專利名稱：一種分離檢測afp亞型的新方法
技術領域：
本發明屬于醫學生物技術領域，涉及一種肝癌特異性AFP亞型 (Hepatoma-specific Alpha-fetoprotein Isoform,HS-AFP)分離檢測法，具體為應用聚丙烯酰胺凝膠電泳結合免疫印跡技術定性檢測血清樣本中的HS-AFP。人外周血中HS-AFP的增加與原發性肝癌的發生發展存在密切關聯，運用該方法檢測外周血中HS-AFP，對原發性肝癌的診斷、鑒別診斷、肝癌監測、手術預后判斷及肝硬化癌變預測均具有較高價值。
背景技術：
肝癌是最常見惡性腫瘤之一，其預后在很大程度上取決于能否得到早診早治。肝
癌
的診斷包括影像學的定位診斷和肝癌標志物的定性診斷。許多早期肝癌缺乏典型的影像學改變，此時定性診斷尤為重要。在我國肝癌發病的高危人群為慢性肝病尤其是乙肝后肝硬化患者，對這部分肝癌高危人群定期進行肝癌標志物檢測對肝癌的早期診斷具有重要價值。血清甲胎蛋白(AFP)是公認最佳肝癌標志物，對肝癌的篩選、診斷以及復發監測均有重要價值。但許多小肝癌AFP濃度較低，出現AFP假陰性，而良性肝病有時也可出現AFP升高假陽性。因此單靠檢測AFP水平不能滿足臨床需要。為進一步提高AFP對肝癌的診斷價值，許多學者對AFP亞型進行了研究，發現AFP存在糖鏈異構體。不同AFP糖鏈異構體與植物凝集素的親和力不同，據此利用植物凝集素親和電泳可將AFP分離出不同的亞型。肝癌患者血清中巖藻糖化的AFP增多，后者可與扁豆凝集素(lens culinaris agglutinin A) 有親和作用，被命名為AFP-L3。近年來國外不少學者對AFP-L3對肝癌的診斷價值進行了研究，證實AFP-L3升高(占總AFP 15%以上)主要見于肝癌。良性肝病盡管會出現總AFP升高，但AFP-L3很少升高。AFP-L3在臨床發現肝癌9 12個月之前即可出現陽性，AFP-L3 還與患者的轉移及生存期相關。因此，AFP-L3對肝癌的診斷、鑒別診斷以及病情監測價值遠比血清AFP濃度為高。AFP亞型的另一種分離方法是根據不同AFP亞型間等電點的差別采用等電聚焦電泳法進行分離。Burditt等用等電點聚膠電泳將血清AFP分為4條區帶，發現區帶III和IV為肝癌特異性區帶。Ho等也發現2條不同等電點的肝癌特異性區帶，有助于AFP升高的良性肝病與肝癌的鑒別診斷。目前用于AFP亞型的檢測方法都根據AFP糖鏈異構體與植物凝集素親和力或等電點的差異而進行的。不但方法繁瑣，更由于親和電泳所需凝集素和等電聚焦電泳所需兩性電解質價格都非常昂貴，故AFP亞型檢測未能在臨床上推廣應用。我們利用不連續緩沖系統聚丙烯酰胺凝膠電泳體系分離AFP亞型，結合免疫印跡技術檢測肝癌特異性AFP。既省去了昂貴的植物凝集素和兩性電解質，大大降低檢測成本， 又簡化操作，具有價廉、簡便及重復性好的優點，且無需特殊條件及儀器，使肝癌特異性AFP 檢測能在臨床推廣應用。該方法國內外均未見其他相關報道
發明內容
本發明的目的是提供一種靈敏特異、價廉、簡便及重復性好的肝癌特異性AFP亞型檢測方法。本發明的目的是通過以下方法實現的制備2個濃度梯度的聚丙烯酰胺凝膠，自上而下分別為88.0 g/L和50.0 g/L，在每個加樣孔中分別加入上樣緩沖液及血清樣品(混勻)，以自然聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離肝癌特異性AFP亞型，再將AFP亞型從聚丙烯酰胺凝膠上轉移至硝酸纖維膜，并與兔抗人AFP Ig G—抗反應，再加入HRP-羊抗兔Ig G 二抗， 最后以DAB顯色。肉眼觀察AFP區帶分布情況。本發明檢測肝癌特異性AFP亞型方法，其包括以下組份
(1)聚丙烯酰胺溶液準確稱取四.2 g聚丙烯酰胺，0.9 g亞甲基雙丙烯酰胺，均放入 100 ml的燒杯中，加入去離子水6 0ml，加熱并攪拌使之完全溶解，倒入100 ml的容量瓶中，去離子水沖洗燒杯數次均倒入容量瓶中，定容至100 ml，過濾備用，冷藏保存。(2)分離膠緩沖液準確稱取Tris 18. 10 g，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml攪拌，用濃鹽酸滴定至pH 8. 30，去離子水定容至 100 ml，冷藏保存。(3)濃縮膠緩沖液準確稱取Tris 6. 0 g，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml攪拌，用濃鹽酸滴定至pH 6. 80，去離子水定容至100
毫升，冷藏保存。(4)過硫酸銨溶液準確稱取0. 14 g過硫酸銨，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水50 ml攪拌溶解，避光冷藏保存。(5)上樣緩沖液1.0 M Tris-HCl 緩沖液(pH6. 8)3. 1 ml, 5. 0 ml 甘油，1.0 g/L溴酚藍0.5 ml，加去離子水至10 ml，冷藏保存。(6)陽極電泳緩沖液準確稱取Tris 37. 85g，吸取濃鹽酸20. 8 ml，放入500 ml的燒杯中，加入去離子水300 ml，攪拌使之完全溶解，去離子水定容至1000 ml。冷藏保存。(7)陰極電泳緩沖液準確稱取Tris 22. 8 g，硼酸45. 0g，放入500 ml的燒杯中， 加入去離子水300 ml，攪拌使之完全溶解，去離子水定容至1000 ml。冷藏保存。(8)蛋白印跡(轉移)緩沖液準確稱取甘氨酸2. 90 g，Tris 5. 80 g，放入100 ml 的燒杯中，加入去離子水50 ml，攪拌使之完全溶解，倒入1000 ml的容量瓶中，加入200 ml 無水甲醇，去離子水定容至1000 ml。冷藏保存。(9)顯色液準確稱取 DAB 7. 0 mg，放入 100 ml 的燒杯，加 0. 01 M PBS (pH7. 4) 10 ml，攪拌使之完全溶解，加入飽和硫酸鎳銨0. 2 ml。顯色前加入H2A 20 μ 。(10)—抗為兔抗人AFP Ig G :DAK0公司生產。(11) 二抗為HRP-羊抗兔Ig G 西安華美公司生產。(12)磷酸鹽緩沖液(0.01 M PBS):稱 7.9 g NaCl,0. 2 g KCl,0. 24 g KH2PO4 和 1.8 g K2HPO4，溶于800 ml蒸餾水中，用HCl調節溶液的pH值至7. 4，去離子水定容至1 L。
冷藏保存。(13)硝酸纖維膜德國Protran TM公司生產。本發明檢測肝癌特異性AFP亞型步驟如下
(1)制膠使用Hml體積垂直平板電泳槽，膠厚1mm，玻璃板間下端先以10.0 g/L瓊脂糖封口，按下表所示量分別配制聚丙烯酰胺濃度分別為88. Og/L的分離膠及50. Og/L的濃縮膠，靜置待凝。 表膠板配制中各溶液所取量(ml)
權利要求
1.聚丙烯酰胺凝膠電泳結合免疫印跡技術檢測血清樣本中的肝癌特異性AFP亞型其特征在于包括以下組份(1)聚丙烯酰胺溶液準確稱取四.2g聚丙烯酰胺，0.9 g亞甲基雙丙烯酰胺，均放入 100 ml的燒杯中，加入去離子水6 0ml，加熱并攪拌使之完全溶解，倒入100 ml的容量瓶中，去離子水沖洗燒杯數次均倒入容量瓶中，定容至100 ml，過濾備用，冷藏保存；(2)分離膠緩沖液準確稱取1Tris18.10 g，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml攪拌，用濃鹽酸滴定至pH 8. 30，去離子水定容至100 ml，冷藏保存；(3)濃縮膠緩沖液準確稱取Tris6. 0 g，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水50 ml 及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml攪拌，用濃鹽酸滴定至pH 6. 80，去離子水定容至100毫升，冷藏保存；(4)過硫酸銨溶液準確稱取0.14 g過硫酸銨，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水 50 ml攪拌溶解，避光冷藏保存；(5)上樣緩沖液1.0 M Tris-HCl 緩沖液(pH6. 8) 3. 1 ml, 5.0 ml 甘油，1.0 g/L 溴酚藍0.5 ml，加去離子水至10 ml，冷藏保存；(6)陽極電泳緩沖液準確稱取Tris37. 85g，吸取濃鹽酸20. 8 ml，放入500 ml的燒杯中，加入去離子水300 ml，攪拌使之完全溶解，去離子水定容至1000 ml冷藏保存；(7)陰極電泳緩沖液準確稱取Tris22.8 g，硼酸45. 0g，放入500 ml的燒杯中，加入去離子水300 ml，攪拌使之完全溶解，去離子水定容至1000 ml冷藏保存；(8)蛋白印跡(轉移)緩沖液準確稱取甘氨酸2.90 g，Tris 5. 80 g，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水50 ml，攪拌使之完全溶解，倒入1000 ml的容量瓶中，加入200 ml無水甲醇，去離子水定容至1000 ml冷藏保存；(9)顯色液準確稱取DAB7.0 mg，放入100 ml的燒杯，加0.01 M PBS(pH7. 4)10 ml, 攪拌使之完全溶解，加入飽和硫酸鎳銨0.2 ml，顯色前加入H2A 20 μ ；(10)—抗為兔抗人AFPIg G :DAK0公司生產；(11)二抗為HRP-羊抗兔Ig G 西安華美公司生產；(12)磷酸鹽緩沖液(0.01 M PBS):稱 7. 9 g NaCl,0. 2 g KCl,0. 24 g KH2PO4 和 1. 8 g K2HPO4，溶于800 ml蒸餾水中，用HCl調節溶液的pH值至7. 4，去離子水定容至1 L，冷藏保存；(13)硝酸纖維膜德國ProtranTM公司生產。
2.聚丙烯酰胺凝膠電泳結合免疫印跡技術檢測血清樣本中的肝癌特異性AFP亞型其特征在于包括以下步驟(1)制膠使用14ml體積垂直平板電泳槽，膠厚1mm，玻璃板間下端先以10.0 g/L瓊脂糖封口，按下表所示量分別配制聚丙烯酰胺濃度分別為88. Og/L的分離膠及50. Og/L的濃縮膠，靜置待凝；(2)加樣電泳取4μ 上樣緩沖液及14 μ 血清樣品混勻，分別加入電泳膠板的每個加樣孔，將電泳膠板放入電泳槽，在上槽中加入陰極電泳緩沖液，下槽中加入陽極電泳緩沖液，并將電泳槽放入4°C冰箱內接通電源，60 V穩壓電泳約1 h后，調整電壓為100 V，電泳 3.5 h結束電泳；(3 )轉移小心取下凝膠，在左下角做好標記，放入已加入轉移緩沖液的培養皿內，搖床上平穩搖動，換液三次，每次搖動5分鐘，在此之前約半小時事先用轉移緩沖液浸透轉移電泳槽、濾紙和硝酸纖維膜(NC膜)，在轉移電泳槽的下層碳板(即陽極碳板)上按從下到上的順序依次放好M層濾紙、NC膜、凝膠、M層濾紙，每層均要小心緩慢趕走氣泡，輕輕放上陰極碳板，電泳槽放入4°C冰箱內接通電源，設置為穩流，按每平方厘米NC膜面積電流為ImA 設置，轉移3. 5 h；(4)包被轉移結束后，取出NC膜置培養皿中，以0.01M PBS洗膜三次，每次5 min ； 稱取1. 0 g脫脂奶粉，溶解于20 ml的0. 01 M PBS中，倒入洗好的NC膜上，37°C水浴、1 h；(5)抗原抗體反應棄去牛奶，0.01M PBS洗膜三次，每次5 min，加入1:100稀釋的兔抗人AFP IgG，置濕盒4°C冰箱過夜或37°C水浴1 h，再以0.01 M PBS洗NC膜三次，每次5 min，再加入1:100稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，37°C水浴1 h;(6)顯色以0.01M PBS洗膜三次，每次5 min，置DAB顯色液中避光顯色3 min，棄去 DAB顯色液，流水沖洗終止反應，肉眼觀察AFP區帶分布情況。
全文摘要
本發明應用聚丙烯酰胺凝膠電泳結合免疫印跡技術定性檢測血清樣本中的肝癌特異性AFP亞型(HS-AFP)。包括以下組份聚丙烯酰胺溶液；分離膠緩沖液；濃縮膠緩沖液；過硫酸銨溶液；上樣緩沖液；陽極電泳緩沖液；陰極電泳緩沖液；蛋白印跡(轉移)緩沖液；顯色液；一抗(兔抗人AFPIgG)；二抗(HRP-羊抗兔IgG)；磷酸鹽緩沖液(0.01MPBS)；硝酸纖維膜。其檢測步驟包括(1)制膠自上而下2個濃度梯度分別為88.0g/L和50.0g/L；(2)加樣電泳；(3)轉移；(4)包被；(5)抗原抗體反應；(6)顯色，肉眼觀察AFP區帶分布情況。
文檔編號G01N33/68GK102353791SQ20111018121
公開日2012年2月15日 申請日期2011年6月30日 優先權日2011年6月30日
發明者倪潤洲, 肖明兵, 陳不尤 申請人:倪潤洲, 肖明兵, 陳不尤