邁1抗性LB中，240rpm,37T搖過夜。b)倒菌液于1.5mlEP管中，12，000rpm，30秒。去上清(可以倒置紙上敲，至沉淀散開，并可以用溶液I洗一次沉淀。)c)加200ul溶液I，同時加適量RNaseA(2ul)d)加200ul溶液n,緩慢倒置6-8次，至溶液澄清。e)加200ul溶液ni，緩慢倒置6-8次，產生白色沉淀。f)12,OOOrpm離心5min，取上清，加等體積氯仿，混勻。g)12,OOOrpm離心5min,取上清，加360(0.6V)異丙醇。h)12,OOOrpm離心10分鐘，lml70W乙醇洗沉淀。i)晾干5-IO分鐘。j)無菌水30ul溶解沉淀，-2(TC保存。所得質粒于1%瓊脂糖凝膠電泳。2.開始穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2的構建(1)將目的片段從pcDNA3-HCN2中切下，連接入Pucl9質粒中，構建質粒Puc-19-訓21)對帶有目的片段的pcDNA3-HCN2和Pucl9用EcoRI和XbaI進行順序雙酶切(由于EcoRI和XbaI沒有適合的雙酶切buffer,因此采用順序酶切)a)XbaI酶切體系如下XbaI(20U/U1)1ii1NEBuffer2(10X)3u1pc畫3-HCN2/Pucl9(500ng/ixl)2u1dH20_24u1Total30u1反應條件如下37"、6小時b)將單酶切產物進行乙醇沉淀30ul酶切體系中加入3ul3M乙酸鈉(PH5.2),再加入70ul無水乙醇，—20TC沉淀30分鐘10000rpm離心IO分鐘，棄上清，沉淀進行下一步酶切反應；c)EcoRI酶切體系如下EcoRI(20U/U1)1U1NEBufferEcoRI(10X)3u1pc纖3-HCN2/Pucl9(500ng/ul)2uldH20_241Total30u1反應條件如下37'C、6小時。2)對酶切載體和目的基因片段進行凝膠電泳后回收，由于紫外線會造成堿基突變，因此在該步驟中不進行拍照，直接切膠回收，回收方法如下a)在紫外燈下，用干凈的手術刀將目的片斷條帶切下，放于干凈的1.5ml離心管中，盡量不要切到多余的凝膠；b)稱童，加三倍體積的BufferQG到離心管中，即每lOOmg凝膠加300ulBufferQG;c)將離心管放于50X:水浴中，放置10分鐘，直至凝膠完全融解，期間每兩、三分鐘晃動離心管一次；d)觀察凝膠溶液的顏色，如果為橙色或紫色，則添加5ul3M的NaAC(pH5.2);e)加100ul，即一倍凝膠體積的異丙醇于凝膠溶液中，將凝膠混合液加入到QIAquickspincolumn中，將回收柱插于2ml廢液收集管中，13,OOOrpm離心一分鐘；f)棄收集管中廢液，將回收柱插回收集管中，柱中添加0.5mlBufferQG,13,OOOrpm離心一分鐘；g)棄收集管中廢液，將回收柱插回收集管中，柱中添加0.75mlBufferPE，放置2—5分鐘，13，OOOrpm離心一分鐘；h)棄收集管中廢液，將回收柱插回收集管中，13，OOOrpm離心一分鐘；i)將回收柱取下插入干凈的1.5ml離心管中，柱中加入50ulBufferEBUOmMTris-Cl,pH8.5)到柱子中心的膜上，放置2—5分鐘，13,000rpm離心一分鐘；若想獲得更多量的回收產物，可以重復該步驟一次1.5ml離心管中則為回收產物。3)將回收的雙酶切的Pucl9和目的基因片段進行連接反應，根據Epicentre試劑盒說明書進行如下操作a)連接體系如下:線性化Pucl92ul雙酶切目的基因4ul10Xbuffer1u1ATP1u1Ligase0.7ii1dH20_1.3ix1TotallOu1b)反應條件室溫連接8分鐘；4)將連接產物轉化大腸桿菌，涂布Amp+LB平板，37C過夜培養a)取一80C保存的DH5a感受態細菌，冰浴放置5-10分鐘，使之冰中融化；b)將5ul連接產物加入感受態細菌，用移液槍緩慢混勻，冰浴放置30分鐘c)將混有連接產物的感受態細菌放入42X:水浴中，熱擊90秒，冰浴2分鐘；d)將轉化產物加入900ul的S0C培養基中，37t、150rpm搖床培養1小時；e)3，000rpm離心2分鐘，棄上清，加入200ulLB培養基重懸細菌涂布Amp+LB平板。其中根據BIOSCIENCES試劑盒說明書制備感受態細菌，過程如下a)取DH5ci甘油菌種，在LB平板中劃線，37"C培養箱中培養過夜；b)挑取一個單克隆接種入0.5邁1LB培養基中，240rpm，37T搖床培養過夜c)將過夜培養的0.5ml菌液轉移到50mlSOB培養基中，240rpm,25t!搖床培養，直至0D600在0.4-0.6之間；d)將培養細菌的錐形瓶放于冰上冷卻IO分鐘；e)將菌液轉移到滅菌的50ml離心管中，2,500Xg，4'C離心6分鐘；f)棄上清，用5ml冰上預冷的1Xwashbuffer重懸沉淀，2,500Xg,4"C離心6分鐘；g)棄上清，用5ml預冷的1Xcompetentbuffer重懸沉淀；h)小量分裝，每管100ul，快速放入液氮中；i)—80"C保存，備用。5)挑取單菌落，接種于5mlAmp+LB液體培養基中，37"C、250rpm搖床培養過夜；使用Axygen質粒抽提試劑盒提取質粒，根據Axygen試劑盒說明書質粒抽提步驟如下a)過夜培養的5ml菌液用2ml做甘油菌保，剩余3ml分兩次于一個1.5ml離心管中12,000Xg離心1分鐘，徹底去除上清；b)加入250^1BefferSl，振蕩器充分重懸細菌；c)加入250^1BefferS2,顛倒混勻4一6次；注意不能劇烈混合，否則會出現基因組DNA污染d)加入250ftlBefferS2五分鐘內加入350^1SolutionIII，輕輕顛倒混勻6—8次；e)12,000Xg,離心10分鐘；將上清轉移到Miniprep柱中，Miniprep柱插于廢液收集管中，12，000Xg離心1分鐘；注意不要吸到沉淀，否則會出現基因組DNA和蛋白質污染；f)棄收集管中的廢液，將Miniprep柱插于收集管中，加70(^1BufferW2到Miniprep柱中，12，000Xg離心1分鐘；重復該步驟一遍；g)棄收集管中的廢液，將Miniprep柱放入同一支收集管中，12，000Xg離心1分鐘徹底去除BufferW2:h)將Minipre柱放入新的干凈的1.5ml離心管中，加50nlEluent,室溫放置1分鐘后，12,000Xg離心1分鐘；離心管中的溶液即為所抽提的質粒，抽提后質粒濃度統一調整為500ng/ul。(2)將目的片段從質粒Pucl9-HCN2中切下，連接入pcDNA3.1A質粒中，構建質粒pCDNA3.1A-HCN21)對帶有目的片段的Pucl9-HCN2和pcDNA3.1A用EcoRI和Hindm進行雙酶切(由于EcoRI和Hindm沒有適合的雙酶切buffer,因此采用順序酶切)a)酶切體系如下Hindm(20U/w1)1u1國uffer2(10X)3u1Pucl9-HCN2/pCDNA3.1A(500ng/ii1)2u1dH20_23ix1Total30ii1反應條件如下37"、6小時；b)將單酶切產物進行乙醇沉淀30ul酶切體系中加入3ul3M乙酸鈉(pH5.2)，再加入70ul無水乙醇，—20'C沉淀30分鐘；10000rpm離心IO分鐘，棄上清，沉淀進行下一步酶切反應;c)EcoRI酶切體系如下EcoRI(20U/u1)1u1隱ufferEcoRI(10X)3u1pc謹3-HCN2/Pucl9(500ng/ul)2uldH20_24u1Total30u1反應條件如下37°C、6小時。2)對酶切載體和目的基因片段進行凝膠電泳后回收，由于紫外線會造成堿基突變，因此在該步驟中不進行拍照，直接切膠回收，回收方法同步驟(1)中2)項所述；3)將回收的雙酶切的pCDNA3.1A和目的基因片段進行連接反應，根據Epicentre試劑盒說明書進行如下操作a)連接體系如下線性化pCDNA3.1Alul雙酶切目的基因5ul10XbufferlulATP1U1Ligase0.7u1dH20_1.1TotallOii1b)反應條件室溫連接8分鐘。4)將連接產物轉化大腸桿菌，涂布Amp+LB平板，37匸過夜培養，方法同步驟(1)中4)項所述；5)挑取單菌落，接種于5mlAmp+LB液體培養基中，37"、250rpm搖床培養過夜；使用Axygen質粒抽提試劑盒提取質粒，方法同步驟(1)中5)項所述；(3)將目的片段從pcDNA3.1A-HCN2中切下，連接入pCDHl-MCS1-EF1-copGFP質粒中，構建質粒pCDHl-GFP-HCN21)對帶有目的片段的pcDNA3.1A-HCN2和pCDHl-MCSl-EF1-c叩GFP(以下簡寫為pCDHl-GFP)用Xbal進行單酶切a)酶切體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b)反應條件如下37'C、6小時。2)對酶切載體和目的基因片段進行凝膠電泳后回收，由于紫外線會造成堿基突變，因此在該步驟中不進行拍照，直接切膠回收，回收方法同步驟(1)中2)項所述；3)將回收的單酶切的pCDHl-GFP和目的基因片段進行連接反應，根據Epicentre試劑盒說明書進行如下操作a)連接體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b)反應條件室溫連接8分鐘。4)將連接產物轉化大腸桿菌，涂布Amp+LB平板，37'C過夜培養，方法同步驟(1)中4)項所述；5)挑取單菌落，接種于5mlAmp+LB液體培養基中，37^C、250rpm搖床培養過夜使用Axygen質粒抽提試劑盒提取質粒，方法同步驟(1)中5)項所述6)將陽性克隆質粒送上海生工測定基因序列。(4)使用Qiagen小抽試劑盒抽提pCDHl-GFP-HCN2穿梭質粒用于后續的慢病毒包裝實驗1)吸取10ul陽性克隆的菌保接種于2—5mlAmp+LB培養基中，37"、300rp邁搖床培養8小時；2)將步驟1)中培養的菌液按1/500或1/1000接種到Amp+LB中，即3-6ul菌液接種于3mlAmp+LB中，37'C、300rpm搖床培養12—16小時；3)菌液轉移至1.5ml離心管中，4"、6000Xg離心15分鐘；4)棄上清，加0.3ml含有RNaseA的BufferPl重懸細菌沉淀，振蕩、充分重懸；5)加入0.3mlBufferP2,顛倒混勻4一6次，不能振蕩混勻，以免出現基因組污染，室溫放置5分鐘；6)加入0.3ml預冷的BufferP3,顛倒混勻4一6次，冰上放置5分鐘；7)4C、20，000Xg離心10分鐘，將上清轉移至干凈的離心管中；重復該步驟一次；8)將lmlBufferQBT加入QIAGEN-tip20中，Buffer靠重力作用流過QIAGEN-tip20以平衡QIAGEN-tip20;9)將步驟7)中的上清加入到QIAGEN-tip20中，溶液靠重力作用流出，質粒DNA則結合在QIAGEN-tip20的膜上；10)用2mlBufferQC洗QIAGEN-tip20兩次；11)用500ulBufferQF將質粒從QIAGEN-tip20的膜上洗脫下來。12)取1—2ul用分光光度計測定質粒濃度，用無菌水將質粒濃度調整為0.5ug/ul，以備后續構建病毒載體實驗用。(5)將陽性克隆質粒送上海生工測序，測序結果表明，與GENEBANK目的基因序列完全相同，表明成功構建pCDHl-GFP-HCN2穿梭質粒。測序報告如圖6a和圖6b所示。二、使用穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2包裝構建起博通道基因亞型HCN2重組慢病毒實驗過程參照SBI的LentivectorExpressionSystem的操作手冊進行；慢病毒包裝系統pPACKHl-LentivectorPackagingKit(SBI)三個包裝質粒圖譜見圖l;操作流程圖如圖5所示，具體操作過程如下1.假病毒顆粒的包裝(包裝產生的假病毒顆粒中含有攜帶目的基因的穿梭質粒)1)轉染前2-3天，D-MEM完全培養基培養293T細胞株。轉染前一天，接種293T細胞到新的lOcm培養皿，接種量約為5X106,完全吹散細胞，充分混勻，使細胞均勻分布。轉染時，細胞鋪滿培養皿的50-70%:2)將2ng(濃度為500ng/ixl)攜帶目的基因的穿梭質粒pCDHl-GFT-HCN2同10ug(濃度為500ng/ul)慢病毒包裝質粒混合物混合，將混合的質粒稀釋到750ii1Opti-MEM培養基中，充分混勻，室溫孵育5分鐘；3)將60w1Lipofectamine2000TM轉染試劑稀釋到750u1Opti-MEM培養基中，輕輕地混勻，室溫孵育5分鐘；4)將稀釋的Lipofectamine2000TM試劑逐滴加入到質粒-Opti-MEM混合液中，輕輕地上下顛倒混勻，室溫孵育20分鐘；5)在第4步孵育形成轉染混合物的同時，用10mlOpti-MEM洗293T細胞一次，然后加入8.5ml含2%血清不含抗生素的D-MEM培養基；6)將第4步中產生的質粒-Lipofectamine2000TM混合物加入第5步處理后的培養皿中，輕輕地混勻使轉染復合物均勻分布在培養基中，37'C、59tC02培養箱中培養；7)6小時后，用新鮮的含抗生素和2%血清的D-MEM培養基替換掉含有轉染混合物的培養基，繼續培養48小時；8)收集轉染后24和48小時的上清液；用含2%血清不含抗生素的D-MEM培養基替換掉上清液注意觀察培養基的顏色，培養24小時后和48小時后，由于293T細胞的代謝活性，會引起培養基顏色變黃(呈酸性)；9)將含有假病毒顆粒的培養基3000rpm室溫離心5分鐘，去除細胞碎片，然后將上清用Millex-HV0.45Um的PVDF濾膜過濾過濾后的病毒液用于后續的轉染基質干細胞研究。2.將構建的慢病毒轉染293-T細胞，并將穩定轉染的細胞擴大培養，當細胞培養到足夠量時，收集細胞RNA和蛋白用于實時定量PCR鑒定和WesternBlot鑒定。3.原代細胞和穩轉細胞繼續培養兩周后行Westernblot鑒定蛋白的表達蛋白抽提方法1)從貼壁細胞培養瓶中小心傾去培養液。2)預冷的PBS清洗貼壁的細胞2次，小心傾去PBS。3)配置含抑制劑的蛋白質抽提試劑(1ml抽提試劑中加入5Pi蛋白酶抑制劑混合液，5PlPMSF和5Jil磷酸酶混合液)。4)細胞瓶中加入預冷的含抑制劑的蛋白質抽提試劑(107個細胞中加入lml抽提試劑；5X10e個細胞中加入0.5ml抽提試劑)，輕輕搖動5分鐘。5)用一預冷的橡膠和塑料細胞刮將培養瓶壁上貼壁細胞刮下來，轉移細胞懸浮液到離心管中，冰浴下搖動15分鐘進行裂解。6)裂解液于預冷的離心機中14,000Xg離心15分鐘。棄去沉淀，上清液立刻轉移入新的離心管中保存待用。使用上清液5ul上樣，凝膠蛋白電泳。4.原代細胞和穩轉細胞繼續培養兩周行real-timeRT-PCR實時熒光定量檢測1)RNA抽提TrizolRNA抽提及質量檢測方法和步驟a)勻漿轉基因細胞培養兩周后，離心沉淀細胞。加入lmlTRIZ0L試劑，使用勻漿器破碎細胞使其裂解。注意避免在加入TRIZOL試劑進行裂解前清洗細胞，因為清洗會很可能導致mRM的降解。b)兩相分離勻漿后樣品于15~30°C孵育5分鐘，以便核酸蛋白復合體完全解離。每lml的TRIZ0L試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15~30°C孵育2到3分鐘。4°C下12,000Xg離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層核上層的無色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的體積大約使勻漿時加入的TRIZ0L試劑的60先。c)RNA沉淀將水相轉移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入異丙醇的量為每個樣品勻漿時加入lmlTRIZOL試劑的此時加O.5ml的異丙醇。混勻后15~30。C孵育10分鐘后，于4°C12,000Xg離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。d)RNA清洗移去上清液，每lmlTRIZ0L試劑勾漿的樣品中加入至少1ml的7596乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，4°C7,500Xg離心5分鐘。e)重新溶解RNA沉淀去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5~10分鐘，切勿真空離心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否則將大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RM樣品A260/280比值將小于1.6。f)變性瓊脂糖凝膠電泳i)制膠1g瓊脂糖溶于72邁l水中，冷卻至60°C,10ml的10XMOPS電泳緩沖液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。10XMOPS電泳緩沖液濃度_成分0.4MMOPS,pH7.00.1M乙酸鈉0.01MEDTA灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25H1溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的lXMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。ii)準備RNA樣品取3PgRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10Pg/ml。加熱至70°C孵育15分鐘使樣品變性。iii)電泳上樣于膠孔中，5-6V/cm電壓下電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3cm。2)以提取的RNA為模板合成cDNA:a)配制退火混合物RNA3[ig0.5ug/ulOligo(dT)18lPl加無RNA酶的&0至總體積10Jil混合液在70t:水浴3分鐘，降到37'C放置IO分鐘。b)RT反應液5XRT緩沖液4Jil2.5mMdNTP混合液4mRNA酶抑制劑1JilMMLV反轉錄酶1fil混合后37"恒溫1分鐘c)加10W的RT反應液到10jxl退火混合物中，37C水浴60分鐘，加熱到95X:維持5min。得RT終溶液即為cDNA溶液，置冰浴待用。3)合成的cDNA用于實時定量PCRa)制備用于繪制標準曲線的梯度稀釋DNA模板i)針對每一需要測量的基因和管家基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應d證(2.5mMeach)2.10XPCR緩沖液2.5PiMgCl2溶液1.5MllimitslOuM的PCR特異引物F1H1lOuM的PCR特異引物Rlnic函1Ml加水至總體積為25JU輕彈管底將溶液混合，40個PCR循環(94'C，20秒；退火溫度，20秒；721C,30秒)；72°C延伸5分鐘。ii)PCR產物與100bpDNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。iii)將PCR產物進行IO倍梯度稀釋設定PCR產物濃度為1,分別稀釋為1Xl(T1，1Xl(T2，1X10—3,1X10",1X10—5,1X10—6，1X10—7這幾個梯度濃度的DNA。4)進行RealtimePCR反應a)幾個梯度稀釋的DM模板以及所有cDNA樣品分別配置RealtimePCR反應體系。體系配置如下dNTP(2.5mMeach)2.5^110XPCR緩沖液2.5HiMgCl2溶液1.5M1rag聚合酶lunitsSybergreenI終濃度O.25XlOuM的PCR特異引物FlUllOuM的PCR特異引物R1^1cDNAorDNA1Ml加水至總體積為25PI輕彈管底將溶液混合，5000rpm短暫離心。b)步驟1配置的PCR反應溶液置于RealtimePCR儀上進行PCR反應。GAPDH:95C5min;35個PCR循環(95'C,10秒；58^C，15秒；20秒；85"C(收集熒光)，5秒)。為了建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束后繼續從72"C緩慢加熱到99^C(每5秒升高ir);HCN2:95'C，5min:35個PCR循環(95t!，10秒；58'C，15秒；72t!,20秒；85'C(收集熒光)，5秒)。為了建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束后繼續從72C緩慢加熱到99^(每5秒升高1X:)。表l實時定量PCR使用引物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>5.結果(1)將帶有目的基因的穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2同慢病毒包裝質粒混合物混合后感染293T細胞后，培養24小時，可以發現大量的熒光出現，如圖2所示。(2)提取蛋白后進行Westernblot的蛋白鑒定結果如圖3所示。(3)各樣品的目的基因和管家基因分別進行RealtimePCR反應。根據繪制的梯度稀釋DNA標準曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結果直接由機器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。標準曲線法的相對定量(見圖4)此方法中量的表達是相對于某個參照物的量而言的，對于所用的標準品只要知道其相對稀釋度即可。在整個實驗中樣本的耙序列的量來自于標準曲線，最終必須除以參照物(對照組)的量，即參照物(對照組)是1倍的樣本，其它的樣本為參照物量的n倍。實時定量PCR時各樣品加樣量均為1然而由于受RNA濃度定量誤差和RNA逆轉錄效率誤差等的影響，每個樣品的1W體積的cDNA其含量并不完全相同，為校正此差異，我們使用管家基因GAPDH(不同樣品間表達量基本恒定)作為內參，以樣品待測基因得值除以此樣品內參得值，最終得到的比值為樣品的待測基因相對含量。待測基因以內參校正。結果顯示穩轉細胞的RNA是原代細胞的123倍。表2內參校正列表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>HCN2real-timePCR實時定量檢測如圖4所示。以上結果表明已成功構建起博通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體。慢病毒是逆轉錄病毒的一種，其既可以感染分裂細胞又可以感染非分裂細胞；其病毒基因組可以整合于宿主基因組中，長時間、穩定表達外源基因并具有較低的免疫原性。構建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎。如果把帶有起搏基因HCN2的片段重組到慢病毒中，進而再轉到干細胞中，可以增加起搏細胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。權利要求1.一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構建方法，包括將帶有HCN2基因的穿梭質粒與病毒系統一起建立HCN2重組病毒載體，其特征在于所述穿梭質粒為pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒為慢病毒。2.根據權利要求1所述的起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構建方法，其特征在于所述穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2的構建方法包括以下步驟(1)將目的片段HCN2基因從pcDNA3-HCN2中切下，連接入Pucl9質粒中，構建質粒Pucl9-HCN2;(2)將目的片段HCN2基因從質粒Pucl9-HCN2中切下，連接入pcDNA3.1A質粒中，構建質粒pCDNA3.1A-HCN2;(3)將目的片段HCN2基因從pcDNA3.1A-HCN2中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質粒中，構建穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2。3.根據權利要求1所述的起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構建方法，其特征在于所述構建方法還包括將穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN2與慢病毒系統混合重組后的HCN2慢病毒載體包裝質粒共轉染293T細胞，獲得病毒液。全文摘要本發明公開了一種起搏通道基因亞型HCN2重組慢病毒載體的構建方法，包括將帶有HCN2基因的穿梭質粒與病毒系統一起建立HCN2重組病毒載體，所述穿梭質粒為pCDH1-GFP-HCN2，所述病毒為慢病毒。本發明將帶有HCN2基因的穿梭質粒pCDH1-GFP-HCN2與慢病毒一起建立HCN2重組病毒載體，成為慢性心律失常的細胞治療和基因治療的基礎。文檔編號C12N15/12GK101265484SQ20081002378公開日2008年9月17日申請日期2008年4月18日優先權日2008年4月18日發明者周亞峰,李紅霞,楊向軍,蔣文平,韓蓮花申請人:蘇州大學附屬第一醫院