專利名稱：一種新亞型CaMKIIα3的基因及克隆方法、表達的蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)，特別是猴腦中一種新亞型CaMKIIα3的基因、克隆方法、鑒定方法及其應用。
背景技術：
鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在大腦組織中大量表達。其表達具有神經細胞特異性和腦區特異性，而且表達量和神經系統發育相關、是構成突觸后密度的主要成分。CaMKIIα具有廣泛的底物，并具有鈣離子依賴活性和自身磷酸化的特性。CaMKIIα在過去的二十多年中成為神經科學家們研究的焦點，并被公認為“記憶分子”。大量實驗證據也表明CaMKIIα確實在突觸可塑性、LTP等學習與記憶機制中起著重要的作用。隨著衰老，CaMKIIα在腦中的表達量和活性明顯下降，研究顯示CaMKIIα與老年癡呆相關的tau蛋白和淀粉樣前體蛋白(APP)的磷酸化有關，并發現在老年癡呆腦中的CaMKII磷酸化水平下降，而且在大腦的海馬區表達量也明顯下降。
CaMKIIα是CaMKII家族中在進化中出現的最晚的一種亞型，僅存在于鳥類和哺乳動物中。在哺乳動物中，CaMKIIα的序列是高度保守的。在mRNA水平上，大鼠的CaMKIIα的的編碼區序列和人的有93％同源性。而在蛋白水平，大鼠和人的CaMKIIα的氨基酸序列是完全一致的。包括CaMKIIα在內CaMKII家族的四種亞型在結構上都具有一定的相似性，即從N端到C端分別為催化區、自主調節區和結合區。CaMKII的各亞型之間的主要區別是位于結合區內的一小段多變區，各亞型的不同異構體也是由于多變區的不同剪切形成的。CaMKII家族成員β、γ、δ亞型均具有多種異構體(分別為8種、13種、15種)，與之不同的是，CaMKIIα在小鼠、大鼠和人類中僅發現3種異構體，而在腦中僅存在兩種，分別為CaMKIIα和CaMKIIαB。CaMKIIαB和CaMKIIα的區別在于CaMKIIαB比CaMKIIα在結合區的多變區增加了一段33bp的外顯子，即多了11個氨基酸。GenBank中的序列號分別為小鼠CaMKIIα(BC031745)、大鼠CaMKIIα(NM_012920)、人CaMKIIα(BC040457)和人CaMKIIαB(NM_015981)(小鼠、大鼠的CaMKIIαB尚未上傳至GenBank)。

發明內容
本發明的目的在于提供一種新的鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)亞型CaMKIIα3的cDNA序列，并提供克隆該序列及鑒定該序列是否表達的方法。使其一方面可以用于學習與記憶機制的研究，另一方面CaMKIIα3可作為老年癡呆癥的新藥物靶標，同時對于大腦疾病、學習記憶相關疾病及老年癡呆癥等的基因治療和藥物開發提供新的途徑。
本發明的技術方案如下編碼鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亞型CaMKIIα3的基因，其cDNA核苷酸序列如SEQ No1所示，或者編碼SEQ No2的氨基酸序列。
鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亞型蛋白，具有SEQ No2的氨基酸序列。
所述編碼鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亞型CaMKIIα3的基因的克隆方法，包括以下步驟a)提取腦組織總RNA；b)反轉錄得到cDNA；c)PCR擴增。
其中PCR擴增使用以下一個或多個引物a)5’-AGCCTCACCTGCCTGCCCAGCGCCAGGATG-3’b)5’-GAGGCAGGACGGGGTGACTCCCTGGTCCGA-3’c)5’-TCAGAGAGCACCAACACCACCATCG-3’d)5’-GGATGTAGGCGATGCAGGCTGACTC-3’e)5’-AAGCACCCCTGGATCTCGCACC-3’f)5’-GCAGGCTGACTCGTCGCCCATC-3’含有上述編碼鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亞型CaMKIIα3的基因序列的載體。
含有上述編碼鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亞型CaMKIIα3的基因序列的感受態細胞。
含有上述編碼鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亞型CaMKIIα3的基因及其表達的蛋白用于制備治療老年癡呆癥的藥物。
具體方法如下從猴腦組織中提取總RNA，猴腦中CaMKIIα和CaMKIIαB的cDNA序列，GenBank中核酸序列Blast結果顯示其和小鼠的CaMKIIα同源性為94％，和大鼠的CaMKIIα同源性為94％，和人的CaMKIIα、CaMKIIαB同源性為98％。而翻譯成的氨基酸序列也是完全一致的。該結果進一步證明了CaMKIIα在進化上的高度保守性，但同時也說明，同為高級哺乳動物靈長類的猴和人的CaMKIIα的一致性更高，進化上更相近。
本發明的CaMKIIα3作為一種新的CaMKIIα異構體，也具有和人的CaMKIIα的98％同源性，但相對于人的CaMKIIα缺失了兩段共171bp的外顯子，即缺失了57個氨基酸。CaMKIIα3和人的CaMKIIα和CaMKIIαB的編碼氨基酸序列比對結果如下猴的CaMKIIα3和人的CaMKIIα和CaMKIIαB的編碼氨基酸序列比對結果(MultipleSequence Alignment by CLUSTALW網址http//align.genomejp/)Human_CaMKIIα_BMATITCTRFTEEYQLFEELGKGAFSVVRRCVKVLAGQEYAAKIINTKKLSARDHQKLEREHuman_CaMKIIα_ MATITCTRFTEEYQLFEELGKGAFSVVRRCVKVLAGQEYAAKIINTKKLSARDHQKLEREMonkey_CaMKIIα_3 MATITCTRFTEEYQLFEELGKGAFSVVRRCVKVLAGQEYAAKIINTKKLSARDHQKLEREHuman_CaMKIIα_BARICRLLKHPNIVRLHDSISEEGHHYLIFDLVTGGELFEDIVAREYYSEADASHCIQQILHuman_CaMKIIα_ ARICRLLKHPNIVRLHDSISEEGHHYLIFDLVTGGELFEDIVAREYYSEADASHCIQQILMonkey_CaMKIIα_3 ARICRLLKHPNIVRLHDSISEEGHHYLIFDLVTGGELFEDIVAREYYSEADASHCIQQILHuman_CaMKIIα_BEAVLHCHQMGVVHRDLKPENLLLASKLKGAAVKLADFGLAIEVEGEQQAWFGFAGTPGYLHuman_CaMKIIα_ EAVLHCHQMGVVHRDLKPENLLLASKLKGAAVKLADFGLAIEVEGEQQAWFGFAGTPGYLMonkey_CaMKIIα_3 EAVLHCHQMGVVHRDLKPENLLLASKLKGAAVKLADFGLAIEVEGEQQAWFGFAGTPGYLHuman_CaMKIIα_BSPEVLRKDPYGKPVDLWACGVILYILLVGYPPFWDEDQHRLYQQIKAGAYDFPSPEWDTVHuman_CaMKIIα_ SPEVLRKDPYGKPVDLWACGVILYILLVGYPPFWDEDQHRLYKQIKAGAYDFPSPEWDTVMonkey_CaMKIIα_3 SPEVLRKDPYGKPVDLWACGVILYILLVGYPPFWDEDQHRLYQQIKAGAYDFPSPEWDTVHuman_CaMKIIα_BTPEAKDLINKMLTINPSKRITAAEALKHPWISHRSTVASCMHRQETVDCLKKFNARRKLKHuman_CaMKIIα_ TPEAKDLINKMLTINPSKRITAAEALKHPWISHRSTVASCMHRQETVDCLKKFNARRKLKMonkey_CaMKIIα_3 TPEAKDLINKMLTINPSKRITAAEALKHPWISHRSTVASCMHRQETVDCLKKFNARRKLKHuman_CaMKIIα_BGAILTTMLATRNFSGGKSGGNKKSDGVKKRKSSSSVQLMESSESTNTTIEDEDTKVRKQEHuman_CaMKIIα_ GAILTTMLATRNFSGGKSGGNKKSDGVK-----------ESSESTNTTIEDEDTKVRKQEMonkey_CaMKIIα_3 GAILTTMLATRNFSGGKSGGNKKSDGVK-----------ESSESTNTTIEDEDTKV----Human_CaMKIIα_BIIKVTEQLIEAISNGDFESYTKMCDPGMTAFEPEALGNLVEGLDFHRFYFENLWSRNSKPHuman_CaMKIIα_ IIKVTEQLIEAISNGDFESYTKMCDPGMTAFEPEALGNLVEGLDFHRFYFENLWSRNSKPMonkey_CaMKIIα_3 -----------------------------------------------------WSRNSKPHuman_CaMKIIα_BVHTTILNPHIHLMGDESACIAYIRITQYLDAGGIPRTAQSEETRVWHRRDGKWQIVHFHRHuman_CaMKIIα_ VHTTILNPHIHLMGDESACIAYIRITQYLDAGGIPRTAQSEETRVWHRRDGKWQIVHFHRMonkey_CaMKIIα_3 VHTTILNPHIHLMGDESACIAYIRITQYLDAGGIPRTAQSEETRVWHRRDGKWQIVHFHRHuman_CaMKIIα_BSGAPSVLPHHuman_CaMKIIα_ SGAPSVLPHMonkey_CaMKIIα_3 SGAPSVLPH
在本發明的過程中通過取大鼠和狗相同部位組織，提取RNA，設計特異性引物，用RT-PCR的方法進行比較，發現大鼠(Rattus norvegicus)和狗(Canis familiaris)前腦皮層組織中不表達CaMKIIα3，CaMKIIα3僅存在于猴腦中，見附圖2。
該結果表明，CaMKIIα3的產生是一種進化上的表現，并推測人腦中也很有可能存在這樣一種CaMKIIα3。對于在進化過程中神經系統的進化，高等動物相對于低等動物學習和記憶能力明顯增強這一現象，其中存在的機制，一直是神經科學家們研究的焦點，也是一個難點。到現在為止，對于學習和記憶的研究大多還都局限在老鼠上，但是這些研究的最終目的都是為了解開人腦學習和記憶之迷，及尋找治療神經性疾病的方法。因此，本發明作為“記憶分子”CaMKIIα的一種僅在猴腦中存在的異構體，對于在神經科學領域的學習和記憶機制的研究將有極大的應用價值，并且對于老年癡呆這種神經退行性疾病在人類中多發病，而在小鼠、大鼠中一般不發病這一現象，本發明也有一定的提示作用。


圖1為克隆CaMKIIαcDNA為模板PCR產物1％瓊脂糖凝膠電泳圖譜，條帶1為有CaMKIIα3插入子的克隆，條帶2為有CaMKIIα或CaMKIIαB插入子的克隆，條帶3為自連接的陰性克隆。
圖2為大鼠、狗和猴前腦皮層cDNA為模版的PCR產物2％瓊脂糖凝膠電泳圖譜，條帶1、2、3分別為大鼠、狗和猴的PCR鑒定結果。
具體實施例方式
實施例1猴腦中總RNA提取1.組織樣品的分離在云南版納靈長類實驗動物中心，由專人取成年獼猴的大腦，并將各腦區分離，迅速投入液氮中，冷凍后保存于實驗室-70℃冰箱，準備提取組織總RNA。
2.猴腦前腦皮層總RNA提取1)RNA提取前的準備工作玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡過夜，用自來水反復沖洗，再用蒸餾水沖洗3遍，180℃烘烤4小時。
瓷質研缽用自來水反復沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗3遍，180℃烘烤4小時。
塑料勻漿頭先用自來水反復沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗3遍，烘干，再用0.1％DEPC水處理過夜，第二天高壓蒸汽滅菌使DEPC滅活，烘干備用。
2)總RNA提取A.勻漿取60～100mg凍存組織在盛有液氮的研缽中，迅速磨成粉末，倒入已加入1mlTrizol(Invitrogen)的EP管中，再用勻漿器打散。勻漿后，4℃12000g離心10分鐘。取均一的勻漿液于另一干凈的EP管中。
B.分層勻漿液室溫靜置5分鐘，加0.2ml氯仿，蓋緊EP管蓋，劇烈振蕩15秒，再室溫靜置2～3分鐘，4℃12000g離心15分鐘，然后小心吸取上清約600μl至另一干凈的EP管。
C.RNA沉淀加入0.5ml異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，4℃12000g離心10分鐘，可見膠狀沉淀，小心棄上清。
D.RNA清洗加1ml75％乙醇，振蕩混勻，4℃7500g離心5分鐘。
F.重溶RNA小心棄上清，并用槍頭吸掉多余上清。空氣中干燥5～10分鐘。加入20～30μlDEPC處理水重溶。RNA長期貯存于-70℃冰箱。
3)RNA鑒定通過分光光度計測定RNA含量并且用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質量。
實施例2 CaMKIIα3cDNA克隆和鑒定1)PCR引物的設計和合成根據GenBank中發表的小鼠CaMKIIα(BC031745)、大鼠CaMKIIα(NM_012920)、人CaMKIIα(BC040457)和人CaMKIIαB(NM_015981)的序列的同源性，運用Primer Premier5.0軟件選擇性的在CaMKIIα起始密碼子ATG和終止密碼子TGA附近設計引物對S1、A1，以克隆出全長開放閱讀框(CDS)。同時在多變區設計可以在挑選單克隆時鑒定CaMKIIα3的引物對S2、A2。并且跨多變區設計可以鑒定不同物種中CaMKIIα種類的引物對S3、A3。引物序列見下表

2)反轉錄反應(Reverse Transcription)按Invitrogen M-MLV Reverse Transcription Kit進行反應，反應液組成及反應條件組織總RNA 5μg，Oligo(dT)15(500μg/ml)1μl，dNTP(10mM)1μl，加DEPC處理水補足至12μl，65℃5分鐘，迅速冰浴，輕輕離心，收集。在加入5×First-Strand Buffer 4μl，DTT(0.1M)2μl，RNaseOUTTMRecombinant Ribonuclease Inhibitor(40unit/μl)1μl，輕輕混勻，37℃2分鐘，加入M-MLVRTaa1μl，槍頭輕輕吹打混勻，37℃50分鐘，最后70℃15分鐘滅活。
3)PCR反應猴腦中CaMKIIαcDNA的克隆以反轉錄反應所得的cDNA為模板，引物對S1、A1，高保真DNA聚合酶Pyrobest(Takara)，反應程序為94℃5分鐘，然后94℃25秒，72℃3分鐘，循環5次，再94℃25秒，67℃3分鐘，循環20次，最后67℃7分鐘。PCR反應結束后取少量反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，若有1500bp大小目標條帶，則進行后續的PCR產物尾部加A反應，以便進行T載體克隆，即在原反應溶液中加入微量DNA聚合酶LA taq(Takara)，72℃反應30分鐘。
4)克隆和鑒定PCR反應產物跑膠純化回收，與pMD18-T(Takara)相連接，連接產物轉化感受態DH5α。挑單克隆進行菌落PCR鑒定，用引物對S2、A2，DNA聚合酶Ex taq(Takara)，反應程序為94℃5分鐘，然后94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，循環30次，最后72℃10分鐘。跑1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其中有CaMKIIα或CaMKIIαB插入子的克隆，應PCR得到306bp條帶，而有CaMKIIα3插入子的應PCR得到135bp條帶，見附圖一(1為有CaMKIIα3插入子的克隆，2為有CaMKIIα或CaMKIIαB插入子的克隆，3為自連接的陰性克隆)，選取正確克隆進行測序(博亞生物技術有限公司)。經測序得到的CaMKIIα3cDNA序列和編碼氨基酸序列如下(1)猴腦中一種新的鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)亞型CaMKIIα3的cDNA核苷酸序列1 ATGGCCACCA TCACCTGCAC CCGCTTCACG GAAGAGTACC AGCTCTTCGA GGAATTGGGC61 AAGGGAGCCT TCTCGGTGGT GCGAAGGTGT GTGAAGGTGC TGGCCGGCCA GGAGTATGCT121 GCCAAGATCA TCAACACCAA GAAGCTGTCA GCCAGAGACC ATCAGAAGCT GGAGCGTGAA181 GCCCGCATCT GCCGCCTGCT GAAGCACCCC AACATTGTCC GACTCCATGA CAGCATCTCA241 GAGGAGGGAC ACCACTACCT GATCTTCGAC CTGGTCACTG GTGGGGAACT GTTTGAAGAT301 ATCGTGGCCC GGGAGTATTA CAGTGAGGCG GATGCCAGTC ACTGTATCCA GCAGATCCTG361 GAGGCTGTGC TGCACTGCCA CCAGATGGGG GTGGTGCACC GGGACCTGAA GCCTGAGAAT421 CTGTTGCTGG CCTCCAAGCT CAAGGGTGCC GCAGTGAAGC TGGCAGACTT TGGCCTGGCC481 ATAGAGGTGG AGGGGGAGCA GCAGGCATGG TTTGGGTTTG CAGGGACTCC TGGATACCTC
541 TCCCCAGAAG TGCTGCGGAA GGACCCATAC GGGAAGCCTG TGGACCTGTG GGCTTGTGGG601 GTCATCCTGT ACATCCTGCT GGTTGGGTAC CCCCCATTCT GGGATGAGGA CCAGCACCGC661 CTGTACCAGC AGATCAAAGC CGGCGCCTAT GATTTCCCAT CACCAGAATG GGACACCGTC721 ACCCCGGAAG CCAAGGATCT GATCAATAAG ATGCTGACCA TTAACCCATC CAAACGCATC781 ACAGCTGCTG AAGCCCTTAA GCACCCCTGG ATCTCGCACC GCTCCACCGT GGCATCCTGC841 ATGCACAGAC AGGAGACCGT GGACTGCCTG AAGAAGTTCA ATGCCAGGAG GAAACTGAAG901 GGAGCCATTC TCACCACGAT GCTGGCCACC AGGAACTTCT CCGGAGGGAA GAGTGGGGGA961 AACAAGAAGA GCGATGGTGT GAAGGAATCC TCAGAGAGCA CCAATACCAC CATCGAGGAT1021 GAAGACACCA AAGTGTGGTC CCGGAACAGC AAGCCCGTGC ACACCACCAT CCTGAATCCC1081 CACATCCACC TGATGGGCGA CGAGTCAGCC TGCATCGCCT ACATCCGCAT CACGCAGTAC1141 CTGGACGCCG GCGGCATCCC ACGCACCGCC CAGTCGGAGG AGACCCGTGT CTGGCACCGC1201 CGGGACGGCA AATGGCAGAT CGTCCACTTC CACAGATCTG GGGCACCCTC CGTCCTGCCC1261 CACTGA(2)猴腦中一種新的鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)亞型CaMKIIα3，編碼有421個氨基酸的蛋白質，分子量47519道爾頓，等電點pI為8.02，其編碼氨基酸序列1 MATITCTRFT EEYQLFEELG KGAFSVVRRC VKVLAGQEYA AKIINTKKLS ARDHQKLERE61 ARICRLLKHP NIVRLHDSIS EEGHHYLIFD LVTGGELFED IVAREYYSEA DASHCIQQIL121 EAVLHCHQMG VVHRDLKPEN LLLASKLKGA AVKLADFGLA IEVEGEQQAW FGFAGTPGYL181 SPEVLRKDPY GKPVDLWACG VILYILLVGY PPFWDEDQHR LYQQIKAGAY DFPSPEWDTV241 TPEAKDLINK MLTINPSKRI TAAEALKHPW ISHRSTVASC MHRQETVDCL KKFNARRKLK301 GAILTTMLAT RNFSGGKSGG NKKSDGVKES SESTNTTIED EDTKVWSRNS KPVHTTILNP361 HIHLMGDESA CIAYIRITQY LDAGGIPRTA QSEETRVWHR RDGKWQIVHF HRSGAPSVLP421 H實施例3不同物種中CaMKIIα3表達情況分析用前面所述方法提取大鼠、狗前腦皮層總RNA，反轉錄出相應的cDNA。分別以大鼠、狗和猴前腦皮層cDNA為模版，引物對S1、A1，高保真DNA聚合酶Pyrobest(Takara)進行PCR反應(反應程序同上)。再以各反應產物的10倍稀釋液為模版，引物對S3、A3，DNA聚合酶Ex taq(Takara)，反應程序為94℃5分鐘，然后94℃25秒，60℃30秒，72℃30秒，35個循環，最后72℃10分鐘。跑2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。其中PCR得到的條帶大小應分別是CaMKIIαB519bp，CaMKIIα486bp和CaMKIIα3為315bp。結果見附圖二(1、2、3分別為大鼠、狗和猴的PCR鑒定結果)。從結果可以看出僅猴前腦皮層中PCR得到315bp的條帶(箭頭標出)，而大鼠和狗中僅能得到486bp的主帶，說明僅在猴腦中存在CaMKIIα3。同時猴前腦皮層中PCR還得到較亮的大于519bp的CaMKIIαB與CaMKIIα異二聚體條帶(*標出)，說明CaMKIIαB在猴腦皮層中的表達量相對大鼠和狗有明顯增加。
序列表<110>華東師范大學<120>CaMKIIα新亞型及基因序列和應用<160>2<210>1<211>1266<212>DNA<213>猴<400>1ATGGCCACCA TCACCTGCAC CCGCTTCACG GAAGAGTACC AGCTCTTCGA GGAATTGGGC60AAGGGAGCCT TCTCGGTGGT GCGAAGGTGT GTGAAGGTGC TGGCCGGCCA GGAGTATGCT120GCCAAGATCA TCAACACCAA GAAGCTGTCA GCCAGAGACC ATCAGAAGCT GGAGCGTGAA180GCCCGCATCT GCCGCCTGCT GAAGCACCCC AACATTGTCC GACTCCATGA CAGCATCTCA240GAGGAGGGAC ACCACTACCT GATCTTCGAC CTGGTCACTG GTGGGGAACT GTTTGAAGAT300ATCGTGGCCC GGGAGTATTA CAGTGAGGCG GATGCCAGTC ACTGTATCCA GCAGATCCTG360GAGGCTGTGC TGCACTGCCA CCAGATGGGG GTGGTGCACC GGGACCTGAA GCCTGAGAAT420CTGTTGCTGG CCTCCAAGCT CAAGGGTGCC GCAGTGAAGC TGGCAGACTT TGGCCTGGCC480ATAGAGGTGG AGGGGGAGCA GCAGGCATGG TTTGGGTTTG CAGGGACTCC TGGATACCTC540TCCCCAGAAG TGCTGCGGAA GGACCCATAC GGGAAGCCTG TGGACCTGTG GGCTTGTGGG600GTCATCCTGT ACATCCTGCT GGTTGGGTAC CCCCCATTCT GGGATGAGGA CCAGCACCGC660CTGTACCAGC AGATCAAAGC CGGCGCCTAT GATTTCCCAT CACCAGAATG GGACACCGTC720ACCCCGGAAG CCAAGGATCT GATCAATAAG ATGCTGACCA TTAACCCATC CAAACGCATC780ACAGCTGCTG AAGCCCTTAA GCACCCCTGG ATCTCGCACC GCTCCACCGT GGCATCCTGC840ATGCACAGAC AGGAGACCGT GGACTGCCTG AAGAAGTTCA ATGCCAGGAG GAAACTGAAG900GGAGCCATTC TCACCACGAT GCTGGCCACC AGGAACTTCT CCGGAGGGAA GAGTGGGGGA960AACAAGAAGA GCGATGGTGT GAAGGAATCC TCAGAGAGCA CCAATACCAC CATCGAGGAT1020GAAGACACCA AAGTGTGGTC CCGGAACAGC AAGCCCGTGC ACACCACCAT CCTGAATCCC1080CACATCCACC TGATGGGCGA CGAGTCAGCC TGCATCGCCT ACATCCGCAT CACGCAGTAC1140CTGGACGCCG GCGGCATCCC ACGCACCGCC CAGTCGGAGG AGACCCGTGT CTGGCACCGC1200CGGGACGGCA AATGGCAGAT CGTCCACTTC CACAGATCTG GGGCACCCTC CGTCCTGCCC1260CACTGA 1266
<210>2<211>421<212>PRT<213>猴<400>2Met Ala Thr Ile Thr Cys Thr Arg Phe Thr Glu Glu Tyr Gln Leu Phe Glu Glu Leu Gly 20Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val Lys Val Leu Ala Gly Gln Glu Tyr Ala 40Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys Lys Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu 60Ala Arg Ile Cys Arg Leu Leu Lys His Pro Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile Ser 80Glu Glu Gly His His Tyr Leu Ile Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly Glu Leu Phe Glu Asp 100Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp Ala Ser His Cys Ile Gln Gln Ile Leu 120Glu Ala Val Leu His Cys His Gln Met Gly Val Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn 140Leu Leu Leu Ala Ser Lys Leu Lys Gly Ala Ala Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala 160Ile Glu Val Glu Gly Glu Gln Gln Ala Trp Phe Gly Phe Ala Gly Thr Pro Gly Tyr Leu 180Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Asp Pro Tyr Gly Lys Pro Val Asp Leu Trp Ala Cys Gly 200Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu Val Gly Tyr Pro Pro Phe Trp Asp Glu Asp Gln His Arg 220Leu Tyr Gln Gln Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Asp Phe Pro Ser Pro Glu Trp Asp Thr Val 240Thr Pro Glu Ala Lys Asp Leu Ile Asn Lys Met Leu Thr Ile Asn Pro Ser Lys Arg Ile 260Thr Ala Ala Glu Ala Leu Lys His Pro Trp Ile Ser His Arg Ser Thr Val Ala Ser Cys 280Met His Arg Gln Glu Thr Val Asp Cys Leu Lys Lys Phe Asn Ala Arg Arg Lys Leu Lys 300Gly Ala Ile Leu Thr Thr Met Leu Ala Thr Arg Asn Phe Ser Gly Gly Lys Ser Gly Gly 320Asn Lys Lys Ser Asp Gly Val Lys Glu Ser Ser Glu Ser Thr Asn Thr Thr Ile Glu Asp 340Glu Asp Thr Lys Val Trp Ser Arg Asn Ser Lys Pro Val His Thr Thr Ile Leu Asn Pro 360His Ile His Leu Met Gly Asp Glu Ser Ala Cys Ile Ala Tyr Ile Arg Ile Thr Gln Tyr 380Leu Asp Ala Gly Gly Ile Pro Arg Thr Ala Gln Ser Glu Glu Thr Arg Val Trp His Arg 400Arg Asp Gly Lys Trp Gln Ile Val His Phe His Arg Ser Gly Ala Pro Ser Val Leu Pro 420His 42權利要求
1.編碼鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亞型CaMKIIα3的基因，其特征在于，其cDNA核苷酸序列如SEQ No1所示，或者編碼SEQ No2的氨基酸序列。
2.鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶II alpha(CaMKIIα)的新亞型蛋白，其特征在于，具有SEQNo2的氨基酸序列。
3.權利要求1所述基因的克隆方法，包括以下步驟a)提取腦組織總RNA；b)反轉錄得到cDNA；c)PCR擴增。
4.權利要求3的克隆方法，其特征在于，使用以下一個或多個引物a)5’-AGCCTCACCTGCCTGCCCAGCGCCAGGATG-3’b)5’-GAGGCAGGACGGGGTGACTCCCTGGTCCGA-3’c)5’-TCAGAGAGCACCAACACCACCATCG-3’d)5’-GGATGTAGGCGATGCAGGCTGACTC-3’e)5’-AAGCACCCCTGGATCTCGCACC-3’f)5’-GCAGGCTGACTCGTCGCCCATC-3’。
5.含有權利要求1所述基因序列的載體。
6.含有權利要求1所述基因序列的感受態細胞。
7.權利要求1的基因在制備治療老年癡呆癥藥物中的應用。
8.權利要求2的蛋白在制備治療老年癡呆癥藥物中的應用。
全文摘要
CaMKIIα新亞型及基因序列和應用，從猴腦皮層組織克隆出的鈣離子/鈣調素依賴性蛋白激酶IIalpha(CaMKIIα)新的異構體CaMKIIα3，該異構體cDNA編碼框全長1266bp，編碼有421個氨基酸的蛋白質，分子量47519道爾頓，等電點pI為8.02。CaMKIIα在神經科學學習與記憶機制研究中起著重要作用，被認為是一種“記憶分子”。CaMKIIα的表達量下降和老年癡呆癥有關。CaMKIIα3在大鼠和狗前腦皮層中沒有發現；作為新的CaMKIIα亞型的異構體，可參與高級哺乳動物的高級神經認知，作為學習記憶相關疾病及老年癡呆癥的藥物靶標，并為基因治療和藥物開發等提供新的研究方向。
文檔編號A61P25/28GK1884550SQ20061002691
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月26日 優先權日2006年5月26日
發明者王露, 胡應和 申請人:華東師范大學