專利名稱：PCV2、PRV與SIV H9亞型多重SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR引物及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種病毒的檢測方法，具體涉及PCV2、PRV與SIV H9亞型多重STOR Green I實時熒光PCR引物及其檢測方法。
背景技術：
豬偽狂犬病毒(PRV)和豬圓環病毒2型(PCM)都能夠不同程度的導致妊娠引起種豬不育，即公豬睪丸腫脹，精液質量下降，失去種用能力；母豬表現為不發情，返情，不孕； 妊娠母豬發生流產、早產、死胎、木乃伊、弱仔及新生仔豬發病且導致大量死亡等，給養豬業造成了巨大的經濟損失。對這類傳染病的有效控制是保證養豬業健康發展的關鍵因素之一。在動物流感中，豬流感是除禽流感以外經濟意義最大，而且公共衛生意義特別重要。 2009年墨西哥爆發的豬流感疫情導致數百人死亡，并且，豬流感引起的人類流感迅速在世界上傳播開來。所以，豬流感的預防和控制密切關系到人類的公共衛生安全。目前，針對以上三種病毒病的診斷方法有很多，但這些方法具有操作復雜、費時費力、敏感度差及陰性率高等缺點；雖然臨床已經使用的PCR診斷技術，有靈敏度高、特異性強、快速、簡便等優點，但不能準確定量；而TaqMan熒光定量PCR方法能定量，但成本較高， 且需要合成特異性探針。亟需研究開發成本低、簡便、快速、特異、定量的檢測方法。臨床上， 這幾種病毒常常以混合感染的形式出現，靠分離病毒和抗體檢測來確診容易造成假陰性， 而且操作繁瑣，對儀器的操作要求較高，所需時間長，亟需一種操作簡單、快速的檢測、準確率高的鑒別診斷方法。

發明內容
本發明要解決的技術問題是PCV2、PRV與SIV H9亞型這幾種病毒常常以混合感染的形式出現，靠分離病毒和抗體檢測來確診容易造成假陰性，而且操作繁瑣，提供一種 PCV2、PRV與SIV H9亞型多重STOR Green I實時熒光PCR引物及其檢測方法。本發明的技術方案是PCV2、PRV與SIV H9亞型多重STOR Green I實時熒光PCR 引物SIV H9亞型引物的序列如下上游引物P1 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘；下游引物P2 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘；PRV引物的序列如下上游引物P3:5' -GGCATCGGCGACTACCT-3‘；下游引物P4 5 ‘ CGTCGTGCAGCGTGTAGAG-3 ‘；PCV2引物的序列如下上游引物P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘；下游引物P6:5' -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3‘。
所述引物檢測PCV2、PRV與SIV H9亞型的多重STOR Green I實時熒光PCR檢測方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I實時熒光PCR反應體系和反應條件對病毒進行檢測，所述STOR Green I實時熒光PCR反應，在25 μ 1體系中加入以下成份
權利要求
1.PCV2、PRV與SIVH9亞型多重STOR Green I實時熒光PCR引物，其特征在于 SIV H9亞型引物的序列如下上游引物 P1 5 ‘ -GGAACAACGCTTACCCTG-3 ‘； 下游引物 P2 5 ‘ -GAGACCATTGACAAGAGGC-3 ‘； PRV引物的序列如下上游引物 P3 5 ‘ -GGCATCGGCGACTACCT-3 ‘； 下游引物 P4 5 ‘ -CGTCGTGCAGCGTGTAGAG-3 ‘； PCV2引物的序列如下上游引物 P5 5 ‘ -GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3 ‘； 下游引物 P6 5 ‘ -CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3 ‘。
2.利用權利要求1所述引物檢測PCV2、PRV與SIVH9亞型的多重STOR Green I實時熒光PCR檢測方法，包括提取病毒的DNA后，按如下STOR Green I實時熒光PCR反應體系和反應條件對病毒進行檢測，其特征在于所述STOR Green I實時熒光PCR反應體系，在25 μ 1體系中加入以下成份 SYBR Premix Ex Taq II14.5 μ Ρ1/Ρ3/Ρ50.5+0.5+0.5pLP24M/P60.5+0.5+0.5μΕDNA1+1+1 μ ddH204.5μ .25 μ 所述反應條件為95°C預變性lmin ；進入循環，95°C變性10s，58°C退火15s，72°C延伸 15s，40個循環，循環結束后升溫至95°C 15s，再降至65°C .15s，開始從65°C遞增至94°C，采集熒光信號得出擴增產物的溶解曲線，于95°C 15s結束反應。
全文摘要
本發明公開了一種PCV2、PRV與SIV H9亞型多重SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR引物及其檢測方法，SIV H9亞型引物的序列如下上游引物P15′-GGAACAACGCTTACCCTG-3′；下游引物P25′-GAGACCATTGACAAGAGGC-3′；PRV引物的序列如下上游引物P35′-GGCATCGGCGACTACCT-3′；下游引物P45′-CGTCGTGCAGCGTGTAGAG-3′；PCV2引物的序列如下上游引物P55′-GGGCCAGAATTCAACCTTACCC-3′；下游引物P65′-CGCACCTTCGGATATACTGTCA-3′。本發明分別設計擴增SIV H9亞型、PCV2和PRV的特異性引物，通過三重SYBR Green Ⅰ實時定量PCR檢測方法能夠同時檢測SIV H9亞型、PCV2和PRV。SIV H9亞型、PCV2和PRV同時檢出的極限拷貝數分別為184拷貝/μL，207拷貝/μL，193拷貝/μL。本發明的特異性試驗結果良好，只出現三個特異性的峰值，重復性試驗具有很好的穩定性并且本試驗的最大優勢在于能夠同時檢測SIV H9亞型、PCV2和PRV3種DNA病毒，有利于妊娠母豬繁殖障礙性病毒的鑒別。
文檔編號C12Q1/70GK102373299SQ20111022175
公開日2012年3月14日 申請日期2011年8月4日 優先權日2011年8月4日
發明者宋亞鵬, 崔保安, 李明鳳, 陳紅英, 韓志濤, 魏戰勇 申請人:河南農業大學