H9亞型禽流感病毒和h6亞型禽流感病毒的二重rt-pcr試劑盒及其應用
【專利摘要】本發明公開了用于鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的引物對組。利用本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的引物對組建立的二重RT?PCR，可準確鑒定H9亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒，且特異性好，靈敏度高，對H9亞型禽流感病毒和H6亞型AIV的最小檢出限均達到5×104拷貝。因此，本發明所提供的引物對組可同時檢測H9亞型AIV和H6亞型AIV，具有重要的應用價值。
【專利說明】
H9亞型禽流感病毒和化亞型禽流感病毒的二重RT-PCR試劑盒 及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體設及一種朋亞型禽流感病毒和H6亞型禽流感病毒 的二重RT-PCR試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)屬于正黏病毒科，A型流感病毒屬。目 前的研究表明，AIV根據其表面的血凝素蛋白Wemagg Iut in in, HA)和神經氨酸酶蛋白 (化uraminidase，NA)抗原的差異可W劃分為16種HA亞型化1~H16)和9種NA亞型（NI~N9)。 另外，根據病毒對雞致病性的強弱又可將其分為低致病性禽流感病毒化OW pathogenic avian influenza,LPAIV)和高致病性禽流感病毒巧ighly pa1:hogenic avian influenza, HPAIV)。長期W來，因為LPAIV造成的家禽損失較小而往往被人們忽視和輕視。近年來的研 究表明，LPAIV可W通過基因重組進而造成人類流感的大流行，其中朋亞型AIV和H6亞型AIV 就是運類LPAIV中最重要的兩個亞型之一。研究表明近年來新出現的可感染人的H7N9、 化0N8、H6N1和冊N6亞型流感病毒的部分基因來自于朋N2亞型AIVd1997年香港地區發現的 感染人的高致病性冊Nl亞型AIV的7個基因來源于H6亞型AIV，運說明低致病性冊亞型AIV有 可能為冊亞型HPAIV提供內部基因。2013年5月，臺灣地區發現了首例冊Nl亞型AIV直接感染 人的案例。另外，血清學抗體調查表明朋亞型AIV和H6亞型AIV都可W感染人。因此，朋亞型 AIV和冊亞型AIV對人類公共衛生安全具有重要意義，引起了廣泛的關注。
[0003] 病毒分離鑒定是AIV檢測的一種經典的方法，但該方法存在檢測周期較長的缺點。 目前檢測AIV的方法主要是血清學和分子生物學方法，而血清學方法則需要標準陽性血清， 具有一定的局限性。分子生物學檢測方法具有快速準確等優點，特別是多重PCR具有操作簡 便，特異性高，敏感性好，省時省力等特點而得到了廣泛的應用。
[0004] 研究表明，H6亞型AIV和朋亞型AIV在家禽中比較常見且有混合感染的情況存在。 H9亞型AIV和冊亞型AIV混合感染具有相似的臨床癥狀且傳統的檢測方法費時，難W及時準 確的得到診斷結果。因此，建立一種可同時檢測朋亞型AIV和冊亞型AIV的檢測方法，不僅可 W快速準確的鑒別兩種亞型禽流感病毒，也為感染人的禽流感亞型的監測提供技術支撐， 具有重要的公共衛生意義。

【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是如何鑒定或輔助鑒定朋亞型禽流感病毒和/或冊亞 型禽流感病毒。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明首先提供了用于鑒定或輔助鑒定朋亞型禽流感病毒 和/或冊亞型禽流感病毒的引物對組。
[0007] 本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定朋亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒 的引物對組，可由特異引物對甲和特異引物對乙組成。
[0008] 所述特異引物對甲，可由用于擴增特異DNA片段甲的兩條引物組成。所述特異DNA 片段甲中具有H9亞型禽流感病毒基因組中引物H9-F和引物H9-R組成的引物對的祀序列。
[0009] 所述引物H9-F可為如下al)或曰2):
[0010] al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；
[0011] a2)將序列1經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相 同功能的單鏈DNA分子。
[001^ 所述引物冊-R可為如下日3)或曰4):
[OOU]日3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；
[0014] a4)將序列2經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相 同功能的單鏈DNA分子。
[0015] 所述特異引物對乙，可由用于擴增特異DNA片段乙的兩條引物組成。所述特異DNA 片段乙中具有冊亞型禽流感病毒基因組中引物冊-F和引物冊-R組成的引物對的祀序列。
[0016] 所述引物冊-F可為如下bl)或b2):
[0017] bl)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；
[0018] b2)將序列3經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相 同功能的單鏈DNA分子。
[0019] 所述引物冊-R可為如下b3)或b4):
[0020] b3)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；
[0021] b4)將序列4經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相 同功能的單鏈DNA分子。
[0022] 上述引物對組中，所述特異引物對甲可由所述引物朋-F和所述引物H9-R組成；所 述特異引物對乙可由所述引物冊-F和所述引物冊-R組成。
[0023] 上述引物對組中，所述引物H9-F、所述引物朋-R、所述引物H6-F和所述引物H6-R的 摩爾比具體可為5:5:8:8。
[0024] 上述任一所述引物對組的應用，可為如下Cl)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)或c7):
[0025] cl)制備用于鑒定或輔助鑒定朋亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的試劑 盒；
[00%] c2)鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和/或冊亞型禽流感病毒；
[0027] c3)鑒定或輔助鑒定待測病毒是否為候選的H9亞型禽流感病毒或候選的H6亞型禽 流感病毒；
[00%] c4)制備用于鑒別H9亞型禽流感病毒和冊亞型禽流感病毒的試劑盒；
[0029] c5)鑒別H9亞型禽流感病毒和冊亞型禽流感病毒；
[0030] c6)制備用于檢測待測樣本中是否含有朋亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病 毒的試劑盒；
[0031] c7)檢測待測樣本中是否含有H9亞型禽流感病毒和/或冊亞型禽流感病毒。
[0032] 含有上述任一所述引物對組的試劑盒也屬于本發明的保護范圍；含有上述任一所 述引物對組的試劑盒的功能可為如下c2)或c3)或。5)或扣）：
[0033] c2)鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和/或冊亞型禽流感病毒；
[0034] c3)鑒定或輔助鑒定待測病毒是否為候選的H9亞型禽流感病毒或候選的H6亞型禽 流感病毒；
[0035] c5)鑒別H9亞型禽流感病毒和冊亞型禽流感病毒；
[0036] c7)檢測待測樣本中是否含有H9亞型禽流感病毒和/或冊亞型禽流感病毒。
[0037] 含有上述任一所述引物對組的試劑盒的制備方法也屬于本發明的保護范圍；含有 上述任一所述引物對組的試劑盒的制備方法，具體可為如下（I)或（n):
[0038] (I)上述任一所述引物對組中各引物對的各條引物分別單獨包裝；
[0039] (n)上述任一所述引物對組中各引物對的各條引物按比例混合在一起。
[0040] 所述（H)中，所述"各條引物按比例混合"具體可為所述引物朋-F、所述引物朋-R、 所述引物冊-F和所述引物冊-R的摩爾比為5:5:8:8。
[0041] 為解決上述技術問題，本發明還提供了一種鑒定待測RNA病毒是否為候選的朋亞 型禽流感病毒或冊亞型禽流感病毒的方法。
[0042] 本發明所提供的鑒定待測RNA病毒是否為候選的H9亞型禽流感病毒或冊亞型禽流 感病毒的方法，可包括如下步驟ql)或q2):
[0043] ql)提取待測RNA病毒的RNA，采用上述任一所述引物對組進行RT-PCR擴增，得到 RT-PCR擴增產物，然后進行如下判斷:如果所述RT-PCR擴增產物中含有序列表中序列5自5/ 末端起第1051至1601位所示的DNA區段，則所述待測RNA病毒為或候選為的H9亞型禽流感病 毒;如果所述RT-PCR擴增產物中含有序列表中序列6自5/末端起第1442至1663位所示的DNA 區段，則所述待測RNA病毒為或候選為的冊亞型禽流感病毒;如果所述RT-PCR擴增產物中不 含有序列表中序列5自5/末端起第1051至1601位所示的DNA區段且不含有序列表中序列6自 5/末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待測RNA病毒不為或候選不為朋亞型禽流 感病毒或冊亞型禽流感病毒；
[0044] q2)檢測待測RNA病毒的CDNA中是否含有序列表中序列5自5/末端起第1051至1601 位所示的DNA區段或序列表中序列6自5/末端起第1442至1663位所示的DNA區段，然后進行 如下判斷：如果所述CDNA中含有序列表中序列5自5/末端起第1051至1601位所示的DNA區 段，則所述待測RNA病毒為或候選為的H9亞型禽流感病毒;如果所述CDNA中含有序列表中序 列6自5/末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待測RNA病毒為或候選為的H6亞型 禽流感病毒;如果所述CDNA中不含有序列表中序列5自5/末端起第1051至1601位所示的DNA 區段且不含有序列表中序列6自5/末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待測RNA 病毒不為或候選不為H9亞型禽流感病毒或冊亞型禽流感病毒。
[0045] 為解決上述技術問題，本發明還提供了一種鑒別朋亞型禽流感病毒和冊亞型禽流 感病毒的方法。
[0046] 本發明所提供的鑒別朋亞型禽流感病毒和冊亞型禽流感病毒的方法，可包括如下 步驟si)或s2):
[0047] S1)提取待測病毒的RNA，采用上述任一所述引物對組進行RT-PCR擴增，得到RT-PCR擴增產物，然后進行如下判斷：如果所述RT-PCR擴增產物中含有序列表中序列5自5/末 端起第1051至1601位所示的DNA區段，則所述待測病毒為朋亞型禽流感病毒；如果所述RT-PCR擴增產物中含有序列表中序列6自5/末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待 測病毒為冊亞型禽流感病毒;所述待測病毒為H9亞型禽流感病毒或冊亞型禽流感病毒；
[004引s2)檢測待測病毒的CDNA中是否含有序列表中序列5自5/末端起第1051至1601位 所示的DNA區段或序列表中序列6自5/末端起第1442至1663位所示的DNA區段，然后進行如 下判斷：如果所述CDNA中含有序列表中序列5自5/末端起第1051至1601位所示的DNA區段， 則所述待測病毒為H9亞型禽流感病毒；如果所述CDNA中含有序列表中序列6自5/末端起第 1442至1663位所示的DNA區段，則所述待測病毒為冊亞型禽流感病毒;所述待測病毒為朋亞 型禽流感病毒或冊亞型禽流感病毒。
[0049] 為解決上述技術問題，本發明還提供了一種檢測待測樣本中是否含有H9亞型禽流 感病毒和/或冊亞型禽流感病毒的方法。
[0050] 本發明所提供的檢測待測樣本中是否含有朋亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感 病毒的方法，可包括如下步驟tl)或t2):
[0化1 ] 11)提取待測樣本的總RNA，采用上述任一所述引物對組進行RT-PCR擴增，得到RT- PCR擴增產物，然后進行如下判斷：如果所述RT-PCR擴增產物中含有序列表中序列5自5/末 端起第1051至1601位所示的DNA區段，則所述待測樣本中含有或候選含有朋亞型禽流感病 毒;如果所述RT-PCR擴增產物中含有序列表中序列6自5/末端起第1442至1663位所示的DNA 區段，則所述待測樣本中含有或候選含有H6亞型禽流感病毒；如果所述RT-PCR擴增產物中 不含有序列表中序列5自5/末端起第1051至1601位所示的DNA區段且不含有序列表中序列6 自5/末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待測樣本中不含有或候選不含有朋亞 型禽流感病毒或冊亞型禽流感病毒；
[0052] t2)檢測待測樣本的CDNA中是否含有序列表中序列5自5/末端起第1051至1601位 所示的DNA區段或序列表中序列6自5/末端起第1442至1663位所示的DNA區段，然后進行如 下判斷：如果所述CDNA中含有序列表中序列5自5/末端起第1051至1601位所示的DNA區段， 則所述待測樣本中含有或候選含有H9亞型禽流感病毒;如果所述cDNA中含有序列表中序列 6自5/末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待測樣本中含有或候選含有冊亞型禽 流感病毒;如果所述CDNA中不含有序列表中序列5自5/末端起第1051至1601位所示的DNA區 段且不含有序列表中序列6自5/末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待測樣本中 不含有或候選不含有H9亞型禽流感病毒或冊亞型禽流感病毒。
[0053] 為解決上述技術問題，本發明還提供了用于鑒定或輔助鑒定朋亞型禽流感病毒的 特異引物對甲或用于鑒定或輔助鑒定冊亞型禽流感病毒的特異引物對乙。
[0054] 所述特異引物對甲可由用于擴增特異DNA片段甲的兩條引物組成。所述特異DNA片 段甲中具有H9亞型禽流感病毒基因組中引物H9-F和引物H9-R組成的引物對的祀序列。 [0化5] 所述引物H9-F可為如下al)或曰2):
[0056] al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；
[0057] a2)將序列1經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相 同功能的單鏈DNA分子。
[005引所述引物H9-R可為如下曰3)或曰4):
[0059] a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；
[0060] a4)將序列2經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相 同功能的單鏈DNA分子。
[0061] 所述特異引物對乙可由用于擴增特異DNA片段乙的兩條引物組成。所述特異DNA片 段乙中具有冊亞型禽流感病毒基因組中引物冊-F和引物冊-R組成的引物對的祀序列。
[0062] 所述引物冊-F可為如下bl)或b2):
[0063] bl)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；
[0064] b2)將序列3經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相 同功能的單鏈DNA分子。
[0065] 所述引物冊-R可為如下b3)或b4):
[0066] b3)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；
[0067] b4)將序列4經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相 同功能的單鏈DNA分子。
[0068] 所述特異引物對甲具體可由所述引物H9-F和所述引物H9-R組成。
[0069] 所述特異引物對乙具體可由所述引物冊-F和所述引物冊-R組成。
[0070] 所述特異引物對甲中所述引物H9-F、所述引物H9-R的摩爾比具體可為1:1。
[0071] 所述特異引物對乙中所述引物冊-F、所述引物冊-R的摩爾比具體可為1:1。
[0072] fl)所述特異引物對甲的應用也屬于本發明的保護范圍；所述特異引物對甲的應 用可為如下dl)或d2)或d3):
[0073] dl)制備用于檢測或輔助檢測H9亞型禽流感病毒的試劑盒；
[0074] d2)鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒；
[0075] d3)鑒定或輔助鑒定待測病毒是否為候選的H9亞型禽流感病毒；
[0076] f2)所述特異引物對乙的應用也屬于本發明的保護范圍；所述特異引物對乙的應 用可為如下el)或e2)或e3):
[0077] el)制備用于檢測或輔助檢測冊亞型禽流感病毒的試劑盒；
[0078] e2)鑒定或輔助鑒定冊亞型禽流感病毒；
[0079] e3)鑒定或輔助鑒定待測病毒是否為候選的冊亞型禽流感病毒。
[0080] 含有所述特異引物對甲的試劑盒甲或含有所述特異引物對乙的試劑盒乙也屬于 本發明的保護范圍。
[0081] 所述試劑盒甲的功能可為如下d2)或d3):
[0082] d2)鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒；
[0083] d3)鑒定或輔助鑒定待測病毒是否為候選的H9亞型禽流感病毒。
[0084] 所述試劑盒乙的功能為如下e2)或e3):
[0085] e2)鑒定或輔助鑒定冊亞型禽流感病毒；
[0086] e3)鑒定或輔助鑒定待測病毒是否為候選的冊亞型禽流感病毒。
[0087] 本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定朋亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒 的引物對組建立的二重RT-PC的反應體系（2扣L)為：2XhansTaq-T PCR SuperMixl2.5化， 朋-F(濃度為25pmolAiL)和朋-R(濃度為25pmolAiL)各0.扣L，H6-F(濃度為25pmolAiL)和 H6-R(濃度為25pmol/iiL)各0.祉L，模板化UDNA濃度至少為IOOfgAiLW上），用去離子水補 至25化。反應程序為:95°C變性5min;95°C變性1111111，53°(：退火3〇3,72°(：延伸3〇3，共35個循 環;最后72°C延伸lOmin，于4°C保存。
[008引上述任一所述H6亞型禽流感病毒具體可為H6N8亞型禽流感病毒、A/Duck/ Guangx i/GXd-5/2010(冊NI)或A/Duck/Guangx i/Gxd-3/2009(冊N2)。
[0089] 上述任一所述H9亞型禽流感病毒具體可為A/tu;rtledove/Guangxi/49B6/2013 (H9N2)〇
[0090] 實驗證明，利用本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和/或H6 亞型禽流感病毒的引物對組建立的二重RT-PCR，可準確鑒定朋亞型AIV和/或冊亞型AIV，且 特異性好，靈敏度高，對朋亞型AIV和H6亞型AIV的最小檢出限均達到5 X IO4拷貝。因此，本 發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定朋亞型禽流感病毒和/或冊亞型禽流感病毒的引物對組 可同時檢測H9亞型AIV和冊亞型AIV，具有重要的應用價值。
【附圖說明】
[0091] 圖1為二重RT-PCR的特異性試驗結果電泳圖。
[0092] 圖2為二重RT-PCR的靈敏度試驗結果電泳圖。
[0093] 圖3為二重RT-PCR對臨床樣本檢測結果電泳圖。
【具體實施方式】
[0094] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[00M]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0096] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0097] W下實施例中的定量試驗，均設置=次重復實驗，結果取平均值。
[009引 SPF雞胚為北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司產品。MLV反轉錄酶、dNTP和RNA 酶抑制劑、DNA Marker DL2000、PMD18-T載體均為I^KaRa公司產品。DNA/RNA抽提試劑盒、2 XTransTaq-T PCR SuperMix、膠回收試劑盒和質粒抽提試劑盒均為北京全式金生物技術 有限公司產品。
[0099] A/Sparrow/加 angxi/GXs-1/2012化1N2)記載在如下文獻中：郭捷，謝芝勵，彭宜 等.一株鳥源化N2型禽流感病毒全基因序列分析[J].中國獸醫學報，2014,34(6) :874-820. 公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得，W重復本實驗。在下文中，A/Sparrow/Guangxi/ GXs-1/2012 化 1N2)簡稱 H1N2。
[0100] H3N2亞型禽流感病毒和H6N8亞型禽流感病毒均記載在如下文獻中：Visual detection of HSsubtype avian influenza viruses by reverse transcription Ioop-mediated isothermal amplification assay.Virol J，2011，8:337.公眾可從廣西壯族自 治區獸醫研究所獲得，W重復本實驗。在下文中，H3N2亞型禽流感病毒簡稱H3N2，H6N8亞型 禽流感病毒W下簡稱冊N8。
[0101] A/duck/Guangxi/125D17/2012化4N2)記載在基因庫中，登錄號為KJ881013-KJ881020。公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得，W重復本實驗。在下文中，A/duck/ Guangx i/12抓 17/2012 化 4N2)簡稱為H4N2。
[0102] A/Duck/Guangxi/GXd-5/201(KH6Nl)記載在如下文獻中：Xie Z，Xie UZhou C，et al.Complete genome sequence analysis of an 冊Nlavian influenza virus isolated from Guangxi pockmark ducks . J. Virol. 2012,86 ： 13868-3869.公眾可從廣西壯族自治 區獸醫研究所獲得，W重復本實驗。在下文中，A/Duck/Guangxi/GXd-5/201(KH6Nl)簡稱為 冊肌。
[0103] A/Turkey/GA/209092/02(H5N2)^A/Duck/Guangxi/Gxd-3/2009(H6N2)^A/ CMcken/NY/273874/03化7N2)和雞毒霉形體(MG)S6株均記載在如下文獻中：Peng Y，Xie Z，Liu J，et al.Epidemiological Surveillance of Low PathogenicAvianInfluenza Virus化PAIV)from Poultry in Guangxi Province，Southern China.[J].PLOS ONE， 2013,8(10) :1-6.公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得，W重復本實驗。在下文中，A/ Turkey/GA/209092/02 化 5N2)簡稱冊 N2，A/Duck/Guangxi/Gxd-3/2009 化 6N2)簡稱冊 N2，A/ Chicken/NY/273874/03 化 7N2)簡稱 H7N2,雞毒霉形體(MG)S6 株簡稱 MG。
[0104] A/tudledove/Guangxi/49B6/2013化9N2)記載在如下文獻中：Xu Q，Xie Z，Xie L，etal.Characterization of an avain influenza virus H9N2strain isolated from awiId bird in southern Qiina.Genome Announc.2014,2:e00600-14.公眾可從廣西壯族 自治區獸醫研究所獲得，W重復本實驗。在下文中，A/tu;rtledove/Guangxi/49B6/2013 化9N2)簡稱為H9N2。
[01化]肥N3亞型禽流感病毒、冊N4亞型禽流感病毒、H10N3亞型禽流感病毒、Hl 1亞型禽流 感病毒、H12N5亞型禽流感病毒、H13N5亞型禽流感病毒和化5N9亞型禽流感病毒均記載在如 下文獻中：羅思思，謝芝勵，謝志勤，鄧顯文，劉加波，黃莉，黃嬌玲，曾婷婷.冊Nl亞型禽流感 病毒二重RT-PCR檢測方法的建立[J].畜牧與獸醫，2015，08:24-27.公眾可從廣西壯族自治 區獸醫研究所獲得，W重復本實驗。在下文中，H2N3亞型禽流感病毒簡稱H2N3,冊N4亞型禽 流感病毒簡稱冊N4，H10N3亞型禽流感病毒簡稱H10N3，H11亞型禽流感病毒簡稱H11，H12N5 亞型禽流感病毒簡稱H12N5，H13N5亞型禽流感病毒簡稱H13N5，H15N9亞型禽流感病毒簡稱 H15N9。
[0106] 新城疫病毒(NDV)F48E9株記載在如下文獻中：陳安莉，謝芝勵，周辰瑜，等.新城疫 病毒強弱毒株LAMP鑒別檢測方法的建立[J].中國獸醫科學，2011,41(09) :917-922.公眾可 從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得，W重復本實驗。在下文中，新城疫病毒(NDV)F48E9株簡 稱為NDV。
[0107] 雞傳染性支氣管炎病毒（IBV化52株記載在如下文獻中：羅思思，謝芝勵，龐耀珊， 等.雞傳染性支氣管炎病毒RT-LAMP可視化檢測方法的建立[J].中國農學通報，2012,28 (20) :83-87.公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得，W重復本實驗。在下文中，雞傳染 性支氣管炎病毒(IBV化52株簡稱為IBV。
[0108] 雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV)北京株記載在如下文獻中：謝志勤，謝芝勵，鄧顯 文，等.雞傳染性喉氣管炎病毒LAMP檢測方法的建立[J].獸醫科技，2012，44( 11): 52-55.公 眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得，W重復本實驗。在下文中，雞傳染性喉氣管炎病毒 (ILTV)北京株簡稱為ILTV。
[0109] 禽呼腸孤病毒(ARV)S1733株記載在如下文獻中：謝志勤，謝芝勵，文時日波，等.禽呼 腸孤病毒S1733株單克隆抗體的制備及夾屯、化ISA檢測方法的建立[J].畜牧與獸醫，2013， 45(5) ,49-52.公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得，W重復本實驗。在下文中，禽呼腸 孤病毒(ARV)S1733株簡稱為ARV。
[0110] 實施例1、引物的設計與合成
[0111] 根據GenBank中冊亞型AIV的HA基因（GenBank號:KU762372)的序列（如序列表中序 列5所示），設計并由北京六合華大基因科技股份有限公司合成引物對甲，引物對甲由引物 H9-F和引物H9-R組成，用于擴增冊亞型AIV。
[0112] 根據GenBank中冊亞型AIV的HA基因（GenBank號：JX304762)的序列（如序列表中序 列6所示），設計并由北京六合華大基因科技股份有限公司合成引物對乙，引物對乙由引物 冊-F和引物冊-R組成，用于擴增冊亞型AIV。
[0113] 引物序列詳見表1。
[0114] 表1.鑒定H9亞型AIV和冊亞型AIV的引物序列
[0115]
[0116] 實施例2、二重RT-PCR鑒定冊亞型AIV和冊亞型AIV
[0117] -、模板的獲得
[0118] 參照DNA/RNA抽提試劑盒使用說明書，分別提取H1N2、H3N2、H6N1、H6N2、H6N8、 H9N2、NDV、IBV、MG、ARV、H2N3、H4N2、冊N4、Hl 0N3、H11、Hl 2N5、Hl 3N5、冊N2、H7N2 和H15N9 的 RNA;然后參照MLV反轉錄酶的說明書反轉錄合成cDNA，依次得到CDNA濃度為1057iigAiL的 H1N2CDNA 溶液、946iig AiLH3N2cDNA 溶液、106 化 g/iiLH6Nl cDNA 溶液、123 化 g AiLH6N2cDNA 溶 液、102化g/iiLH6N8cDNA溶液、182扣gAiLH9N2cDNA溶液、864iig/iiLNDV cDNA溶液、899iigAi LIBV cDNA溶液、96祉g/yLMG cDNA溶液、892ygAiLARV cDNA溶液、964iig/iiLH2N3cDNA溶液、 1567ygAiLH4N2cDNA 溶液、107 化 g/化服 McDNA 溶液、1100i^g/化H10N3cDNA溶液、98化gA^ LHl 1 cDNA 溶液、1125ygAiLHl 2N5CDNA 溶液、130 化 g/yLHl 3N5CDNA 溶液、890蛇/化冊 N2cDNA 溶 液、105 化 g/iiLH7N2cDNA 溶液和1035ygAiLH15N9cDNA 溶液。
[0119] 參照DNA/RNA抽提試劑盒使用說明書，提取ILTV的DNA，得到DNA濃度為92化g/化的 ILTV DNA溶液。
[0120] 二、二重RT-PCR反應體系的建立及條件優化
[01別]1、二重 RT-PCR 反應體系（2 化 L)為 JXlYansTaq-T PCR S 叫 erMix 12.化 L，步驟 (1)得到的cDNA溶液化L，H9-F(濃度為25pmolAiL)和朋-R(濃度為25pmolAiL)各0.化L、0.化 1、0.3化、0.4化、0.5化、0.6化、0.7化、0.祉1^、0.9化或1.0化，冊斗（濃度為259111〇1/化）和冊-R(濃度為 25pmol/]iL)各0.：[化、0.化1^、0.：3化、0.4化、0.扣1^、0.化1^、0."7化、0.祉1^、0.9化或 1.0化，用去離子水補至2如L。
[0122] 2、將上述反應體系置于PCR儀，然后按照反應程序進行擴增。反應程序為:95°C變 性 5min;95°C 變性 1111111，50~60°(：(如50°(：、53°(：、55°(：、57°(：或60°(：)退火303,72°(：延伸303， 共35個循環;最后72°C延伸lOmin，于4°C保存。
[0123] 3、PCR擴增結束后，取RT-PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，經漠化乙錠染色后， 在紫外光下觀察拍照，與DNA Marker化2000作比較，分析并記錄結果。
[0124] 4、結果判定方法：如果所述RT-PCR擴增產物中含有大小為55化p(序列表中序列5 自5/末端起第1051至1601位所示）的DNA片段，則待測樣品中含有或候選含有H9亞型AIV，反 之則所述待測樣品中不含有或候選不含有朋亞型AIV;如果所述RT-PCR擴增產物中含有大 小為22化p(序列表中序列6自5/末端起第1442至1663位所示）的DNA片段，則待測樣品中含 有或候選含有冊亞型AIV，反之則所述待測樣品中不含有或候選不含有冊亞型AIV。
[0125]結果表明，實施例1合成的引物對甲可用于鑒定H9亞型AIV，引物對乙可用于鑒定 冊亞型AIV。最佳的反應體系（2扣UJXlYansTaq-T PCR SuperMix 12.扣L，H9-F(濃度為 25pmolAiL)和朋-R(濃度為25pmolAiL)各0.扣L，H6-F(濃度為25pmolAiL)和H6-R(濃度為 25pmolAiL)各0.祉L，模板化L(濃度至少為IOOfgAiLW上），用去離子水補至2扣L。最佳反應 程序為:95°C變性5min;95°C變性lmin，53°C退火30s，72°C延伸30s，共35個循環;最后72°C 延伸IOmin，于4 °C保存。
[01%] S、二重RT-PCR的特異性實驗
[0127] 1、按照步驟二中1和2優化后的PCR反應條件進行RT-PCR擴增，模板分別如下：由 H6N1CDNA溶液和朋N2cDNA溶液(體積比為1:1)組成的混合液（作為陽性對照），H6NlcDNA溶 液，H6N2CDNA 溶液，H6N8CDNA 溶液，冊N2cDNA 溶液，H1N2CDNA 溶液，H2N3CDNA 溶液，冊 N2cDNA 溶液，H4N2cDNA 溶液，H5N2cDNA 溶液，H7N2cDNA 溶液，H8N4cDNA 溶液，H10N3cDNA 溶液， Hl 1 cDNA溶液、Hl 2N5CDNA溶液，Hl3N5CDNA溶液，Hl5N9CDNA溶液，NDV cDNA溶液，IBV cDNA溶 液，ARV cDNA溶液，ILTV DNA溶液，MG cDNA溶液，去離子水。
[0128] 2、完成步驟1后，取RT-PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，經漠化乙錠染色后，在 紫外光下觀察拍照，與DNA Marker化2000作比較，分析并記錄結果。然后在紫外燈下用刀 片切割目的片段，然后用膠回收試劑盒純化回收。分別取適量純化回收的RT-PCR擴增產物， 與PMD18-T載體連接并測序。實驗重復=次。
[01巧]瓊脂糖凝膠電泳結果見圖UM為DNA Marker DL2000,泳道1為混合液，泳道2為 冊Nl cDNA溶液，泳道3為冊N2cDNA溶液，泳道4為冊NScDNA溶液，泳道5為朋N2cDNA溶液，泳道 6為朋N2cDNA溶液，泳道7為H1N2CDNA溶液，泳道8為肥N3cDNA溶液，泳道9為H3N2CDNA溶液， 泳道10為H5N2CDNA溶液，泳道11為H7N2CDNA溶液，泳道12為HSMcDNA溶液，泳道13為 H10N3CDNA溶液，泳道14為H12N5CDNA溶液，泳道15為H13N5CDNA溶液，泳道16為H4N2CDNA溶 液，泳道17為H15N9CDNA溶液，泳道18為NDV cDNA溶液，泳道19為IBV cDNA溶液，泳道20為 ARV CDNA溶液，泳道21為ILTV DNA溶液，泳道22為MG CDNA溶液，泳道23為去離子水）。結果 表明，所有含有H9亞型AIV和冊亞型AIV模板的樣品均能擴增出與試驗設計大小相符的擴增 條帶，即朋亞型AIV擴增得到大小為55化P的目的條帶，H6亞型AIV擴增得到大小為22化P的 目的條帶;而其它模板在相同位置卻無任何擴增條帶。測序結果進一步證實了 H9亞型AIV和 H6亞型AIV的RT-PCR擴增產物，大小分別為55化P和22化P，與試驗設計大小相符，且RT-PCR 擴增產物的核巧酸序列與引物設計模板的基因對應片段的完全一致，即大小為55化P的DNA 片段的核巧酸序列為序列表中序列5自5/末端起第1051至1601位所示，大小為22化P的DNA 片段的核巧酸序列為序列表中序列6自5/末端起第1442至1663位所示。運一結果表明，利用 該二重RT-PCR檢測H9亞型AIV和冊亞型AIV具有較強的特異性。
[0130] 四、二重RT-PCR的靈敏度實驗
[0131] 1、柄;準品的制備
[0132] 標準品的制備參考Hoffmann E，Stech J，Guan Y，et al .Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses[J].Arch Virol， 2001，146:2275-2289.的方法。具體步驟如下：
[0133] (I) WH9N2cDNA溶液為模板，W人工合成的5'-agcaaaagcagggg-3'和5'-agtagaaacaagggtgtttt-3'為引物進行RT-PCR的擴增，得到PCR擴增產物1; W冊N2cDNA溶液 為模板，W人工合成的5' -agcaaaagcagggg-3'和5' -agtagaaacaagggtgtttt-3'為引物進行 RT-PCR的擴增，得到PCR擴增產物2。
[0134] (2)完成步驟(1)后，用膠回收試劑盒純化回收PCR擴增產物1，然后與PMD18-T載體 連接，得到重組質粒朋-T;用膠回收試劑盒純化回收PCR擴增產物2，然后與PMD18-T載體連 接，得到重組質粒冊-T。
[0135] (3)完成步驟(2)后，用質粒抽提試劑盒分別提取重組質粒朋-T和重組質粒H6-T的 質粒，并用化no化OP ND-1000 微量核酸檢測儀對其進行濃度的測定，根據分子量和核酸濃 度計算對應的拷貝數，將重組質粒H9-T和重組質粒H6-T等拷貝數混合，用超純水稀釋，得到 標準品1 (重組質粒朋-T和重組質粒H6-T的質粒DNA濃度均為2.5 X IO9拷貝/化）、標準品2 (重組質粒冊-T和重組質粒H6-T的質粒DNA濃度均為2.5 X IO8拷貝/化）、標準品3(重組質粒 朋-T和重組質粒H6-T的質粒DNA濃度均為2.5 X IO7拷貝/化）、標準品4(重組質粒朋-T和重 組質粒冊-T的質粒DNA濃度均為2.5 X IO6拷貝/化）、標準品5(重組質粒朋-T和重組質粒冊-T的質粒DNA濃度均為2.5 X 105拷貝/化）、標準品6 (重組質粒H9-T和重組質粒H6-T的質粒 DNA濃度均為2.5 X IO4拷貝/化）、標準品7(重組質粒朋-T和重組質粒冊-T的質粒DNA濃度均 為2.5 X IO3拷貝/化）、標準品8(重組質粒H9-T和重組質粒冊-T的質粒DNA濃度均為2.5 X 1〇2 拷貝/化)和標準品9(重組質粒H9-T和重組質粒冊-T的質粒DNA濃度均為2.5 X 10拷貝/化）。
[0136] 2、靈敏度實驗
[0137] (1)制備反應體系（2化L) JXlYansTaq-T PCR S叫erMix 12.5化，朋-F(濃度為 25pmolAiL)和朋-R(濃度為25pmolAiL)各0.扣L，H6-F(濃度為25pmolAiL)和H6-R(濃度為 25pmolAiL)各0.祉L，模板化L，用去離子水補至加化。最佳反應程序為:95°C變性5min;95°C 變性lmin，53°C退火30s，72°C延伸30s，共35個循環;最后72°C延伸lOmin，于4°C保存。
[0138] 實驗設計10個不同處理，模板分別為標準品1、標準品2、標準品3、標準品4、標準品 5、標準品6、標準品7、標準品8、標準品9和去離子水。
[0139] (2)完成步驟（1)后，取RT-PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，經漠化乙錠染色后， 在紫外光下觀察拍照，與DNA Marker化2000作比較，分析并記錄結果。然后在紫外燈下用 刀片切割目的片段，然后用膠回收試劑盒純化回收。分別取適量純化回收的RT-PCR擴增產 物，與PMD18-T載體連接并測序。實驗重復=次。
[0140] 瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2(M為DNA Marker DL2000,泳道1為標準品1，泳道2為標 準品2，泳道3為標準品3，泳道4為標準品4，泳道5為標準品5，泳道6為標準品6，泳道7為標準 品7，泳道8為標準品8，泳道9為標準品9，泳道10為去離子水）。結果表明，該二重RT-PCR最低 能檢出5 X IO4拷貝重組質粒朋-T和5 X IO4拷貝重組質粒H6-T。最低檢測線W上各濃度的模 板中朋亞型AIV均擴增出大小為55化P的條帶，冊亞型AIV均擴增出大小為22化P的條帶，且 測序結果進一步證實了H9亞型AIV和H6亞型AIV的RT-PCR擴增產物，大小分別為551bp和 22化P，與試驗設計大小相符，且PCR產物的核巧酸序列與引物設計模板的基因對應片段的 完全一致，即大小為55化P的DNA片段的核巧酸序列為序列表中序列5自5/末端起第1051至 1601位所示，大小為22化P的DNA片段的核巧酸序列為序列表中序列6自5/末端起第1442至 1663位所示。小于最低檢測線各濃度的模板中朋亞型AIV均不能擴增出大小為55化P的條 帶，H6亞型AIV均不能擴增出大小為22化P的條帶。W上結果表明，利用該二重RT-PCR同時檢 測H9亞型AIV和冊亞型AIV具有較高的靈敏度，對朋亞型AIV和H6亞型AIV的最小檢出限均為 5 X 10哦貝。
[0141] 實施例3、二重RT-PCR檢測臨床樣本
[0142] -、臨床樣本RNA的提取
[0143] 從廣西省南寧市活禽市場采集禽類(雞或鴨）的咽喉和泄殖腔拭子樣本，共計120 份，依次編號為Ql~Q120。參照DNA/RNA抽提試劑盒和MLV反轉錄酶的使用說明書，提取各樣 本的RNA并反轉錄合成cDNA，得到CDNA濃度均為23化g/化的各樣本的CDNA溶液。
[0144] 二、病料處理后接種SPF雞胚進行病毒分離鑒定
[0145] 參考文獻(彭宜等.2006-2008年華東地區家禽不同HA亞型低致病性禽流感的病原 學監測.中國人獸共患病學報.2009年.）中記載的方法，對步驟一中采集的樣本的有關病毒 進行分離和鑒定。
[0146] S、二重RT-PCR檢測臨床樣本
[0147] 1、分別W步驟一得到的各樣本的CDNA溶液為模板，按照實施例2步驟二中1和2優 化后的PCR反應條件進行RT-PCR擴增。W去離子水為陰性對照。
[0148] 2、完成步驟1后，取RT-PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，經漠化乙錠染色后，在 紫外光下觀察拍照，與DNA Marker化2000作比較，分析并記錄結果。然后在紫外燈下用刀 片切割目的片段，然后用膠回收試劑盒純化回收。分別取適量純化回收的RT-PCR擴增產物， 與PMD18-T載體連接并測序。實驗重復=次。
[0149] 實驗結果如下：120份樣本中，6份樣本為H9亞型AIV和H6亞型AIV陽性，33份樣本為 朋亞型AIV陽性，15份樣本為H6亞型AIV陽性，運一實驗結果與步驟二中病毒分離鑒定結果 100 %相符。
[0150] 部分瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3(M為DNA Marker DL2000,泳道1至22為編號為Ql ~Q22的樣本，泳道23為去離子水）：編號為Q9和Q15的樣本可W擴增出大小為22化P的條帶， 為冊亞型AIV陽性;編號為92、912、919、921和922的樣本擴增出大小為55化口的條帶，為朋亞 型AIV陽性;編號為Q4、Q16的樣本可W擴增出兩條條帶且大小分別為22化P和55化P，為朋亞 型AIV和H6亞型AIV混合感染;其余樣本和陰性對照一樣均為陰性。進一步，經過測序，朋亞 型AIV陽性樣本的RT-PCR擴增產物的核巧酸序列為序列表中序列5自5/末端起第1051至 1601位所示，冊亞型AIV陽性樣本的RT-PCR擴增產物的核巧酸序列為序列表中序列6自5/末 端起第1442至1663位所示。
[0151] 上述結果表明，利用該二重RT-PCR可準確鑒定H9亞型AIV和冊亞型AIV。
【主權項】
1. 用于鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的引物對組，由特 異引物對甲和特異引物對乙組成； 所述特異引物對甲，由用于擴增特異DNA片段甲的兩條引物組成;所述特異DNA片段甲 中具有H9亞型禽流感病毒基因組中引物H9-F和引物H9-R組成的引物對的靶序列； 所述引物H9-F為如下al)或a2): al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子； a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功 能的單鏈DNA分子； 所述引物H9-R為如下a3)或a4): a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子； a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功 能的單鏈DNA分子； 所述特異引物對乙，由用于擴增特異DNA片段乙的兩條引物組成;所述特異DNA片段乙 中具有H6亞型禽流感病毒基因組中引物H6-F和引物H6-R組成的引物對的靶序列； 所述引物H6-F為如下bl)或b2): bl)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子； b2)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功 能的單鏈DNA分子； 所述引物H9-R為如下b3)或b4): b3)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子； b4)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功 能的單鏈DNA分子。2. 如權利要求1所述的引物對組，其特征在于:所述特異引物對甲由所述引物H9-F和所 述引物H9-R組成;所述特異引物對乙由所述引物H6-F和所述引物H6-R組成。3. 權利要求1或2所述引物對組的應用，為如下cl)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)或c7): cl)制備用于鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的試劑盒； c2)鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒； c3)鑒定或輔助鑒定待測病毒是否為候選的H9亞型禽流感病毒或候選的H6亞型禽流感 病毒； c4)制備用于鑒別H9亞型禽流感病毒和H6亞型禽流感病毒的試劑盒； c5)鑒別H9亞型禽流感病毒和H6亞型禽流感病毒； c6)制備用于檢測待測樣本中是否含有H9亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的 試劑盒； c7)檢測待測樣本中是否含有H9亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒。4. 含有權利要求1或2所述引物對組的試劑盒;所述試劑盒的功能為如下c2)或c3)或 c5)或c7): c2)鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒； c3)鑒定或輔助鑒定待測病毒是否為候選的H9亞型禽流感病毒或候選的H6亞型禽流感 病毒； c5)鑒別H9亞型禽流感病毒和H6亞型禽流感病毒； c7)檢測待測樣本中是否含有H9亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒。5. 權利要求4所述試劑盒的制備方法，為如下（I)或（Π ): (I)權利要求1或2所述引物對組中各引物對的各條引物分別單獨包裝； (Π )權利要求1或2所述引物對組中各引物對的各條引物按比例混合在一起。6. -種鑒定待測RNA病毒是否為候選的H9亞型禽流感病毒或H6亞型禽流感病毒的方 法，包括如下步驟q 1)或q2): ql)提取待測RNA病毒的RNA，采用權利要求1或2所述引物對組進行RT-PCR擴增，得到 RT-PCR擴增產物，然后進行如下判斷:如果所述RT-PCR擴增產物中含有序列表中序列5自5' 末端起第1051至1601位所示的DNA區段，則所述待測RNA病毒為或候選為的H9亞型禽流感病 毒;如果所述RT-PCR擴增產物中含有序列表中序列6自5'末端起第1442至1663位所示的DNA 區段，則所述待測RNA病毒為或候選為的H6亞型禽流感病毒;如果所述RT-PCR擴增產物中不 含有序列表中序列5自5'末端起第1051至1601位所示的DNA區段且不含有序列表中序列6自 5'末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待測RNA病毒不為或候選不為H9亞型禽流 感病毒或H6亞型禽流感病毒； q2)檢測待測RNA病毒的cDNA中是否含有序列表中序列5自5'末端起第1051至1601位所 示的DNA區段或序列表中序列6自5'末端起第1442至1663位所示的DNA區段，然后進行如下 判斷：如果所述cDNA中含有序列表中序列5自5'末端起第1051至1601位所示的DNA區段，則 所述待測RNA病毒為或候選為的H9亞型禽流感病毒;如果所述cDNA中含有序列表中序列6自 5'末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待測RNA病毒為或候選為的H6亞型禽流感 病毒;如果所述cDNA中不含有序列表中序列5自5'末端起第1051至1601位所示的DNA區段且 不含有序列表中序列6自5'末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待測RNA病毒不 為或候選不為H9亞型禽流感病毒或H6亞型禽流感病毒。7. -種鑒別H9亞型禽流感病毒和H6亞型禽流感病毒的方法，包括如下步驟si)或s2): si)提取待測病毒的RNA，采用權利要求1或2所述引物對組進行RT-PCR擴增，得到RT- PCR擴增產物，然后進行如下判斷：如果所述RT-PCR擴增產物中含有序列表中序列5自5'末 端起第1051至1601位所示的DNA區段，則所述待測病毒為H9亞型禽流感病毒；如果所述RT-PCR擴增產物中含有序列表中序列6自5'末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待 測病毒為H6亞型禽流感病毒;所述待測病毒為H9亞型禽流感病毒或H6亞型禽流感病毒； s2)檢測待測病毒的cDNA中是否含有序列表中序列5自5'末端起第1051至1601位所示 的DNA區段或序列表中序列6自5'末端起第1442至1663位所示的DNA區段，然后進行如下判 斷：如果所述cDNA中含有序列表中序列5自5'末端起第1051至1601位所示的DNA區段，則所 述待測病毒為H9亞型禽流感病毒；如果所述cDNA中含有序列表中序列6自Y末端起第1442 至1663位所示的DNA區段，則所述待測病毒為H6亞型禽流感病毒;所述待測病毒為H9亞型禽 流感病毒或H6亞型禽流感病毒。8. -種檢測待測樣本中是否含有H9亞型禽流感病毒和/或H6亞型禽流感病毒的方法， 包括如下步驟tl)或t2): tl)提取待測樣本的總RNA，采用權利要求1或2所述引物對組進行RT-PCR擴增，得到RT-PCR擴增產物，然后進行如下判斷：如果所述RT-PCR擴增產物中含有序列表中序列5自5'末 端起第1051至1601位所示的DNA區段，則所述待測樣本中含有或候選含有H9亞型禽流感病 毒;如果所述RT-PCR擴增產物中含有序列表中序列6自5'末端起第1442至1663位所示的DNA 區段，則所述待測樣本中含有或候選含有H6亞型禽流感病毒;如果所述RT-PCR擴增產物中 不含有序列表中序列5自5'末端起第1051至1601位所示的DNA區段且不含有序列表中序列6 自5'末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待測樣本中不含有或候選不含有H9亞 型禽流感病毒或H6亞型禽流感病毒； t2)檢測待測樣本的cDNA中是否含有序列表中序列5自5'末端起第1051至1601位所示 的DNA區段或序列表中序列6自5'末端起第1442至1663位所示的DNA區段，然后進行如下判 斷：如果所述cDNA中含有序列表中序列5自5'末端起第1051至1601位所示的DNA區段，則所 述待測樣本中含有或候選含有H9亞型禽流感病毒;如果所述cDNA中含有序列表中序列6自 5'末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待測樣本中含有或候選含有H6亞型禽流 感病毒;如果所述cDNA中不含有序列表中序列5自5'末端起第1051至1601位所示的DNA區段 且不含有序列表中序列6自5'末端起第1442至1663位所示的DNA區段，則所述待測樣本中不 含有或候選不含有H9亞型禽流感病毒或H6亞型禽流感病毒。9. 用于鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的特異引物對甲或用于鑒定或輔助鑒定H6 亞型禽流感病毒的特異引物對乙； 所述特異引物對甲由用于擴增特異DNA片段甲的兩條引物組成;所述特異DNA片段甲中 具有H9亞型禽流感病毒基因組中引物H9-F和引物H9-R組成的引物對的靶序列； 所述引物H9-F為如下al)或a2): al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子； a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功 能的單鏈DNA分子； 所述引物H9-R為如下a3)或a4): a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子； a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功 能的單鏈DNA分子； 所述特異引物對乙由用于擴增特異DNA片段乙的兩條引物組成;所述特異DNA片段乙中 具有H6亞型禽流感病毒基因組中引物H6-F和引物H6-R組成的引物對的靶序列； 所述引物H6-F為如下bl)或b2): bl)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子； b2)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功 能的單鏈DNA分子； 所述引物H9-R為如下b3)或b4): b3)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子； b4)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功 能的單鏈DNA分子。 10. fl)或f2): Π)權利要求9所述特異引物對甲的應用，為如下dl)或d2)或d3): dl)制備用于檢測或輔助檢測H9亞型禽流感病毒的試劑盒； d2)鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒； d3)鑒定或輔助鑒定待測病毒是否為候選的H9亞型禽流感病毒； f2)權利要求9所述特異引物對乙的應用，為如下el)或e2)或e3): el)制備用于檢測或輔助檢測H6亞型禽流感病毒的試劑盒； e2)鑒定或輔助鑒定H6亞型禽流感病毒； e3)鑒定或輔助鑒定待測病毒是否為候選的H6亞型禽流感病毒。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861757SQ201610430961
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月17日
【發明人】謝芝勛, 李丹, 李孟, 謝志勤, 羅思思, 謝麗基, 黃莉, 范晴, 黃嬌玲
【申請人】廣西壯族自治區獸醫研究所