本發(fa)明涉及(ji)一種(zhong)活性多(duo)肽在離子通道(dao)工具(ju)試(shi)劑中(zhong)的用途(tu)，尤其是用化學(xue)法制備(bei)(bei)的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑(yi)鉀肽-xi（簡寫為(wei)spkp-xi）在制備(bei)(bei)電壓門控鉀通道(dao)亞型工具(ju)試(shi)劑-kv4.1通道(dao)抑(yi)制劑中(zhong)的用途(tu)。

背景技術：

電壓門(men)控鉀(jia)通(tong)(tong)(tong)道(dao)(dao)(dao)(dao)廣泛(fan)分布于(yu)神(shen)經(jing)元、心肌(ji)(ji)、血(xue)管平滑(hua)肌(ji)(ji)、胰腺、骨(gu)(gu)骼(ge)肌(ji)(ji)等可興(xing)奮性組織(zhi)中，是(shi)(shi)(shi)(shi)一(yi)種重(zhong)要(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)跨膜結(jie)構蛋(dan)白(bai)，其參與調(diao)節神(shen)經(jing)遞質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)分泌、血(xue)管收縮、胰腺分泌和骨(gu)(gu)骼(ge)肌(ji)(ji)興(xing)奮性等多種生理過程,同時(shi)也(ye)是(shi)(shi)(shi)(shi)治(zhi)療藥(yao)物作用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)重(zhong)要(yao)(yao)靶(ba)標之(zhi)一(yi)。鉀(jia)離子通(tong)(tong)(tong)道(dao)(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)構與功能關系研(yan)究(jiu)已經(jing)成(cheng)(cheng)為國際(ji)上的(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)熱(re)點。kv4鉀(jia)通(tong)(tong)(tong)道(dao)(dao)(dao)(dao)屬于(yu)瞬時(shi)外(wai)向(xiang)(xiang)鉀(jia)通(tong)(tong)(tong)道(dao)(dao)(dao)(dao)，在大腦(nao)、心臟、肺(fei)和平滑(hua)肌(ji)(ji)中高表達，它是(shi)(shi)(shi)(shi)動(dong)作電位復極化早期外(wai)向(xiang)(xiang)電流的(de)(de)(de)(de)(de)主要(yao)(yao)成(cheng)(cheng)分，在調(diao)節神(shen)經(jing)元放電頻(pin)率和心肌(ji)(ji)興(xing)奮收縮耦聯等方面起重(zhong)要(yao)(yao)作用(yong)。kv4鉀(jia)通(tong)(tong)(tong)道(dao)(dao)(dao)(dao)很可能成(cheng)(cheng)為神(shen)經(jing)性和心血(xue)管等疾病的(de)(de)(de)(de)(de)重(zhong)要(yao)(yao)治(zhi)療靶(ba)點。很顯然，借助kv4鉀(jia)通(tong)(tong)(tong)道(dao)(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)特(te)異性調(diao)制劑(ji)對(dui)這些(xie)研(yan)究(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)深入開(kai)(kai)展是(shi)(shi)(shi)(shi)非常必要(yao)(yao)的(de)(de)(de)(de)(de)。通(tong)(tong)(tong)過闡述(shu)這些(xie)特(te)異性調(diao)制劑(ji)作用(yong)于(yu)鉀(jia)通(tong)(tong)(tong)道(dao)(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)分子機制，除了在理論(lun)上可深入推測(ce)kv4鉀(jia)通(tong)(tong)(tong)道(dao)(dao)(dao)(dao)亞型之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)功能活動(dong)區(qu)別和門(men)控活動(dong)機制外(wai)，還可以為將它們開(kai)(kai)發成(cheng)(cheng)治(zhi)療人類相關疾病的(de)(de)(de)(de)(de)新藥(yao)提供(gong)充(chong)分的(de)(de)(de)(de)(de)理論(lun)基礎和廣闊(kuo)的(de)(de)(de)(de)(de)應(ying)(ying)用(yong)前(qian)景。自然界的(de)(de)(de)(de)(de)動(dong)物毒素是(shi)(shi)(shi)(shi)一(yi)類具有(you)很高實(shi)用(yong)價(jia)值(zhi)和應(ying)(ying)用(yong)前(qian)景的(de)(de)(de)(de)(de)工具試劑(ji)或藥(yao)物導向(xiang)(xiang)物質(zhi)，不僅(jin)是(shi)(shi)(shi)(shi)有(you)毒動(dong)物抵御天(tian)敵的(de)(de)(de)(de)(de)有(you)力武器，也(ye)是(shi)(shi)(shi)(shi)從事神(shen)經(jing)生物學和生理學研(yan)究(jiu)、天(tian)然創新藥(yao)物開(kai)(kai)發以及蛋(dan)白(bai)質(zhi)基礎研(yan)究(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)寶(bao)貴(gui)材(cai)料,同時(shi)也(ye)是(shi)(shi)(shi)(shi)研(yan)究(jiu)離子通(tong)(tong)(tong)道(dao)(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)獨特(te)“分子探(tan)針和解(jie)密器”。

技術實現要素：

本發明(ming)旨(zhi)在于提供一種廣西纓毛蛛毒素(su)提取(qu)物(wu)-蜘蛛抑鉀肽-xi在制(zhi)備電(dian)壓門控(kong)鉀通(tong)道亞(ya)型(xing)工具試劑(ji)-kv4.1通(tong)道抑制(zhi)劑(ji)的應用(yong)，所述的廣西纓毛蛛毒素(su)提取(qu)物(wu)-蜘蛛抑鉀肽-xi（簡寫為spkp-xi），其氨基酸序列為：

nh2-glucysarglysmetpheglyglycysservalaspseraspcyscysalahisleuglycyslysprothrleulystyrcysalatrpaspglythrphe-nh2，其特征在于廣(guang)西纓毛蛛毒(du)素提取(qu)物-蜘蛛抑鉀肽-xi作為單一(yi)有效活性組份用(yong)于制備kv4.1通(tong)道抑制劑。

所述的蜘蛛抑鉀肽-xi的n端第(di)(di)(di)2位(wei)半(ban)(ban)胱(guang)(guang)氨(an)(an)酸和第(di)(di)(di)16位(wei)半(ban)(ban)胱(guang)(guang)氨(an)(an)酸之間(jian)，n端第(di)(di)(di)9位(wei)半(ban)(ban)胱(guang)(guang)氨(an)(an)酸和第(di)(di)(di)21位(wei)半(ban)(ban)胱(guang)(guang)氨(an)(an)酸之間(jian)，n端第(di)(di)(di)15位(wei)半(ban)(ban)胱(guang)(guang)氨(an)(an)酸和第(di)(di)(di)28位(wei)半(ban)(ban)胱(guang)(guang)氨(an)(an)酸之間(jian)分別形成二硫(liu)鍵。

該蜘蛛抑鉀肽-xi作為單一有效活性組分用于(yu)制備kv4.1通(tong)道抑制劑，以細胞(bao)外給藥的方式(shi)制備成kv4.1通(tong)道工(gong)具(ju)試劑。

蜘蛛抑(yi)鉀肽-xi在(zai)制備kv4.1通道工具試劑或抑(yi)制劑時，配制細(xi)胞(bao)外給藥的劑量為5μmol/l。

蜘蛛抑鉀肽-xi對kv4.1通(tong)道的(de)抑制(zhi)呈現時(shi)間依從(cong)性和可逆性，是一種較好的(de)kv4.1鉀通(tong)道工具(ju)試劑(ji)。

附圖說明

圖1是(shi)spkp-xi對表達于(yu)爪蟾卵母細胞的kv4.1鉀通(tong)道亞(ya)型的影響。

圖2是spkp-xi對表(biao)達于(yu)爪(zhua)蟾卵(luan)母細胞的kv1.3鉀通道亞型(xing)的影響。

具體實施方式

為了更(geng)好的(de)理解和更(geng)充分(fen)公開(kai)本發明，下(xia)面將通(tong)過細胞外給藥(yao)途徑，采用(yong)非洲爪(zhua)蟾卵母細胞模型來(lai)說明蜘蛛抑鉀(jia)肽-xi的(de)kv4.1通(tong)道抑制作用(yong)。

1、實驗材料和方法

1.1通道質粒的擴增(zeng)和提取

采(cai)用promega公司(si)的質粒提取試劑盒（wizard?plussvminiprepsdnapurificationsystem）。

溶液的配方如下：

細胞重懸液細胞裂(lie)解液

tris-hcl(ph7.5)50mmnaoh0.2m

edta10mm1%sds

rnasea100μg/ml

中和液洗脫液

鹽酸(suan)胍4.09m乙(yi)酸(suan)鉀60mm

乙酸鉀0.759mtris-hcl(ph7.5)8.3mm

冰醋酸2.12medta0.04mm

ph為4.2加入95%乙醇,終濃度為60%乙醇

操作步驟：

?收集(ji)菌液（4℃，12000r/min，離心(xin)1min）

?棄上(shang)清(qing)，用(yong)濾(lv)紙(zhi)吸干殘留在管壁的(de)溶液，加入250μl細(xi)胞重懸液，充(chong)分混勻

?加入250μl細胞裂(lie)解液，溫和上下(xia)顛(dian)倒4次混勻，放置5min

?加入350μl中和(he)液，溫和(he)顛(dian)倒4次混勻(yun)

?12000r/min離心10min

?吸上清(qing)至離心(xin)(xin)柱中，12000r/min離心(xin)(xin)1min，棄下(xia)清(qing)

?往離(li)(li)心(xin)柱(zhu)中(zhong)加(jia)入750μl洗脫液(ye)，靜置2min，12000r/min離(li)(li)心(xin)

1min，棄下清

?重(zhong)復第七步，加入(ru)250μl洗脫液，12000r/min離心1min棄下

清

?離(li)心柱風干后轉移(yi)到干凈滅菌的1.5mlep管上，加入50μl去(qu)

核酸酶水

?10000r/min離心30s，所(suo)得的質粒(li)dna可進行實驗或-20℃保

存

1.2質粒的線(xian)性化及(ji)回收

kv1.3，kv4.1基(ji)因的質粒pci-neo用(yong)限制性內切酶noti線性化。

1.3cdna的體(ti)外轉(zhuan)錄和mrna的純(chun)化

kv1.3和rkv4.1cdna的(de)(de)體外轉錄均采用ambion公(gong)司的(de)(de)mmessagemmachinet7transcriptionkit試劑盒進(jin)行(xing)。

1.4電壓鉗(qian)實(shi)驗活性檢(jian)測(ce)

取成年雌性(xing)非洲爪蟾(chan)(chan)(chan)，放(fang)入(ru)(ru)(ru)碎冰內麻(ma)醉(zui)(zui)約(yue)30min。或者在(zai)爪蟾(chan)(chan)(chan)周圍溶(rong)液（約(yue)400ml）中(zhong)加入(ru)(ru)(ru)0.5g麻(ma)醉(zui)(zui)劑（3-氨(an)基苯(ben)酸乙烷基酯），爪蟾(chan)(chan)(chan)1hr后(hou)會處于麻(ma)醉(zui)(zui)狀態(tai)。將處于麻(ma)醉(zui)(zui)狀態(tai)的爪蟾(chan)(chan)(chan)放(fang)在(zai)冰上(shang)，腹部(bu)朝上(shang)，用鑷子和手(shou)術刀(dao)在(zai)其腹部(bu)劃開(kai)一長(chang)約(yue)1.0～1.5cm的口，拉(la)出子宮(gong)瓣，剪取2-3葉放(fang)入(ru)(ru)(ru)無鈣(gai)nd96溶(rong)液中(zhong)。將子宮(gong)放(fang)回腹部(bu)，分(fen)層縫合傷口后(hou)，將爪蟾(chan)(chan)(chan)放(fang)在(zai)冰上(shang)恢復，待其蘇醒后(hou)放(fang)回池中(zhong)。將取出的卵葉用系(xi)線鑷初(chu)步分(fen)散成10－20個細(xi)(xi)胞一團。然后(hou)轉(zhuan)入(ru)(ru)(ru)50ml離心(xin)管(guan)中(zhong)，加入(ru)(ru)(ru)含(han)有膠(jiao)原(yuan)酶的無鈣(gai)nd96溶(rong)液，膠(jiao)原(yuan)酶終濃度為(wei)1mg/ml。在(zai)25℃,60rpm下(xia)酶解大(da)約(yue)50min，直至80%以上(shang)的細(xi)(xi)胞已經去除濾泡膜及微血管(guan)后(hou)則可停止酶解。酶解完(wan)畢(bi)，用無鈣(gai)的nd96多次(ci)洗滌細(xi)(xi)胞，洗去殘留的膠(jiao)原(yuan)酶。然后(hou)，挑選個體比較大(da)、動(dong)植物極分(fen)明的細(xi)(xi)胞轉(zhuan)入(ru)(ru)(ru)or2溶(rong)液在(zai)18℃培(pei)養。溶(rong)液配(pei)方(fang)：nd96（inmm）：nacl96、kcl2、cacl2-2h2o1.8、mgcl2-6h2o1、hepes-naoh5。用naoh調ph至7.5。or2(inmm):nacl82.5、kcl2.5、cacl2-2h2o1、mgcl2-6h2o1、na2hpo4-12h2o1、hepes5。用naoh調ph至7.5。使用前加入(ru)(ru)(ru)青霉素(su)（10萬(wan)單位/l）。

電(dian)(dian)(dian)(dian)壓鉗實驗(yan)：通過(guo)顯(xian)微注(zhu)射(she)系(xi)統（wpi，german）將mrna注(zhu)入(ru)(ru)挑選好的(de)卵母細(xi)胞(bao)，每次注(zhu)射(she)體(ti)積(ji)約(yue)為(wei)20-50nl，從黑(hei)色的(de)動(dong)物極(ji)一(yi)側注(zhu)入(ru)(ru)。之(zhi)后(hou)，放(fang)入(ru)(ru)18℃低溫振蕩(dang)培養(yang)箱中培養(yang)1～4天，每天更(geng)換一(yi)次新鮮的(de)or2培養(yang)液(ye)。雙(shuang)電(dian)(dian)(dian)(dian)極(ji)桿電(dian)(dian)(dian)(dian)壓鉗記錄(lu)在室溫（18～22℃）下進(jin)行(xing)。玻(bo)璃電(dian)(dian)(dian)(dian)極(ji)經一(yi)步拉制而成(cheng)，灌注(zhu)3mkcl后(hou)電(dian)(dian)(dian)(dian)阻為(wei)0.5-1.5mω。將細(xi)胞(bao)放(fang)入(ru)(ru)細(xi)胞(bao)槽中，用(yong)or2溶液(ye)灌流(liu)(liu)。然后(hou)將兩個玻(bo)璃電(dian)(dian)(dian)(dian)極(ji)分別插入(ru)(ru)細(xi)胞(bao)。將細(xi)胞(bao)鉗制在-80mv，給予去極(ji)化脈(mo)沖(chong)刺(ci)激。所(suo)用(yong)放(fang)大器(qi)為(wei)turbotec-03x（npielectronic,germany）。數(shu)(shu)據采集濾波為(wei)2khz。參比(bi)電(dian)(dian)(dian)(dian)極(ji)用(yong)ag/agcl電(dian)(dian)(dian)(dian)極(ji)與浴槽相連(lian)。刺(ci)激脈(mo)沖(chong)控制和(he)(he)電(dian)(dian)(dian)(dian)流(liu)(liu)信號記錄(lu)采用(yong)cellworks數(shu)(shu)據采集系(xi)統（npi公司(si)，germany）。線性漏(lou)電(dian)(dian)(dian)(dian)流(liu)(liu)和(he)(he)電(dian)(dian)(dian)(dian)容電(dian)(dian)(dian)(dian)流(liu)(liu)不予刪(shan)除。數(shu)(shu)據分析采用(yong)sigmaplot軟件進(jin)行(xing)。所(suo)有毒素直接(jie)用(yong)or2溶液(ye)溶解并配(pei)制成(cheng)目的(de)濃度。

2、實驗結果與分析

2.1spkp-xi對電壓門控鉀通道的作用

我們采(cai)用(yong)雙電極電壓(ya)鉗技術(shu)研究了spkp-xi對(dui)鉀(jia)離子(zi)通(tong)道亞型的(de)影響，其中延遲整流鉀(jia)通(tong)道kv1.3電流以(yi)同一(yi)種去極化方式誘導(dao)：將細(xi)胞膜(mo)(mo)電位鉗制(zhi)(zhi)在-90mv，以(yi)400ms的(de)時(shi)(shi)程給(gei)予一(yi)測(ce)試電壓(ya)0mv，每隔5s重復(fu)一(yi)次；瞬時(shi)(shi)外向鉀(jia)通(tong)道kv4.1電流以(yi)另一(yi)種去極化方式誘導(dao)：將細(xi)胞膜(mo)(mo)電位鉗制(zhi)(zhi)在-90mv，以(yi)200ms的(de)時(shi)(shi)程給(gei)予一(yi)測(ce)試電壓(ya)+20mv，每隔5s重復(fu)一(yi)次。5mmspkp-xi能抑制(zhi)(zhi)36%的(de)kv4.1電流（見圖1）。5mmspkp-xi對(dui)kv1.3電流的(de)抑制(zhi)(zhi)率為(wei)4.1%（見圖2），幾乎沒有(you)抑制(zhi)(zhi)作用(yong)。因此我們可以(yi)得出spkp-xi是作用(yong)于(yu)kv4.1通(tong)道的(de)抑制(zhi)(zhi)劑。

spkp-xi對kv4.1通(tong)道(dao)(dao)的(de)抑(yi)制(zhi)也(ye)呈(cheng)現時間(jian)依從性，當spkp-xi的(de)濃度(du)為5mm時，可在不到3min的(de)時間(jian)內達到最大(da)抑(yi)制(zhi)程(cheng)度(du)，而且spkp-xi對kv4.1通(tong)道(dao)(dao)的(de)抑(yi)制(zhi)作用是可以恢復的(de)，即(ji)是可逆(ni)的(de)。

sequencelisting

<110>長沙沁才生物(wu)科技有(you)限公司

<120>蜘蛛抑鉀肽(tai)-xi

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>34

<212>prt

<213>廣西纓毛蛛(zhu)

<400>1

glucysarglysmetpheglyglycysservalaspseraspcys

151015

cysalahisleuglycyslysprothrleulystyrcysalatrp

16202530

aspglythrphe

31