本申請涉及禽流感病毒檢測領域，特別是涉及一種用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法和應用。
背景技術：
：禽流感(avianinfluenza,ai)是由正黏病毒科a型流感病毒屬中的禽流感病毒引起的發生于各種家禽和野禽的病毒性傳染病。該病于1978年在意大利雞群中首次暴發，現已遍布世界許多國家。由于不同禽流感病毒的ha和na有不同的抗原性，目前已發現有16個ha亞型和9個na亞型，此外，還從蝙蝠體內分離到了兩種新的a型流感病毒亞型，h17n10和h18n11。根據禽流感病毒對人工感染雞的致病性，可將其分為高致病性禽流感(縮寫hpaiv)和低致病力禽流感(縮寫lpaiv)，病毒ha裂解位點的分子標準也可作為致病性的補充依據。目前所有的高致病性禽流感病毒都屬于h5或h7亞型，低致病性禽流感病毒以h9n2亞型居多。h7n9亞型禽流感病毒是一種新型禽流感病毒，可感染禽和人。根據世界衛生組織(who)報告統計，自2013年3月中國首次報道人感染h7n9亞型禽流感以來，截止到2017年2月14日，共有1223例人感染h7n9亞型禽流感實驗室確診病例，包括至少380名死亡病例。2016年入冬以來，我國出現人感染該亞型病毒病例數直線上升的情況，特別是2016年12月的最后兩周，全國新增人間病例92例，死亡10例，這說明該亞型病毒對人的健康威脅仍然很大。活禽零售市場環境污染率與人感染病例數在時空維度表現一致，即隨著污染水平升高，人的感染風險也增加。值得關注的是，2015年-2016年間報告人感染病例數位居前列的廣東、浙江、江蘇、福建等省份市也已在養雞場中發現h7n9亞型禽流感病毒。雖然目前只是散發，但對其流行態勢要高度關注。重組酶聚合酶核酸擴增技術rpa(recombinasepolymeraseamplification，rpa)被稱為是可以替代pcr的核酸檢測技術，rpa能夠在15分鐘內進行37℃-42℃常溫下的單分子核酸檢測。rpa技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈dna結合蛋白(ssb)和鏈置換dna聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，其擴增原理是：重組酶與引物結合形成的蛋白-dna復合物，能在雙鏈dna中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應形成并啟動dna合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的dna鏈與ssb結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物。目前尚沒有h7亞型禽流感病毒的rpa檢測研究和報道。技術實現要素：本申請的目的是提供一種用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法和應用。本申請采用了以下技術方案：本申請的一方面公開了一種用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑，該試劑包括引物對和探針，引物對的上游引物為seqidno.1所示序列，引物對的下游引物為seqidno.2所示序列，探針為seqidno.3所示序列或者seqidno.3所示序列的反向互補序列；seqidno.1：5’-gcaacagggatgaagaatgttcctgagattc-3’seqidno.2：5’-gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatc-3’seqidno.3：5’-gggaagaggcctatttggtgctatagcgggtttcattgaaaatggatgggaa-3’seqidno.3所示序列的探針中，第32個堿基修飾bhq1-dt、第36個堿基修飾6-fam-dt、第34個堿基替換為dspacer、3’端修飾c3spacer。需要說明的是，在熒光檢測中，探針是特異性的結合到雙鏈的其中一條鏈的，只要pcr擴增的時候，將結合的探針破壞，即可產生熒光信號，因此，可以采用seqidno.3所示序列的探針結合到其中一條鏈上，也可以采用seqidno.3所示序列的反向互補序列作為探針結合到另一條鏈上，探針的修飾方式不變。還需要說明的是，本申請的引物對和探針，是特別針對h7亞型禽流感病毒的rpa檢測而設計的，不同于常規pcr引物或一般的實時熒光pcr探針。此外，本申請的引物對和探針能夠特異性的檢測h7亞型禽流感病毒，而不是僅僅針對h7n9毒株設計的引物探針；也就是說，本申請的檢測試劑和方法，能夠特異性的對包括h7n9毒株在內的所有h7亞型禽流感病毒進行檢測，即便其na基因發生變異，也不會影響本申請的檢測特異性和靈敏度。本申請的試劑包括引物對和探針，其中，探針是為了方便對rpa產物進行熒光檢測，可以理解，如果不是采用熒光檢測對rpa產物進行檢測，則整個試劑可以不包含探針，只要一對引物即可完成rpa擴增。本申請的另一面公開了本申請的用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑在h7亞型禽流感病毒檢測中的應用。本申請的另一面公開了本申請的用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑在制備h7亞型禽流感病毒檢測試劑盒或設備中的應用。可以理解，本申請的試劑，實際上就針對h7亞型禽流感病毒設計的特異性探針和引物對，當然可以用于h7亞型禽流感病毒的檢測，或者用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑盒或設備。本申請的再一面公開了一種用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑盒，該試劑盒中含有本申請的用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑。本申請的再一面公開了一種用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑盒，該試劑盒中含有至少一組混合試劑，每組混合試劑由rt-rpa反應緩沖液29.5μl、10μm的上游引物2.1μl、10μm的下游引物2.1μl和10μm的探針0.6μl組成；上游引物為seqidno.1所示序列，下游引物為seqidno.2所示序列，探針為seqidno.3所示序列或者seqidno.3所示序列的反向互補序列，并且，no.3所示序列的探針中，第27個堿基修飾bhq1-dt，第30個堿基修飾6-fam-dt，第28個堿基替換為dspacer，3’端修飾c3spacer。需要說明的是，本申請的試劑實際上是針對h7亞型禽流感病毒的rpa檢測而設計的，為了方便使用，本申請將反應體系中使用的反應緩沖液、引物和探針統一配制成混合試劑，每一組混合試劑就是一個反應體系，直接向其中加入rna樣品、水和/或添加劑就可以進行檢測，使用簡單方便，不僅避免了配制反應體系的繁瑣步驟，而且避免了配制反應體系過程造成的污染。本申請試劑盒的混合試劑中，各組分的用量是在本申請的試驗條件和環境下，根據本申請的優選實施方式而得出的，可以理解，根據不同的試驗環境，混合試劑中各組分的用量可以進行適當調整，在此不做具體限定。本申請的再一面公開了一種用于h7亞型禽流感病毒的檢測方法，包括以下步驟：(1)提取待測樣品的核酸；(2)采用本申請的試劑盒，向試劑盒的混合試劑中加入步驟(1)提取的核酸，再加入depc水和醋酸鎂，配制成反應溶液；(3)將步驟(2)配制的反應溶液，在41℃恒溫反應，整個反應過程采集熒光信號。需要說明的是，本申請的試劑盒或者本申請的試劑，其關鍵就是針對h7亞型禽流感病毒設計的特異性的rpa檢測引物和探針，試劑盒的混合試劑，實際上就是本申請的rpa檢測反應體系。優選的，41℃恒溫反應具體包括，先將步驟(2)配制的反應溶液，在41℃保溫5min，然后取出裝反應溶液的pcr管上下輕輕顛倒數次，瞬時離心，再繼續41℃下反應15min，整個反應過程采集熒光信號。需要說明的是，反應5min后取出混勻，目的是使反應能夠更均勻的進行。優選的，采集熒光信號的過程中，fam熒光通道光源強度設置為28％。優選的，本申請的檢測方法還包括，采集41℃恒溫反應前5min各點熒光值，計算其平均值，作為第一熒光值；采集41℃恒溫反應5min后任意時間點的熒光值，作為第二熒光值；根據熒光增量判斷待測樣品為陽性或陰性，具體的，熒光增量大于55％，且持續的時間超過2分鐘，判為陽性，否則判為陰性；熒光增量＝[(第二熒光值-第一熒光值)/第一熒光值]×100％。優選的，步驟(1)提取待測樣品的核酸，采用magmaxtm-96viralrnaisolationkit磁珠提取試劑盒，或者trizol核酸抽提法。本申請的有益效果在于：本申請的用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑，對禽流感h7亞型具有很強的特異性，能夠準確靈敏的從眾多禽流感病毒中特異性的檢測出h7亞型，并且可以同時檢出h7亞型中的各個毒株，為h7亞型禽病毒的預防和監控提供了一種有效的方法和途徑。并且，基于本申請的試劑或試劑盒的h7亞型禽流感病毒檢測方法，耗時短、靈敏度高、對硬件設備要求低，不需要復雜的樣本處理，特別適合于現場快速檢測，這對于控制流感的流行，減少經濟損失，最大限度的保護全社會人群的健康和生命安全具有重大意義。附圖說明圖1是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應溫度為38℃時的擴增曲線；圖2是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應溫度為39℃時的擴增曲線；圖3是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應溫度為40℃時的擴增曲線；圖4是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應溫度為41℃時的擴增曲線；圖5是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應溫度為42℃時的擴增曲線；圖6是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法fam通道的熒光強度設置為12％時的擴增曲線；圖7是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法fam通道的熒光強度設置為16％時的擴增曲線；圖8是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法fam通道的熒光強度設置為20％時的擴增曲線；圖9是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法fam通道的熒光強度設置為24％時的擴增曲線；圖10是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法fam通道的熒光強度設置為28％時的擴增曲線；圖11是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法fam通道的熒光強度設置為32％時的擴增曲線；圖12是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法的特異性檢測結果；圖13是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法的靈敏度檢測結果；圖14是本申請實施例中作為對比的h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法的靈敏度檢測結果。圖1-圖5中，1為h7亞型禽流感病毒核酸濃度0.523μg/ml的檢測曲線、2為h7亞型0.0523μg/ml的檢測曲線、3為h7亞型5.23ng/ml的檢測曲線、4為h7亞型0.523ng/ml的檢測曲線、5為h7亞型0.0523ng/ml的檢測曲線、6為h7亞型0.00523ng/ml的檢測曲線、7為h5亞型禽流感病毒核酸濃度0.262μg/ml的檢測曲線；圖6-圖11中，1為h7亞型0.0523μg/ml的檢測曲線、2為h7亞型5.23ng/ml的檢測曲線、3為h7亞型0.523ng/ml的檢測曲線、4為h7亞型0.0523ng/ml的檢測曲線、5為h7亞型0.00523ng/ml的檢測曲線、6為h7亞型0.523pg/ml的檢測曲線、7為h5亞型禽流感病毒核酸濃度0.262μg/ml的檢測曲線；圖12中，具有熒光信號的曲線由上到下依序為低致病性的h7亞型禽流感病毒核酸的檢測曲線和高致病性的h7亞型禽流感病毒核酸的檢測曲線；圖13中，1為h7亞型禽流感病毒核酸濃度0.523μg/ml的檢測曲線、2為h7亞型0.0523μg/ml的檢測曲線、3為h7亞型5.23ng/ml的檢測曲線、4為h7亞型0.523ng/ml的檢測曲線、5為h7亞型0.0523ng/ml的檢測曲線、6為h7亞型5.23pg/ml的檢測曲線、7為h5亞型禽流感病毒核酸濃度0.262μg/ml的檢測曲線；圖14中，1為h7亞型禽流感病毒核酸濃度0.523μg/ml的檢測曲線、2為h7亞型0.0523μg/ml的檢測曲線、3為h7亞型5.23ng/ml的檢測曲線、4為h7亞型0.523ng/ml的檢測曲線、5為h7亞型0.0523ng/ml的檢測曲線、6為h7亞型5.23pg/ml的檢測曲線、7為h7亞型0.523pg/ml的檢測曲線、8為h7亞型0.0523pg/ml的檢測曲線。具體實施方式下面通過具體實施例對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅對本申請進行進一步說明，不應理解為對本申請的限制。實施例一、材料1.病毒rna本例分別采用了禽流感h3n2、h4n9、h5n1、h6n2、低致病性h7n9、高致病性h7n9、h9n2、h11n9和h1n1亞型和新城疫病毒的rna進行試驗。2.rt-rpa和qrt-pcr試劑twistamptmexolyophilizedkit(twistdx,cambridge,uk)；agpath-idtmone-steprt-pcrreagents；magmaxtm-96viralrnaisolationkit(thremofisherscientific,usa)；rpa試驗用引物及探針、實時熒光rt-pcr試驗用引物及探針均由上海生工生物工程有限公司合成。3.主要儀器設備便攜式等溫擴增熒光檢測儀(t16-iso)，購置于英國twistdx公司；abi7500-fast實時熒光pcr檢測儀，購置于美國ab公司；超微量核酸檢測儀；離心機；微量移液器。二、方法1.引物探針的設計選取禽流感h基因作為靶標基因，采用dnastar軟件對10株h7亞型禽流感病毒株及其它亞型禽流感病毒株，包括h1、h3、h4、h5、h6、h9和h11，的h基因核苷酸全序列進行序列比對。選擇h7亞型禽流感特異性序列來設計引物和探針，并與ncbi數據庫核苷酸序列進行blast比對，確定其序列的特異性。為建立快速敏感的rpa檢測方法需要選擇合適的擴增引物，而目前無法跟實時熒光pcr方法一樣可利用商業軟件來設計并預測擴增性能。因此本例自行設計了一系列候選引物及探針，用于試驗篩選，如表1所示。此外，本例還采用了實時熒光pcr檢測作為對照，實時熒光pcr的引物和探針為oie推薦用引物與探針，如表1所示。oie為officeinternationaldesepizooties縮寫，即世界動物衛生組織。表1引物和探針序列名稱序列(5’→3’)seqidno.h7-1026-p-1gggaagaggcctatttggtgctatagcgggtttcattgaaaatggatgggaa3h7-991-f-1gcaacagggatgaagaatgttcctgagattc1h7-1119-r1-1gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatcaattagg4h7-1119-r2-1gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatc2h7-501-f-2gtcaaacacagataatgctgcattcccgcagatg5h7-536-p-2ctaagtcatataaaaatacaagaaaaagcccagctataatagtatgggggatcc6h7-658-r1-2cccaactgtcaccagtttgtttccactcccatatag7h7-658-r2-2cccaactgtcaccagtttgtttccactccc8aiv-h7-fggcaatgcaaaatagaatacagattg9aiv-h7-pfam-cccagtcaaactaagcagcggc-bhq110aiv-h7-rccccgaagctaaaccaaagtatc11注：h7-1026-p-1探針標記與修飾為：第32個堿基修飾bhq1-dt、第36個堿基修飾6-fam-dt、第34個堿基替換為dspacer、3’端修飾c3spacer。h7-536-p-2探針標記與修飾為：第35個堿基修飾bhq1-dt、第37個堿基修飾6-fam-dt、第36個堿基替換為dspacer、3’端修飾c3spacer。2.病毒核酸的提取采用magmaxtm-96viralrnaisolationkit磁珠提取試劑盒提取上述病毒核酸，并用超微量核酸檢測儀測定核酸濃度，作為rpa試驗用樣品模板。3.引物和探針篩選以提取的低致病性h7n9和高致病性h7n9病毒的核酸作為模板，將設計好的引物，從h7-991-f-1和h7-501-f-2中任選一個作為上游引物，從h7-1119-r1-1、h7-1119-r2-1、h7-658-r1-2和h7-658-r2-2中任選一個作為下游引物，上游引物和下游引物兩兩配對，再分別配以h7-1026-p-1探針、h7-536-p-2探針，進行rt-rpa反應，篩選快速敏感的最佳引物對和探針。rt-rpa反應體系為：反應緩沖液(即rehydrationbuffer)29.5μl，然后加入10μm濃度的上、下游引物各2.1μl，10μm濃度的探針0.6μl，再加入模板及depc水13.2μl，共47.5μl，混勻，加入280mm醋酸鎂2.5μl，反應體系共計50μl。反應條件為：在38℃保溫5min，然后取出裝反應溶液的pcr管上下輕輕顛倒數次，瞬時離心，再繼續38℃下反應15min，整個反應過程采集熒光信號。fam通道的熒光強度設置為20％。4.rt-rpa反應體系與條件的優化(1)rt-rpa反應體系的配置取出twistamptmexolyophilizedkit試劑盒反應管并置于冰上，里面含有白色固體小顆粒，為凍干混合酶，包括能結合單鏈核酸即寡核苷酸引物的重組酶、單鏈dna結合蛋白(縮寫ssb)和鏈置換dna聚合酶，加入試劑盒中的反應緩沖液(即rehydrationbuffer)29.5μl，然后加入10μm濃度的上、下游引物各2.1μl，10μm濃度的探針0.6μl，再加入模板及depc水13.2μl，共47.5μl，混勻，加入280mm醋酸鎂2.5μl，反應體系共計50μl，混勻后放入t16-iso儀器后開始試驗。(2)rt-rpa反應條件的基本設置將配置好的反應混合液置于t16-iso儀器中，設置反應程序，38-42℃反應5min，然后從儀器中取出pcr管上下輕輕顛倒數次，迅速置于離心機上2000rpm/min，離心30s，放入t-16中繼續在38-42℃下反應15min。設置熒光通道光源強度，并在整個反應過程收集fam熒光信號。rt-rpa反應條件的優化具體如下：本例將提取到的低致病性h7亞型禽流感病毒核酸作6個10倍系列稀釋，再加上陰性對照的h5亞型禽流感病毒核酸，共計7個樣品模板，采用優化好的引物對與探針組合，配置反應體系。其中，h7亞型禽流感病毒核酸的6個10倍系列稀釋的濃度分別為，0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml、0.00523ng/ml；h5亞型禽流感病毒核酸的濃度為0.262μg/ml。反應程序的優化具體如下：將配置好的反應管放入t-16儀器中，在38℃反應5min，然后從儀器中取出pcr管上下輕輕顛倒數次，迅速置于離心機上2000rpm/min，離心30s，再放入t-16中繼續反應15min，整個反應過程全程收集fam熒光。取同樣的反應體系和樣品數量，將反應溫度分別設置為38℃、39℃、40℃、41℃和42℃，其它條件均不變，篩選出最優的反應溫度。fam通道的熒光強度的優化具體如下：采用優化的反應溫度，并取同樣的反應體系和樣品數量，設置led燈fam通道的熒光強度，分別設置為12％、16％、20％、24％、28％和32％六個不同的熒光強度進行檢測，篩選出最優的led燈fam通道的熒光強度值。5.rt-rpa方法判定標準的設定將上述各樣品的反應結果按下列公式進行計算：首先，采集恒溫反應前5min各點熒光值，計算其平均值，作為第一熒光值；然后采集5min后任意時間點的熒光值，作為第二熒光值。檢測各時間點熒光強度增加百分數，即熒光增量＝[(第二熒光值-第一熒光值)/第一熒光值]×100％。分析各稀釋度樣品的熒光強度增加值，以及陰性樣品的熒光強度增加值，選取合適的熒光強度增加值作為臨界閾值，設定本例檢測方法的判定標準。6.rt-rpa方法特異性試驗以提取的h3n2、h4n9、h5n1、h6n2、低致病性h7n9、高致病性h7n9、h9n2、h11n9和h1n1亞型和新城疫病毒的rna為模板，采用篩選的引物對和探針，以及優化的反應條件進行h7亞型禽流感病毒rpa特異性檢測。7.rt-rpa方法靈敏性試驗本例將提取到的低致病性h7亞型禽流感病毒核酸作8個10倍系列稀釋，再加上陰性對照的h5亞型禽流感病毒核酸，共計9個樣品模板，采用優化好的引物對與探針組合，配置反應體系，并按照優化的反應條件進行h7亞型禽流感病毒rpa靈敏度檢測。其中，h7亞型禽流感病毒核酸的8個10倍系列稀釋的濃度分別為，0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml、0.00523ng/ml、0.523pg/ml、0.0523pg/ml；h5亞型禽流感病毒核酸的濃度為0.262μg/ml。同時，采用相同的9份核酸樣品作為模板，以oie推薦用引物與探針，按照其方法進行實時熒光檢測，比較本例的rpa方法和現有的實時熒光rt-pcr方法兩者的檢測靈敏度。8.rt-rpa方法的初步應用采集來自多地養殖場、活禽交易市場的雞泄殖腔拭子和咽拭子30份，以及標準毒株5份，分別采用oie推薦用引物與探針，和本例的rpa檢測方法，對采集的樣品進行檢測，比較兩者的符合性。三、結果1.引物對和探針的篩選將設計好的引物采取兩兩搭配的方式組合，篩選出快速敏感的最佳引物對和探針，本例的篩選結果顯示，在相同的條件下，h7-991-f-1和h7-1119-r2-1引物對，配合h7-1026-p-1探針，其敏感度最高，即在相同的時間點，熒光增量更大。2.最佳反應條件的確定(1)不同反應溫度rpa試驗結果反應溫度設置為38℃時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量，即熒光增量；qrt-rpa試驗具體結果見表2，擴增曲線結果見圖1。表2h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應溫度為38℃時的熒光值結果表2中，熒光值1為相應時間下h7亞型禽流感病毒核酸濃度為0.523μg/ml時檢測的熒光值，熒光值1后面對應的熒光增量，即在相應時間下，熒光值1相對于恒溫反應前5min各點熒光值的平均值的增量。熒光值2、3、4、5依序為h7亞型禽流感病毒核酸濃度為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml的熒光值。以下表3至表6都與表2相同。反應溫度設置為39℃時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量，即熒光增量；qrt-rpa試驗具體結果見表3，擴增曲線結果見圖2。表3h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應溫度為39℃時的熒光值結果反應溫度設置為40℃時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結果見表4，擴增曲線結果見圖3。表4h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應溫度為40℃時的熒光值結果反應溫度設置為41℃時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結果見表5，擴增曲線結果見圖4。表5h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應溫度為41℃時的熒光值結果反應溫度設置為42℃時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結果見表6，擴增曲線結果見圖5。表6h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應溫度為42℃時的熒光值結果本例選取0.0523ng/ml濃度陽性樣品的擴增效率來選擇最優的反應溫度，從實驗結果來看，0.0523ng/ml濃度的h7亞型禽流感病毒核酸樣品在反應溫度設置為41℃時，其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加百分數更大。因此，本例建立的檢測h7亞型禽流感病毒qrt-rpa方法的最佳反應程序為：將配置好的反應體系放入溫度設置為41℃的t-16儀器中反應5min，然后從儀器中取出pcr管上下輕輕顛倒數次，迅速置于離心機上2000rpm/min，離心30s，再放入t-16儀器中，繼續在41℃下反應15min。整個反應過程全程收集fam熒光。(2)不同光源強度下的rpa試驗結果本例將led燈fam通道的熒光強度設置為12％時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量，即熒光增量；qrt-rpa試驗具體結果見表7，擴增曲線結果見圖6。表7h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法熒光強度為12％時的熒光值結果表7中，熒光值1為相應時間下h7亞型禽流感病毒核酸濃度為0.0523μg/ml時檢測的熒光值，熒光值1后面對應的熒光增量，即在相應時間下，熒光值1相對于恒溫反應前5min各點熒光值的平均值的增量。熒光值2、3、4、5依序為h7亞型禽流感病毒核酸濃度為5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml的熒光值。以下表8至表12都與表7相同。將led燈fam通道的熒光強度設置為16％時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結果見表8，擴增曲線結果見圖7。表8h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法熒光強度為16％時的熒光值結果將led燈fam通道的熒光強度設置為20％時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結果見表9，擴增曲線結果見圖8。表9h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法熒光強度為20％時的熒光值結果將led燈fam通道的熒光強度設置為24％時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結果見表10，擴增曲線結果見圖9。表10h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法熒光強度為24％時的熒光值結果將led燈fam通道的熒光強度設置為28％時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結果見表11，擴增曲線結果見圖10。表11h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法熒光強度為28％時的熒光值結果將led燈fam通道的熒光強度設置為32％時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結果見表12，擴增曲線結果見圖11。表12h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法熒光強度為32％時的熒光值結果本文選取0.0523ng/ml和0.00523ng/ml濃度陽性樣品的擴增效率來綜合分析fam熒光通道光源強度的最優設置，從實驗結果來看，0.0523ng/ml濃度樣品在熒光強度設置時，fam通道強度占led光源強度的28％時，其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加百分數更大；而0.00523ng/ml濃度樣品在熒光強度設置時，fam通道強度占led光源強度的32％時，其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加百分數更大，但0.0523ng/ml濃度樣品在熒光強度設置時，fam通道強度占led光源強度的32％時，其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加百分數出現降低。綜合分析，本文在建立檢測h7亞型禽流感病毒qrt-rpa方法時，fam熒光通道光源強度設置成28％為最佳。3.結果判定標準的設置根據上述實驗結果選取最佳反應條件及設置，其中最佳反應溫度為41℃，fam通道強度設置為占led光源強度28％時，按熒光增量＝[(第二熒光值-第一熒光值)/第一熒光值]×100％計算出圖4和圖10中最低濃度陽性樣品的最大熒光增加值為63％和53％，其中圖4增加值超過55％時持續時間為2分鐘。另外，在后續的應用試驗中，本例采集的30份陰性雞咽拭子樣品，提取核酸后按最佳反應體系和反應條件進行試驗，結果其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加值均低于15％，因此本例將試驗結果判定標準設定為：試驗5分鐘后的采集點熒光值與前5分鐘采集到的各點熒光值的平均值之比，即熒光增量大于55％，且持續的時間超過2分鐘，則判為陽性；否則判為陰性。4.rt-rpa方法特異性試驗結果本例qrt-rpa試驗特異性檢測結果見圖12，結果顯示，只有高致病性h7亞型禽流感病毒和低致病性h7亞型禽流感病毒出現了擴增，其他亞型h1、h3、h4、h5、h6、h9和h11亞型流感病毒、新城疫病毒樣品未見有擴增。5.rt-rpa方法靈敏性試驗結果本例qrt-rpa試驗靈敏性檢測結果見圖13，結果顯示，本例建立的檢測h7亞型禽流感病毒qrt-rpa方法的檢測靈敏度可達0.00523ng/ml。取相同的9個核酸樣品，采用oie推薦用引物、探針和實時熒光pcr方法檢測，結果見圖14，結果顯示，oie推薦的實時熒光pcr檢測方法靈敏度可達0.00523ng/ml。可見，本例的用于h7亞型禽流感病毒檢測的引物對和探針，及rpa檢測方法，與目前使用的oie推薦的實時熒光pcr方法相比，靈敏度相當，而本例的rpa檢測方法所用的時間大大縮短，所需設備也簡便，適合于野外現場檢測。6.rt-rpa檢測方法田間樣本應用本例對采集的30份雞泄殖腔拭子和咽拭子，以及5份標準毒株，分別采用oie推薦的引物與探針，和本例的rpa檢測方法，進行檢測。結果顯示，兩個檢測方法的結果一致，30份雞泄殖腔拭子和咽拭子為陰性，5份標準毒株為陽性。可見，本例的rpa檢測方法可以替代現有的實時熒光pcr檢測方法。以上內容是結合具體的實施方式對本申請所作的進一步詳細說明，不能認定本申請的具體實施只局限于這些說明。對于本申請所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本申請構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本申請的保護范圍。sequencelisting<110>深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心華南農業大學<120>用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法和應用<130>17i24394<160>11<170>patentinversion3.3<210>1<211>31<212>dna<213>人工序列<400>1gcaacagggatgaagaatgttcctgagattc31<210>2<211>32<212>dna<213>人工序列<400>2gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatc32<210>3<211>52<212>dna<213>人工序列<400>3gggaagaggcctatttggtgctatagcgggtttcattgaaaatggatgggaa52<210>4<211>39<212>dna<213>人工序列<400>4gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatcaattagg39<210>5<211>34<212>dna<213>人工序列<400>5gtcaaacacagataatgctgcattcccgcagatg34<210>6<211>54<212>dna<213>人工序列<400>6ctaagtcatataaaaatacaagaaaaagcccagctataatagtatgggggatcc54<210>7<211>36<212>dna<213>人工序列<400>7cccaactgtcaccagtttgtttccactcccatatag36<210>8<211>30<212>dna<213>人工序列<400>8cccaactgtcaccagtttgtttccactccc30<210>9<211>26<212>dna<213>人工序列<400>9ggcaatgcaaaatagaatacagattg26<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10cccagtcaaactaagcagcggc22<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列<400>11ccccgaagctaaaccaaagtatc23當前第1頁12