分泌鴨1型甲肝病毒亞型單克隆抗體的雜交瘤細胞株的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及于鴨1型甲肝病毒亞型的病原學領域，尤其涉及一種分泌鴨1型甲肝病毒亞型單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用。
【背景技術】
[0002]鴨1 型甲肝病毒(duck hepatitis A virus 1，DHAV-1)是小 RNA 病毒科(Pacornaviridae)禽肝病毒屬(的成員之一，主要侵害6周齡左右的雛鴨，以發病急、病程短、致死率高和病死鴨呈角弓反張等為臨床癥狀，以肝臟腫大和出血為肉眼病變特征。
[0003]2005年Gu6rin等自表現胰腺炎和腦炎的番鴨中分離到鴨1型甲肝病毒，而發病鴨肝臟未出現腫大出血病變。
[0004]2011年9月，我國的福建、浙江、上海、廣東等省份相繼出現10-30日齡雛番鴨、半番鴨以胰腺泛黃、出血(俗稱胰腺炎)為特征的疫病，其發病率和病死率分別達10%-30%、25%-40%。
[0005]本研究室對患該病的雛番鴨病例開展了病原學研究，并對已分離到的病毒進行蝕斑純化、形態特征、全基因組測序與分析、生物學及理化學特性和動物致病性試驗等一系列相關研究，結果發現該病毒粒子呈球形、直徑為30-40 nm ;其全基因組序列與DHAV-1參考毒株核苷酸序列和氨基酸同源性分別介于93.5%-99.6%和97.9%_99.6%之間，結構蛋白VP1基因與經典肝炎型的DHAV-1 基因序列同源性較高；其致病性與經典肝炎型的鴨1型甲肝病毒存在明顯差異，主要引起胰腺出血、發黃。綜合以上研究確定其病原為胰腺炎型鴨1型甲肝病毒，即胰腺炎型DHAV-1。
[0006]但經鴨胚交叉中和試驗測定發現，胰腺炎型DHAV-1與肝炎型DHAV-1的抗原相關R值為0.62，處于0.32-0.7之間，表明胰腺炎型DHAV-1屬于鴨1型甲肝病毒的亞型，即DHAV-lao
[0007]而近年來，新發現的鴨1型甲肝病毒的亞型給我國水禽疫病的防控帶來更大的難度。
[0008]然而，目前還沒有單克隆抗體用于鴨1型甲肝病毒的亞型檢測。

【發明內容】

[0009]本發明要解決的技術問題是為了解決現沒有鴨1型甲肝病毒的亞型單克隆抗體，未能用于鴨1型甲肝病毒的亞型檢測及治療的問題，而提供了一種鴨1型甲肝病毒的亞型單克隆抗體的制備方法和一種分泌鴨1型甲肝病毒亞型的單克隆抗體的雜交瘤細胞株1A2 ;其保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；
分類命名:抗鴨1型甲肝病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株；
保藏日期為:2015年4月10日； 保藏號為:CGMCC N0.10420 ；
以及采用權利1所屬的菌株制備的鴨1型甲肝病毒亞型抗體檢測試劑。
[0010]鴨1型甲肝病毒的亞型單克隆的制備方法按以下步驟實現:
一、免疫原的制備
即鴨1型甲肝病毒亞型滅活后進行超速離心純化，作為免疫抗原。利用鴨成纖維細胞繁殖500mL鴨1型甲肝病毒亞型，收集細胞培養液，離心去除細胞沉淀后，以濃度為0.3%的甲醛進行滅活，而后添加適量的氯仿進行過夜處理，經lOOOOrpm離心15min，收集上清，接著25000rpm離心lh去除沉淀后再40000rpm離心3h收集沉淀即可獲得較高純度的免疫原。
[0011]二、動物免疫
取體重為10~12g的12周齡的SPF雌性BALB/C小鼠5只進行免疫；首次免疫用鴨1型甲肝病毒亞型與等量弗氏完全佐劑混合，混勻振蕩器乳化完全后，以lOOPg/只的劑量進行背部皮下多點注射，每間隔2周換用鴨1型甲肝病毒亞型與等量弗氏不完全佐劑進行加強免疫，第三次免疫后，采集血清測定血清效價，加強免疫直至血清效價達到1:100000為止；在融合前三天以lOOPg的VP1蛋白進行強化免疫。
[0012]三.雜交瘤細胞株的建立
1、骨髓瘤細胞懸液的制備
融合前48h，將SP2/0骨髓瘤細胞擴大培養于直徑為9cm的細胞培養皿中，每塊加10mL含10%血清DMEM培養液，置于37°C、5% C02培養箱中培養；融合當天，選擇形態良好、呈對數生長的SP2/0細胞，將其從瓶壁上輕輕吹下，收集于50 mL離心管內，1000r/min離心5min，棄上清；用不完全DMEM培養液混勻細胞后計數，取所需細胞數，用不完全DMEM培養液洗2次，以10mL不完全DMEM培養液重新懸浮備用。
[0013]2、飼養細胞的制備
在融合前2d，取1只健康未免疫6周齡的雌性BALB/c小鼠，拉頸脫臼處死，將小鼠尸體于75%酒精中浸泡消毒5min，隨即移入無菌操作臺內，腹部朝上固定在解剖板上；在小鼠左側腹壁剪一小口，撕開皮膚，用滅菌鑷子提起腹膜，剪開左側腹膜及肋骨，暴露脾臟，換用另一套滅菌器械，用鑷子提起脾臟，取出脾臟置于滅菌的平皿中，用不完全DMEM培養液輕輕洗3次，并剝去周圍的結締組織；將脾臟移入另一滅菌平皿中，置于200目銅網上，用滅菌的西林瓶底部擠壓研磨脾臟，并用不完全DMEM培養液輕輕沖洗銅網，使脾細胞全部通過銅網壓擠到溶液中；將脾細胞溶液轉至50mL離心管中，加不完全培養液至20mL，混勻；1000r/min離心5min，棄上清；沉淀細胞再用不完全DMEM培養液同法離心洗滌一次；先用5mL HAT培養液將沉淀細胞懸浮并混勻，作細胞計數，然后根據細胞計數結果，補加HAT培養液至30mL，使細胞濃度為2 X 105個/mL ;將細胞懸液滴于6塊96孔細胞培養板中，每孔50 μ L，然后將培養板置37°C、含5%C02培養箱內培養24h后觀察細胞生長狀態，細胞呈多形性，貝占壁，折光性好時即可使用。
[0014]3、免疫淋巴細胞與SP2/0骨髓瘤細胞的融合
取加強免疫3 d后的BABL/c小鼠，摘除眼球采血；按照上述的操作方法制備脾細胞懸液；將骨髓瘤細胞與脾細胞按1:10的比例混合在一起，轉入50mL離心管內，1000r/min離心lOmin，棄上清，用滴管吸凈殘留液體；用滴管輕輕攪動沉淀，使其松散均勻成糊狀；在37°C水浴中融合:一手均勻地轉動離心管，另一手用吸管吸取PEG4000溶液lmL，并沿轉動的管壁(盡量接近細胞處)加入，從加入到加完的時間控制在lmin左右，邊加邊攪動，用吸管在lmin內加入lmL預熱至37°C不完全DMEM培養液，重復3次，往后每分鐘加入3mL，直至加滿到25mL為止(注意此時操作應輕柔，邊轉動邊加，盡量不攪散細胞);37°C培養箱靜置lOmin，800r/min離心lOmin，棄上清；加入10mL HAT培養液，輕輕吹吸混勻；根據所用96孔培養板的數量，按一塊96孔培養板用液15mL計算補加HAT培養液至所需的量；將融合好的細胞懸液加入含有飼養細胞的96孔板，每孔150μ? (相當于3滴)，37°C、5%C02培養箱內培養。
[0015]4、雜交瘤細胞的選擇性培養及觀察
將融合后的細胞懸浮于HAT培養液中，置于37 °C、5%C02的培養箱內培養。根據情況，每5d半換液1次，第lid改換同量的HT培養液，維持2周。仔細觀察融合細胞的生長情況，凡有污染的孔立即滴加1%的NaOH，以免污染擴散，如果細胞生長太慢可補加1次飼養細胞。細胞融合后的3d內不提倡在C02培養箱外長時間的觀察，因為培養箱外溫度和C0 2濃度的不適會影響融合細胞的生長。
[0016]5、陽性雜交瘤細胞的篩選
待融合后的細胞克隆生長到覆蓋細胞孔底部1/10時，用間接ELISA方法對所有有克隆生長的培養上清進行檢測，檢測為陽性的細胞進行克隆并擴大培養，選出陽性和特異性最強的孔進行克隆，并注意隨時凍存保種。用間接ELISA方法和系列稀釋法進行篩選，經過4次亞克隆，直至所有克隆化細胞檢測