專利名稱：重組抗骨橋蛋白抗體及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及重組抗骨橋蛋白(osteopontin)抗體及應用該抗體的自身免疫性疾病、風濕病乃至類類風濕性關節炎的治療方法。
背景技術：
骨橋蛋白(以下稱作OPN)是一種骨中大量存在的酸性鈣結合性糖蛋白。已知，在人類，由于mRNA剪切(splicing)的不同，至少可以生成骨橋蛋白-a(以下，稱作OPN-a)、骨橋蛋白-b(以下，稱作OPN-b)和骨橋蛋白-c(以下，稱作OPN-c)3種同種型(isoform)(Y.Saitoh等，(1995)Laboratory Investigation，72，55-63)。其中，人們認為，OPN-a的前體具有后面序列表中SEQ ID NO1中所示的氨基酸序列，分泌過程中切斷信號肽，形成117-N314的成熟體OPN-a。另外，在生物體內，凝血酶可從成熟體OPN第168位的精氨酸殘基的C末端進行剪切，形成N末端和C末端2種片段。
上述OPN擔負著多種生理學病理學上的重要功能，例如細胞粘附、細胞遷移、腫瘤形成、免疫應答及抑制補體介導的細胞溶解等功能。這些不同的功能是由多種細胞表面的受體介導的。OPN的內部具有RGD序列(例如，OPN-a中159-161氨基酸殘基)，識別該RGD序列的αVβ3、αVβ1和αVβ5等整合素(integrin)是OPN的主要受體。其中，整合素αVβ3、αVβ1和αVβ5在血管的平滑肌細胞中介導細胞粘附。此外，αVβ3與巨噬細胞、淋巴細胞、內皮細胞和平滑肌細胞等的遷移相關。
再者，到目前為止的研究表明，OPN通過SVVYGLR序列與整合素α9β1、α4β1、α4β7結合，并發現其結合方式的不同，即α4β1能與未經凝血酶剪切的OPN(非切斷型OPN)及凝血酶剪切的N末端片段(切斷型OPN)二者結合，而α9β1只能與凝血酶切斷型OPN結合(Y.Yokosaki等，(1999)The Journal of BiologicalChemistry 274，36328-36334/P.M.Green等，(2001)FEBS Letters 503，75-95/S.T.Barry等，(2000)Experimental Cell Research 258，342-351。這些整合素的亞基α9和α4、β1和β7，彼此間氨基酸序列同源性高。整合素α4β1和α4β7主要在淋巴細胞和單核細胞中表達，但在中性粒細胞中僅微量表達。另一方面，α9β1在中性粒細胞中選擇性高表達，具有VCAM-1和Tenascin-C等介導的中性粒細胞遷移所必需的功能。另外，整合素在肌肉細胞和上皮細胞、肝細胞等細胞中廣泛表達。如上所述，整合素亞基α9和α4的胞質區各通過存在微妙差異的細胞內信號傳導路徑，相互協同促進白細胞向炎癥部位的遷移和凝集，通過增強它們的浸潤活性而參與各種炎癥反應。
如上所述，不同種類的整合素促進白血病的遷移，參與炎癥反應，所以抑制這些整合素活性的藥劑有潛能作為抗炎癥劑應用。例如，整合素αVβ3在破骨細胞、血管內皮細胞及平滑肌細胞等細胞中表達，通過抑制αVβ3整合素與其各種結合配體的結合，如在關節中，期待起到關節破壞抑制作用，所以抗αVβ3抗體的開發實際上是可行的。
但是，由于屬于整合素家族的受體在廣泛的組織中普遍表達，承擔著維持生命活動所必需的功能，所以應用整合素的抗體對類風濕性關節炎和變形性關節炎進行治療時，有可能對其它部位產生同樣的抑制，恐怕產生副作用。
另外，WO01/71358中公開了抑制整合素α4和骨橋蛋白結合的物質的篩選方法及應用篩選所得物質進行炎癥性疾病的治療方法等。
類風濕性關節炎的病因有多種因素，有許多相關的報道，但均不確實。另外，其治療方法，現在已知的方法是對癥治療，不能達到必要的滿足。
因此，強烈要求明確類風濕性關節炎的病因，提供更優越的治療法，本發明就是以解決這樣的課題作為其目的。
另外，類風濕性關節炎、變形性關節炎等之間的辨別很難，本發明的另一課題是提供用于辨別的診斷方法。
本發明者們了解風濕病患者和變形性關節炎患者的關節腔液中OPN濃度增高，并且本發明者們初次發現凝血酶切斷型N末端片段的比例占總OPN的比例增加，認為OPN與這些疾病的發病密切相關。于是，應用OPN基因敲除小鼠進行實驗，來驗證該事實。
另外，制備能區別識別用凝血酶酶切OPN產生的N末端片段和C末端片段的抗體，應用這些抗體進行實驗，發現在類風濕性關節炎患者中，尤其是由凝血酶酶切產生的N末端片段在關節腔內呈現高濃度。
再者，本發明者們著眼于上述類風濕性關節炎患者中高濃度表達的N末端片段中同時存在人整合素識別的RGD序列和SVVYGLR序列，設想同時封閉這兩種序列的抗體，能廣泛抑制OPN與整合素的結合，是否對類風濕性關節炎和變形性關節炎的治療有效。
上述OPN分布于腎臟、胎盤、卵巢、腦、皮膚等組織內，主要表達于骨組織。本發明者們考慮類風濕性關節炎治療時，用特異的方法從OPN側阻斷OPN與整合素的結合。此時，考慮到前述多種不同的整合素以協同方式參與了炎癥反應，所以本發明者們認為更廣泛地阻斷與這些不同種類整合素的結合會有效。
于是，制備了抑制人OPN的RGD序列與整合素結合及抑制人OPN的SVVYGLR序列與整合素結合的抗體，通過細胞粘附和細胞遷移試驗確認其效果。還獲得了與小鼠OPN的相應序列對應的合成肽的抗體，應用小鼠的關節炎疾病模型，觀察該抗體作為治療藥的效果。
也就是說，由于小鼠OPN在與人OPN的氨基酸序列相同的位置上存在小鼠的整合素識別的RGD序列和SLAYGLR序列，作為同時封閉這兩個序列的抗體，獲得了M5抗體。包含RGD序列的GRGDSP肽可抑制M5抗體與小鼠OPN及其凝血酶消化物的結合，另外可確認M5抗體可抑制用TNF-α活化的小鼠脾細胞來源的單核細胞的遷移。用小鼠的顱蓋(calvaria)器官培養體系進行研究，可觀察到M5抗體具有骨破壞的抑制作用。另外，將上述抗體用于小鼠的膠原關節炎模型，顯示明顯的治療效果。
以上結果提示，同時阻斷RGD序列、SVVYGLR序列與人整合素結合的抗體，抑制OPN與整合素的結合，對類風濕性關節炎等的治療有效。還提示，不僅對青年性關節性風濕病和慢性風濕病有效，而且對銀屑性關節炎和銀屑病的治療有效。另外，器官移植后的慢性排斥以血管和氣管支的閉塞性病變為特征，從組織學的觀察考慮，T細胞和巨噬細胞的活化可引起細胞因子、增殖因子的產生，血管內皮細胞障礙，并因血管平滑肌的增殖引起纖維化等，有可能向血管閉塞發展(P.Freese等，(2001)Nephrol Dial Transplant，16，2401-2406/J.R.Waller等，(2001)British Journal of Surgery，88，1429-1441/S.R.Lehtonen等，(2001)Transplantation，72，1138-1144)。有報道說OPN作為巨噬細胞活化和血管平滑肌纖維化的必需蛋白而發揮作用(A.O’Regan等，(2000)Int J Exp Pathol，81，373-390)。本發明的OPN抑制抗體通過抑制單核細胞和中性粒細胞的遷移，有可能抑制向纖維化的過程。因此，該抗體抑制臟器移植后的慢性排斥反應，參與器官粘附，另外對全身性自身免疫性疾病、紅斑、葡萄膜炎、貝赫切特疾病、多發性肌炎、絲狀體增殖性腎炎、結節病等自身免疫性疾病的治療有效。
基于以上發現，本申請人們發現了抗骨橋蛋白抗體，它能抑制識別RGD序列的整合素與骨橋蛋白或其片段的結合，且可抑制識別SVVYGLR或其相應序列的整合素與骨橋蛋白或其片段的結合。對該抗體進行了國際專利(PCT/JP02/03382)。
發明公開上述抗骨橋蛋白抗體，為小鼠來源的抗體(以下稱作“小鼠抗體”)，與人的骨橋蛋白有很強的親和性，可抑制骨橋蛋白的末梢血單核細胞或中性粒細胞的游走活性。期望該小鼠抗體可作為以人風濕病為代表的各種炎癥性疾病的治療藥，但由于小鼠抗體來源于小鼠，從誘導抗原性的安全性和半衰期的縮短等有效性觀點考慮，很難施用給人。
因此，本發明者們應用基因工程學方法，在不降低小鼠抗體活性的條件下對上述小鼠抗體進行了改變，獲得抗原性問題更少的骨橋蛋白抗體。
也就是說，本發明提供以下[1.]-[45.]的發明。
一種抗骨橋蛋白抗體或源于該抗體的抗體片段，它能抑制識別RGD序列的整合素與骨橋蛋白或其片段的結合，且可抑制識別SVVYGLR序列的整合素與骨橋蛋白或其片段的結合。
[1.]中的抗骨橋蛋白抗體，它是用包含部分氨基酸序列RGDSVVYGLRS的肽作為抗原而獲得的。
[1.]或[2.]中的抗骨橋蛋白抗體，它是用肽VDTYDGRGDSVVYGLRS作為抗原而獲得的。
[1.]-[3.]任一項中的抗骨橋蛋白抗體，它是單克隆抗體。
[1.]-[3.]任一項中的抗骨橋蛋白抗體，它是嵌合抗體。
[5.]中的抗骨橋蛋白抗體，具有以下重鏈(a)和輕鏈(b)。
(a)具有鼠源重鏈可變區和人源重鏈恒定區的重鏈；(b)具有鼠源輕鏈可變區和人源輕鏈恒定區的輕鏈。
[5.]或[6.]中的抗骨橋蛋白抗體，其特征在于，其重鏈(a)的小鼠來源的重鏈可變區具有SEQ ID NO19中的氨基酸序列。
[5.]或[6.]中的抗骨橋蛋白抗體，其特征在于，其輕鏈(b)的小鼠來源的輕鏈可變區具有SEQ ID NO20中的氨基酸序列。
[5.]或[6.]中的抗骨橋蛋白抗體，其中重鏈(a)的重鏈恒定區為人Igγ1。
[5.]或[6.]中的抗骨橋蛋白抗體，其中輕鏈(b)的輕鏈恒定區為人Igκ。
[1.]-[3.]任一項中的抗骨橋蛋白抗體，它是人化抗體。
[11.]中的抗骨橋蛋白抗體具有以下重鏈(c)和輕鏈(d)(c)具有小鼠來源的重鏈可變區重鏈可變區和人源重鏈恒定區的重鏈；(d)具有小鼠來源的輕鏈可變區的互補性決定區域及人源輕鏈可變區的構架區域的輕鏈可變區和人源輕鏈恒定區的輕鏈。
[11.]或[12.]中的抗骨橋蛋白抗體，其特征在于，其重鏈(c)的小鼠來源的重鏈可變區的互補性決定區域具有SEQ ID NO21-23中的氨基酸序列。
[11.]或[12.]中的抗骨橋蛋白抗體，其特征在于，其輕鏈(d)的小鼠來源的輕鏈可變區的互補性決定區域具有SEQ ID NO24-26中的氨基酸序列。
[11.]或[12.]中的抗骨橋蛋白抗體，其特征在于，其重鏈(c)的重鏈可變區具有SEQ ID NO28中的氨基酸序列。
[11.]或[12.]中的抗骨橋蛋白抗體，其特征在于，其輕鏈(d)的輕鏈可變區具有SEQ ID NO30中的氨基酸序列。
[11.]或[12.]中的抗骨橋蛋白抗體，其重鏈(c)的重鏈恒定區為人Igγ1。
[11.]或[12.]中的抗骨橋蛋白抗體，其輕鏈(d)的輕鏈恒定區為人Igκ。
編碼SEQ ID NO19中記載的氨基酸序列的堿基序列。
編碼SEQ ID NO20中記載的氨基酸序列的堿基序列。
編碼SEQ ID NO28中記載的氨基酸序列的堿基序列。
編碼SEQ ID NO30中記載的氨基酸序列的堿基序列。
具有[19.]中堿基序列和人Igγ1基因的載體。
具有[20.]中堿基序列和人Igκ基因的載體。
具有[21.]中堿基序列和人Igγ1基因的載體。
具有[22.]中堿基序列和人Igκ基因的載體。
用[23.]和[24.]中記載的載體轉化的宿主細胞。
用[25.]和[26.]中記載的載體轉化的宿主細胞。
抗骨橋蛋白嵌合體抗體的制備方法，是[5.]或[6.]中記載的抗骨橋蛋白嵌合體抗體的制備方法，其特征在于，培養[27.]中的宿主細胞，從培養液中收集抗骨橋蛋白嵌合體抗體。
抗骨橋蛋白人源化抗體的制備方法，是[11.]或[12.]中記載的抗骨橋蛋白人源化抗體的制備方法，其特征在于，培養[28.]中的宿主細胞，從培養液中收集抗骨橋蛋白人源化抗體。
一種自身免疫性疾病的治療劑，它包含[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段作有效成分。
一種風濕病的治療劑，它包含[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段作有效成分。
一種類風濕性關節炎的治療劑，它包含[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段作有效成分。
一種變形性關節炎的治療劑，它包含[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段作有效成分。
一種自身免疫性疾病的治療方法，其特征在于，給自身免疫性疾病的患者施用[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段。
一種類風濕病的治療方法，其特征在于，給類風濕病的患者施用[1]-[6.]或[11.]或[12.]任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段。
一種類風濕性關節炎的治療方法，其特征在于，給類風濕性關節炎的患者施用[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段。
一種變形性關節炎的治療方法，其特征在于，給變形性關節炎的患者施用[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段。
[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段在制備自身免疫性疾病治療劑中的應用。
[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段在制備風濕病治療劑中的應用。
[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段在制備類風濕性關節炎治療劑中的應用。
[1.]-[6.]或[11.]或[12.]任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段在制備變形性關節炎治療劑中的應用。
一種自身免疫性疾病治療劑的篩選方法，其特征在于，評價待檢化合物對骨橋蛋白的RGD序列與整合素結合和/或SVVYGLR序列與整合素結合的抑制程度。
一種風濕病治療劑的篩選方法，其特征在于，評價待檢化合物對骨橋蛋白的RGD序列與整合素結合和/或SVVYGLR序列與整合素結合的抑制程度。
一種類風濕性關節炎治療劑的篩選方法，其特征在于，評價待檢化合物對骨橋蛋白的RGD序列與整合素結合和/或SVVYGLR序列與整合素結合的抑制程度。
附圖簡述

圖1表示對OPN的RGD依賴性細胞粘附的抑制圖。
圖2表示小鼠2K1抗體對α9轉化的SW480細胞與nOPN的RGD依賴性及RGD非依賴性細胞粘附的抑制。
圖3a表示OPN誘導細胞遷移的圖。
圖3b表示通過抗體抑制OPN誘導的細胞遷移的圖。
圖4表示給OPN基因缺陷的小鼠和正常小鼠分別施用誘發關節炎的抗體雞尾酒/LPS時，關節炎分數隨時間的變化圖。
圖5表示給OPN基因缺陷的小鼠和正常小鼠分別施用誘發關節炎的抗體雞尾酒/LPS時手腕腫脹的比較圖。
圖6a表示以小鼠2K1抗體為分析物時，BIACORE-2000的傳感器圖。
圖6b表示以嵌合2K1抗體為分析物時，BIACORE-2000的傳感器圖。
圖7表示小鼠2K1抗體與模板人抗體的比較圖。
圖8表示小鼠2K1抗體與模板人抗體的VL氨基酸序列的比較圖。
圖9表示人源2K1抗體的VH氨基酸序列及編碼該氨基酸序列的堿基序列。
圖10表示人源2K1抗體的VL氨基酸序列及編碼該氨基酸序列的堿基序列。
圖11表示擴增人源2K1抗體的VH氨基酸序列時設計的引物。
圖12表示擴增人源2K1抗體的VL氨基酸序列時設計的引物。
圖13表示不同濃度的人源2K1抗體和嵌合2K1抗體對骨橋蛋白肽的結合活性。
圖14表示小鼠OPN與NIH3T3的濃度依賴性粘附。
圖15表示GRGDSP肽抑制小鼠OPN與NIH3T3的粘附。
圖16表示M15抗體對小鼠OPN與NIH3T3的粘附抑制。
實施發明的最佳狀態本發明的抗骨橋蛋白嵌合抗體及抗骨橋蛋白人源化抗體的獲得是例如用基因工程學方法將抑制國際專利(PCT/JP02/03382)中記載的識別RGD序列的整合素與骨橋蛋白或其片段的結合，且抑制識別SVVYGLR序列及其相應序列的整合素與骨橋蛋白或其片段的結合的抗骨橋蛋白小鼠抗體(以下，稱作“OPN抑制抗體”)改變成與其恒定區為治療對象的人或動物的抗體具有相同恒定區的嵌合抗體(參照歐洲專利公開公報EP0125023)或人源化抗體(參照歐洲專利公開公報EP0239400或EP045126)。
各種類型的抗體分子有相同的基本結構，由分子量5-7萬的重鏈和分子量2-3萬的輕鏈構成。重鏈通常由含大約440個氨基酸的多肽鏈構成，各類具有其特征性的結構，IgG、IgM、IgA、IgD、IgE分別對應γ、μ、α、δ、ε鏈。IgG存在IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 4種，分別稱作γ1、γ2、γ4、γ4。輕鏈通常由含大約220個氨基酸的多肽鏈構成，有L型和K型兩種，分別對應λ、κ鏈。抗體分子基本結構的肽構成是分別具有相同的2條重鏈和2條輕鏈，靠二硫鍵結合(S-S結合)和非共價結合結合而成，分子量15-19萬。2種輕鏈可與任何重鏈相對應。每個抗體分子通常由2條相同的輕鏈和2條相同的重鏈組成。
鏈內S-S結合在重鏈有4個(μ、ε鏈5個S-S結合)，輕鏈兩個，在100-110殘基間形成一個環，這種立體結構在各環間類似，稱作結構單位或功能區。位于重鏈、輕鏈N末端的功能區，即便是同種動物的同一型(亞型)的樣品，其氨基酸序列也不同，稱作可變區(V區，可變區)(各功能區分別用VH、VL表示)。從該功能區到C末端側的氨基酸序列在各型或亞型基本一致，稱作恒定區(C區，恒定區)(各功能區分別用CH1、CH2、CH3或CL表示)。
抗體的抗原決定部位由VH和VL構成，其結合特異性由該部位的氨基酸序列決定。另一方面，補體與各種細胞結合的生物學活性反映了各類型Ig C區結構的差異。已知，輕鏈和重鏈可變區的可變性幾乎由存在于兩種鏈中的3個小的超變區(hypervariable region)所限定，將該區域稱作互補性決定區域(CDR，complementaritydetermining region)。可變區的剩余部分稱作構架區(FR，frameworkregion)，比較恒定。通常，僅各可變區的互補性決定區域中的5-10個氨基酸形成抗原結合部位。
利用小鼠型的與抗原反應的可變區，其它部分利用人型的蛋白質叫做嵌合抗體。這里，還將識別骨橋蛋白及其片段的嵌合抗體叫做抗骨橋蛋白嵌合抗體。此外，將抗原特異性的小鼠單克隆抗體分子的互補性決定區域(抗原結合部位)以外的區域全部置換成人免疫球蛋白分子的氨基酸的基因重組蛋白質叫做人源化抗體。這里，還將識別骨橋蛋白及其片段的人源化抗體叫做抗骨橋蛋白人源化抗體。
用于制備本發明的抗骨橋蛋白嵌合抗體和抗骨橋蛋白人源化抗體的OPN抑制抗體，只要能抑制識別RGD序列的整合素，如αVβ3、αVβ1和αVβ5，與OPN-a、OPN-b、OPN-c或其N端片段的結合，且能抑制識別SVVYGLR序列的整合素，如α9β1、α4β1、α4β7，與OPN-a、OPN-b、OPN-c或其N端片段的結合，任何抗體都可。SVVYGLR序列或其相應序列是指人OPN162位絲氨酸到168位精氨酸間的序列，其相應序列是指其它哺乳動物中與OPN的SVVYGLR序列相應的序列，例如豬中與人相同SVVYGLR，猴中為SVAYGLR，小鼠和大鼠中為SLAYGLR，牛中為SVAYGLK，兔中為SVAYRLK。
對OPN抑制抗體的制備方法無特殊限制，只要抗體能保持上述性質即可，例如以OPN-a、OPN-b、OPN-c和其N端片段，或含氨基酸序列RGDSVVYGLR序列或其相應序列的肽(以下，將之總稱為“OPN相關肽”)作抗原進行制備。這里所講的OPN片段是指用蛋白水解酶對OPN進行水解產生的片段，例如用凝血酶水解產生的片段。
上述OPN抑制抗體，優選用含RGDSVVYGLR序列的肽作抗原制備而得。更優選，例如用連續擁有這兩個序列的OPN-a的153位纈氨酸殘基到169位絲氨酸殘基的肽(VDTYDGRGDSVVYGLRS)作抗原，按以下方法處理而得的抗體。為了提高抗原性，優選將上述OPN相關肽與生物大分子化合物結合形成的結合物作抗原。
另外，進行與OPN相關疾病等研究時，用小鼠作實驗動物，應用與小鼠OPN相對應的OPN抑制抗體，優選應用含RGDSLAYGLR序列的肽作抗原制備而得的抗體。
與上述OPN相關肽結合的生物大分子化合物的實例有匙孔蟲戚血藍蛋白(以下，稱作KLH)，卵白蛋白(以下稱作OVA)，牛血清白蛋白(以下，稱作BSA)，兔血清白蛋白(以下，稱作RSA)，甲狀腺球蛋白等，其中優選KLH和甲狀腺球蛋白。
上述OPN相關肽與生物大分子化合物的結合可通過眾知的方法進行，如混合酸脫水物法(B.F.Erlanger等，(1954)J.Biol.Chem.，234，1090-1094)或活化酯法(A.E.Karu等，(1994)J.Agric.Food Chem.，42，301-309)等。
混合酸脫水物法中應用的混合酸脫水物的制備是將OPN相關肽進行常規的Schotten-Baumann反應，然后與生物大分子化合物進行反應，從而獲得目的產物肽-大分子化合物結合體。該混合酸脫水物法中應用的鹵化蟻酸酯包括，如甲基氯蟻酸、甲基溴蟻酸、乙基氯蟻酸、乙基溴蟻酸、異丁基氯蟻酸等。該方法中使用的肽和鹵化蟻酸酯與高分子化合物的比例可在一寬范圍內適當選擇。Schotten-Baumann反應在堿性化合物的存在下進行，該反應中所應用的堿性化合物是Schotten-Baumann反應中常用的化合物，例如三乙基胺、三甲基胺、吡啶、二甲基苯胺、N-甲基嗎啉、diazabicyclononene(DBN)、diazabicycloundecene(DBU)、diazabicyclooctane(DABCO)等有機鹽，碳酸鈣、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等無機鹽等。
上述反應通常在-20℃到100℃進行，優選0℃到50℃進行；反應時間5分鐘-10小時左右，優選5分鐘-2小時。
所得混合酸脫水物與生物大分子化合物進行的反應通常在-20℃到150℃進行，優選0℃-100℃進行；反應時間5分鐘-10小時左右，優選5分鐘-5小時。混合酸脫水物法在普通溶劑中進行，可使用混合酸脫水物法中慣用的任何溶劑，具體而言，如二氯甲烷、氯仿、二氯乙烷等鹵化的碳氫化合物，苯、甲苯、二甲苯等芳香族碳氫化合物，二乙基酯、二噁烷、四氫呋喃和二甲氧基乙烷等醚類，甲基醋酸、乙基醋酸等酯類，N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、六甲基三磷酸酰胺等非質子性極性溶劑。
另一方面，活化酯法一般如下進行。首先，將OPN相關肽溶劑到有機溶劑中，在偶聯劑的存在下與N-羥基丁二酰胺反應，生成N-羥基丁二酰胺活化酯。
可使用縮合反應中慣用的偶聯劑作為偶聯劑使用，例如二環己基碳化二亞胺、羰基二咪唑、水溶性的碳化二亞胺等。另外，作為有機溶劑可使用，例如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜和二噁烷等。反應中使用的肽與N-羥基丁二酰胺等偶聯劑的摩爾比優選1∶10-10∶1，最優選1∶1。反應溫度0-50℃，優選22-27℃，反應時間為5分鐘-24小時，優選1-2小時。反應溫度可在各自的熔點以上沸點以下進行。
偶聯反應后，將反應液加到溶解了生物大分子化合物的溶液中進行反應，例如當生物大分子化合物有游離的氨基時，該氨基與肽的羧基間生成酸酰胺鍵。反應溫度0-60℃，優選5-40℃，更優選22-27℃，反應時間為5分鐘-24小時，優選1-16小時，更優選1-2小時。
通過透析、脫鹽柱等對上述OPN相關肽與生物大分子化合物的反應物進行純化，可獲得OPN相關肽與生物大分子化合物的結合物(以下，簡稱“結合物”)。
以下，對應用上述所得結合物作抗原的抗體的制備方法及應用該抗體進行免疫化學測定的方法進行說明。另外，可適當應用眾知的方法進行抗體的制備，如續生化學實驗講座、免疫生化學研究法(日本生化學會編)中記載的方法。
使用上述結合體制備本發明的多克隆抗體時，用該結合物免疫動物，然后從動物獲取抗體即可。
即，首先，如將OPN相關肽-甲狀腺球蛋白結合物等結合物溶解到磷酸鈉緩沖液(以下，稱作“PBS”)中，然后與氟氏完全佐劑或氟氏不完全佐劑或明礬等輔助劑混合，作為免疫原，免疫哺乳動物。
可使用該技術領域中經常使用的任何動物進行免疫，如小鼠、大鼠、兔子、羊、馬等。另外，免疫時免疫原的施用途徑可以是皮下注射、腹腔內注射、靜脈內注射、肌肉內注射等任一種途徑，但優選皮下注射或腹腔內注射。可以免疫一次，也可以適當的間隔多次免疫，優選以1周-5周的間隔多次免疫。然后，按常規方法，從免疫動物中采血，分離血清，純化出多克隆抗體級分，從而獲得OPN抑制抗體。
另外，可按常規方法，將用上述結合物免疫動物而得的免疫細胞與骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤，從雜交瘤培養物中收集抗體，可獲得OPN抑制抗體的單克隆抗體。
本發明的抗骨橋蛋白嵌合抗體和抗骨橋蛋白人源化抗體的制備，可以上述單克隆的OPN抑制抗體或該抗體的雜交瘤為基礎，參照上述的歐洲專利公開公報EP0125023、歐洲專利公開公報EP0239400、EP045126等進行，但本發明中特別希望依照國際公開公報WO94/20632中記載的方法從小鼠抗體制備嵌合抗體或人源化抗體。
例如，治療對象為人，OPN抑制抗體的產生動物為小鼠時，希望應用小鼠抗體的可變區與人抗體恒定區連接的抗體(以下稱之為“嵌合抗體”)和主要將小鼠抗體可變區中互補性決定區域移植給人抗體的抗體(以下稱之為“人源化抗體”)。此外，為了產生抗體，可應用導入了嵌合抗體基因或人源化抗體基因的轉基因動物的方法，應用噬菌體庫顯示技術(phage display)的方法。
如此所得OPN抑制抗體可直接應用，也可應用這樣的蛋白質-由至少有構成該抗體的重鏈和/或輕鏈的多肽的一部分，且具有抗原結合活性的多肽鏈構成，或可應用OPN抑制抗體產生的抗體片段，如單鏈抗體(scFv)、Fab和F(ab’)2等抗體片段。
具體而言，從小鼠抗體制備嵌合抗體時，首先按常規方法從產生抗體的雜交瘤(例如實施例2中的雜交瘤(FERM BP-7883))中克隆小鼠抗體的可變區基因，測定其堿基及其編碼的氨基酸序列。將如此測定的小鼠抗體可變區基因與抗體的引導序列等與人抗體的適當型的恒定區基因連接，優選與IgG型抗體的恒定區基因連接，由此制備嵌合抗體基因。
接著，將該嵌合抗體基因連接到適當的表達載體中，導入培養細胞中。最后，培養該培養細胞，從培養上清中獲得嵌合抗體。
用對應于小鼠抗體引導序列和J區的引物，通過PCR擴增如上確定的小鼠抗體的可變區基因，獲得可變區基因片段。為了進行克隆，優選將限制性酶的識別部位連接到可變區基因片段的兩端。
將上述所得基因片段于人抗體的恒定區基因連接，制備成嵌合抗體基因(以下，簡稱“嵌合抗體基因”)。該組合非特別地組合，只要最終能表達抗原結合活性的組合即可，根據需要可選擇任何類型的恒定區(例如，γ1、γ2、γ3或γ4重鏈，λ或κ輕鏈的恒定區)。另外，可與為了增強或減低恒定區的功能而設計的恒定區基因組合。
可使用國際公開公報WO94/20632記載的AG-γ1和AG-κ等表達載體作為與上述所得嵌合抗體基因連接的表達載體，只要是能表達嵌合抗體基因即可，對其無特殊限制。若利用AG-γ1和AG-κ等已有Ig基因的表達載體的話，僅插入上述小鼠的可變區基因即可獲得具有嵌合抗體基因的表達載體。
上述表達載體可通過，如磷酸鈣法等導入培養細胞中。
可使用，如CHO-DG44細胞等培養細胞作為導入表達載體的培養細胞，按照常規方法對其進行培養。
培養后，在培養上清中累積的嵌合抗體可以被不同的層析法純化，例如用蛋白A柱純化。
如此所得嵌合抗體的抗原活性可通過，如應用骨橋蛋白肽等的ELISA和BIAcore(BIAcore公司)進行測定。
另外，本發明中，如按照以下說明的方法可制備出比上述嵌合抗體更接近人抗體的人源化抗體。
具體而言，從小鼠抗體制備人源化抗體時，首先按照Kabat等的分類方法確定小鼠抗體的可變區中互補性決定區域(CDR)的氨基酸(Immunological Interest 4thed.，Public Health Service，NIH，WashingtonDC，1987)。將小鼠抗體的可變區中以CDR為中心的氨基酸移植到人抗體模板中，設計出具有小鼠抗體CDR和人抗體構架的可變區氨基酸序列。設計編碼該可變區氨基酸序列的DNA的堿基序列，通過PCR法及基因重組技術制備具有所設計的核酸序列的可變區基因片段。然后，將該可變區基因與人抗體的適當型的恒定區基因連接，優選與IgG型抗體的恒定區基因連接，由此制備人源化抗體基因。接著，將該人源化抗體基因連接到適當的表達載體，導入培養細胞中。最后，培養該培養細胞，從培養上清中獲得人源化抗體。
上述人源化抗體的制備方法中，小鼠抗體可變區基因中的互補性決定區域的基因可在嵌合抗體的制備中明確的小鼠抗體可變區基因的基礎上進行確定，根據Kabat分類，在互補性決定區域的范圍內。
另外，選擇與上述小鼠抗體構架區的氨基酸序列同源性高的序列，如選自人抗體種系(germline)，按常規方法制備編碼該氨基酸序列的堿基序列，將之作為成為模板的人抗體構架區基因。
連接上述小鼠抗體互補性決定區域的基因和成為模板的人抗體構架區基因，與嵌合抗體的制備同樣制備基因片段。將該基因片段與人源化抗體的恒定區基因連接，制備人源化抗體基因(以下，簡稱“人源化抗體基因”)。
制備好人源化抗體基因，隨后人源化抗體基因的表達載體的導入，表達載體向培養細胞的導入，培養細胞的培養，抗體的純化等，與上述嵌合抗體的制備同樣進行。
通常，多數情況下，僅置換了互補性決定區域的氨基酸的人源化抗體其抗原結合活性比原來的小鼠抗體低。因此，原小鼠抗體及互補性決定區域周邊的幾個氨基酸經常一起移植。再者，為了增加結合活性、提高親和性，不僅可改變構架區而且可改變可變區的氨基酸序列(1個或多個氨基酸置換、插入、缺失等)，如此制備的抗體也包含在本發明的人源化抗體中。
以人抗體為模板，移植小鼠抗體互補性決定區域為中心的氨基酸序列，制備表達可變區的基因，用與制備上述嵌合抗體時同樣的制備方法獲得人源化抗體。
上述嵌合抗體及人源化抗體(以下稱作“重組OPN抑制抗體”)具有與源小鼠抗體同等的抗原活性，且解決了誘導抗原性和半衰期縮短等問題。
必要時可對所得重組OPN抑制抗體進行純化，然后按常規方法進行制劑化，可用于類風濕性關節炎、幼年性關節風濕病和慢性風濕病等風濕病、銀屑性關節炎、銀屑病等的治療，臟器移植后的慢性排斥反應的抑制，全身性自身免疫性疾病、紅斑、葡萄膜炎、貝赫切特疾病、多發性肌炎、絲狀體增殖性腎炎、結節病等自身免疫性疾病的治療。
本發明的重組OPN抑制抗體優選可作為風濕病治療劑或類風濕性關節炎治療劑應用。風濕病治療劑等的劑型的實例可以是注射劑、點滴劑等非經口劑，優選靜脈內施用、皮下施用等(作為自身免疫性疾病治療劑時也可參照該標準)。對于制劑化而言，可在藥學允許的范圍內使用與其劑型相對應的載體和添加劑。
上述制劑化中重組OPN抑制抗體的添加量根據患者癥狀的輕重、年齡和所使用的制劑的劑型或重組OPN抑制抗體的結合力等而有所差異，例如0.1mg/kg-100mg/kg。
如此所得本發明的治療劑，其有效成分重組OPN抑制抗體與OPN的RGD序列和SVVYGLR序列強力結合，通過抑制OPN該部分與整合素的結合，結果能壓制風濕病、類風濕性關節炎及其之外的自身免疫性疾病的癥狀的惡化。
因為本發明的重組OPN抑制抗體與OPN側而非整合素側特異性結合，所以很少抑制整合素的其它重要的功能，從而避免了整合素副作用的問題。
本發明的重組OPN抑制抗體也可用于篩選自身免疫性疾病治療劑的目的。即，如前所述，抑制OPN的RGD序列與整合素的結合及SVVYGLR序列與整合素的結合的化合物，可成為自身免疫性疾病的治療劑。例如，在存在一定量的重組OPN和整合素的測定體系內構成競爭性添加被篩選物質(待檢物質)與重組OPN抑制抗體的反應體系，測定所使用量的重組OPN抑制抗體對OPN-整合素間結合的抑制程度，從而評價待檢物質作為自身免疫性疾病治療劑利用的可能性。
同樣，抑制OPN的RGD序列與整合素的結合及SVVYGLR序列與整合素的結合的化合物可作為風濕病乃至類風濕性關節炎的治療劑，應用重組OPN抑制抗體，構成與上面同樣的反應體系，可用于風濕病乃至類風濕性關節炎的篩選。
再者，本發明的重組OPN抑制抗體可作為風濕病診斷劑利用。如前所述，已明確類風濕性關節炎患者的關節中可發現高濃度的經凝血酶酶切產生的OPN的N末端片段。因此，應用該重組OPN抑制抗體測定檢測體系中OPN或其N末端片段的量，有利于風濕病的診斷。作為其檢測手段，可利用放射性同位素免疫測定法(RIA法)、ELISA法(E.Engvall等，(1980)Methods in Enzymol.，70，419-439)、熒光抗體法、空斑法、斑點法、凝集法、二維雙向擴散(Ouchterlony)等普通免疫化學測定法中使用的各種方法(“雜交瘤法和單克隆抗體”，R&D Planning發行，第30-53頁，1982年3月5日)。
可根據不同的出發點適當選擇上述方法，但從靈敏度、簡便性等考慮的話，優選ELISA法。較優選的方法的具體例，如將本發明的重組OPN抑制抗體固化到載體上，通過標記識別OPN的部位不同于本發明的重組OPN抑制抗體的抗體，可檢測出OPN或其N末端的片段，該方法可用于類風濕性關節炎的診斷藥。
標記上述抗體所使用的標記物包括辣根過氧化物酶(以下稱作“HRP”)、堿性磷酸酶(以下稱作“AP”)等酶，異硫氰酸、羅丹明等熒光物質，32P、125I等放射性物質，化學發光物質等。
更具體的OPN同種型的檢測方法，以夾心法為例，其程序如下。即，首先(a)將針對本發明的OPN同種型的抗體固化到載體上，接著(b)用與抗原無關的物質，如蛋白質封閉未固化上抗體的載體表面。(c)加入含各種濃度的OPN同種型的待檢體，生成OPN同種型-抗體復合體后，(d)加入標記了的抗OPN同種型抗體，與固化的抗原-抗體復合體結合，最后(e)通過測定結合到載體上的標記量，根據預先制備的含量曲線來確定待檢體中游離的OPN同種型的含量。
首先，步驟(a)中，對用于固化抗體所使用的載體無特殊限制，可使用免疫化學測定法中常用的任何載體。例如，聚苯乙烯制的96孔微滴度板，或氨基結合型微滴度板。另外，固化抗體時，可將含有抗體的緩沖液加到載體上，進行溫育。可使用眾知的緩沖液，例如10mM的PBS。緩沖液中抗體的濃度可在一寬范圍內選擇，通常0.01-100μg/ml，優選0.1-20μg/ml。另外，緩沖液的量，使用96孔微滴度板作載體時，每孔300μl以下，更優選20-150μl/孔。再者，對溫育的條件無特殊限制，通常4℃一晚。
由于后面的步驟中添加的待檢體中的OPN存在與抗原抗體反應無關的吸附到載體的部分，所以步驟(b)中封閉的目的是防止這樣的非特異性吸附。作為封閉劑可使用如，牛血清白蛋白(BSA)和脫脂奶粉溶液作為封閉劑。或使用Block-Ace(Block-Ace，大日本制藥，郵編UK-25B)等市售的封閉劑。具體而言，無特殊限制，例如固化抗原的過程中可適量添加Block-Ace，4℃孵育一晚后，用緩沖液洗滌。作為緩沖液無特殊限制，例如10mM PBS(pH7.2)、0.8％(w/v)NaCl、0.02％(w/v)KCl、0.02％(v/v)Tween 20構成的緩沖液。
步驟(c)中，通過讓含OPN同種型的待檢體與固化抗體接觸，用固化抗體捕捉OPN同種型，生成固化抗體-OPN同種型復合體。反應無特殊限制，37℃大約1小時即可。反應終了后，用緩沖液洗滌載體，洗去未反應的蛋白質。該反應中所應用的緩沖液，優選由10mMPBS(pH7.2)、0.05％(v/v)Tween 20構成。
步驟(d)中，加入識別固化抗體捕捉到的OPN同種型的其它表位的標記抗體，形成固化抗體-OPN同種型-標記抗體復合體。反應終了后，用緩沖液洗滌載體，洗去未反應的蛋白質。該反應中應用的緩沖液與(c)中相同。
步驟(d)中所使用的標記抗體，要求它識別與(a)中的固化抗體不同的表位。例如，應用識別OPN同種型前半區域的多克隆抗體作為固化抗體時，優選識別OPN同種型后半區域的多克隆抗體作為結合了酶(例如HRP或AP)的標記抗體。由于應用識別不同表位的抗體，可高靈敏度且特異地測定由選擇性剪切而生成的OPN同種型。
步驟(d)中所使用的標記抗體的量，大約是結合到載體上的固化抗體的5000-10000倍，優選最終測定時，最大吸光度達1.5-2.0的這樣稀釋度的標記抗體進行反應。稀釋時可應用緩沖液，對反應無限定，大約37℃進行30分鐘，反應后，用緩沖液洗滌。通過以上反應，抗體-OPN同種型-標記抗體復合體結合到載體上。
最后，步驟(e)中，加入與固化抗體-OPN同種型-標記抗體復合體的標記物質反應的顯色底物溶液，測定吸光度，根據標準曲線算出OPN的含量。
使用過氧化物酶作為標記抗體的標記物時，可使用，例如含過氧化氫和3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)或鄰苯二胺(OPD)的顯色底物溶液。對顯色反應無限定，加入顯色底物溶液，25℃反應20分鐘后，加入1N硫酸終止酶反應。使用TMB時，根據450nm的吸光度測定顯色。另一方面，使用酶AP作為標記物時，用對硝基酚磷酸(p-NPP)作底物進行顯色，加入2N NaOH終止酶反應，測定415nm的吸光度。
添加已知濃度的OPN同種型，根據反應液的吸光度預先制作出標準曲線，由此計算出待檢體中的OPN同種型的濃度。
上述本發明的OPN同種型的檢測方法，可用于闡明OPN的作用和OPN相關疾病的診斷、治療。作為其使用方法的一實例列舉，通過區別檢測凝血酶酶切的OPN N端片段和非切斷型OPN，檢測出有無炎癥異常，例如區別風濕病和變形性關節炎的炎癥異常的檢測試劑盒。
如上所述，在類風濕性關節炎患者的關節腔內有尤其是經凝血酶酶切產生的OPN N端片段濃度增高的趨勢，但變形性關節炎患者中這種趨勢顯著性低。由于關節腔內N末端片段占OPN的比例依患者而不同，所以為了區別診斷風濕病和變形性關節炎，可測定總OPN中N末端片段所占的比例。
更具體的實例，OPN的3種同種型OPN-a、OPN-b和OPN-c中共同存在以下3種序列，分別制備與這些肽相對應的抗體。
CVDTYDGRGDSVVYGLRS(C+V153至S169) (1)KSKKFRRPDIQYPDATEC(K170至E187C) (2)IPVKQADSGSSEEKQC(117至Q31+C)(3)其中，序列(1)存在于凝血酶酶切部位的N末端側，普遍存在于凝血酶非切斷型全長OPN與N末端側片段上。另一方面，序列(2)存在于凝血酶酶切部位的C末端側，存在于凝血酶非切斷型全長OPN中，而在N末端側片段上不含有。另外，序列(3)對應OPN N端側17-31氨基酸殘基，普遍存在于凝血酶非切斷型全長OPN與N末端側片段上。作為鑒別風濕病患者和變形性關節炎患者的診斷試劑盒，利用與上述3種序列的肽分別相對應的抗體，由2種免疫檢測試劑構成。即用與上述序列(3)和(2)代表的肽相對應的抗體作為第一種免疫檢測試劑，對待檢體中兩種抗體共同識別的凝血酶非切斷型OPN進行定量。此時，將與序列(3)的肽相對應的抗體固化到載體上，與患者來源的待檢體反應，洗滌后，作為標記抗體加入與序列(2)的肽相對應的抗體，用與前面夾心法同樣的方法進行檢測。另外，用與上面序列(3)和(1)代表的肽相對應的2種抗體作為第二種免疫檢測試劑，對待檢體中兩種抗體共同識別的凝血酶非切斷型OPN和經凝血酶酶切而生成的N末端側片段的總量進行定量。此時，例如將與序列(1)的肽相對應的抗體固化到載體上，與患者來源的待檢體反應，洗滌后，作為標記抗體加入與序列(3)的肽相對應的抗體，用與前面夾心法同樣的方法進行檢測。比較同一患者待檢體用上述2種免疫檢測試劑檢測所得結果，可表明該患者中經凝血酶酶切而生成的N末端側片段占總OPN的比例，以區分風濕病和變形性關節炎。
實施例以下列舉實施例和參考例進一步詳細說明本發明，但本發明并不限定于此。本實施例中應用市售試劑盒或試劑的部分，按照所附說明書進行，除非有特殊說明。
實施例1GST-OPN融合蛋白的克隆、構建、純化及試劑基本上按照文獻(S.Kon等，(2000)J.Cell.Biochem.，77，487-498)中記載的方法進行克隆和蛋白純化。如下獲得人OPN的同種型a，b的cDNA。以從人腎癌細胞株NRC-12細胞制備的RNA為模板合成cDNA，以它為模板，應用下面的OPN-5、OPN-3引物進行PCR，分別獲得編碼包括信號肽區域的人OPN-a、OPN-b全長的cDNA。
接著，按文獻中記載的方法，將如此克隆出的OPN-a、OPN-b cDNA插入到pGEX4T載體(Amersham Pharmacia Biotech)中，使其與GST(谷光甘肽S-轉移酶，EC2.5.1.18)基因的讀碼框一致，用大腸桿菌JM109表達GST融合蛋白(以下，將如此而得的GST-OPN融合蛋白分別叫做GST-OPN-a、GST-OPN-b)。
OPN-55′-CGGGATCCACTACCATGAGAATTGCAGTGATTTGC-3′OPN-35′-CCGCTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGATGCACTATC-3′以上述OPN-a cDNA為模板，通過二步PCR制備編碼人OPN-c同種型cDNA。第一步用OPN-5和下面的OPNct-3引物，下面的OPNct-5和OPN-3引物分別進行PCR，將兩種PCR產物混合，加熱，緩慢冷卻退火，加入酶使之延長。第二步，用OPN-5和OPN-3引物進行PCR，獲得編碼包括信號肽區域的人OPN-c全長的cDNA。用與同種型a，b相同的方法，將同種型c cDNA重組到pGEX4T載體，制備GST融合蛋白(以后叫做GST-OPN-c)。
OPNc t-35′-ACACAGCATTCTTTTCCACAGAACTTCCAGAATCAGC-3′OPNc t-55′-TGAGGAAAAGAATGCTGTGTCCTCTGAAGAAAACC-3′以上述OPN-a cDNA為模板，用OPN-5和下面的OPNnh-3引物進行PCR，可獲得編碼OPN-a凝血酶斷開部位到氨基端部分(M1-R168)的cDNA。用與同種型a，b相同的方法，將其重組到pGEX4T載體，制備GST融合蛋白(以后叫做GST-Nhalf)。
OPNn h-35′-GCCTCGAGTTACCTCAGTCCATAAACCACACT-3′以OPN-a cDNA為模板，通過二步PCR制備OPN-a凝血酶斷開部位到羧基側的骨橋蛋白(hOPN Chalf)。第一步用OPN-5和下面的OPNch-3引物，下面的OPNch-5和OPN-3引物分別進行PCR。第二步，用OPN-5和OPN-3引物進行PCR，制備羧基側的OPN蛋白質。用與同種型a，b相同的方法，將其重組到pGEX4T載體，制備GST融合蛋白(以后叫做GST-Chalf)。
OPNc h-35′-TCTTAGATTTGGCACAGGTGATGCCTAGGAG-3′OPNc h-55′-CACCTGTGCCAAATCTAAGAAGTTTCGCAGA-3′按常規方法從大腸桿菌制備各種重組的GST-OPN融合蛋白，按上述文獻中記載的方法，使用谷光甘肽-葡聚糖柱進行純化。其中，GST-Nhalf蛋白，通過用預切裂蛋白酶(PreScission，AmershamPharmacia Biotech)切開連接部分，可去除GST蛋白部分，獲得僅由OPN氨基端部分(I17-R168)構成的蛋白(以后叫做nOPN)。
另一方面，將編碼OPN-a全長(M1-N314)的cDNA插入到pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen)中，轉化CHO-K1細胞(大日本制藥(株)社)(以下叫做CHO/OPN-a細胞)。由該細胞得到糖鏈結合型OPN-a(以下叫做CHO/OPN-a)，如下進行純化。即，應用DEAE-葡聚糖CL-6B柱(Amersham Pharmacia Biotech)的離子交換色譜，應用MLTROGEL Ac44柱(BioSepra SA)的凝膠過濾色譜，然后應用RESOURCE PRC柱(Amersham Pharmacia Biotech)的逆相色譜，對CHO/OPN-a細胞的培養上清進行純化。
用于免疫致敏和結合研究的各種肽可從Sigma Genosis Japan購買，或用肽合成儀(432A型，PerkinElmer Life Science，Inc.)按照Fmoc(N-(9-芴基)甲氧碳酰)法進行化學合成，然后用C18逆相色譜進行純化獲得。
實施例2小鼠單克隆抗體的制備準備與如下所示的人OPN內部序列對應的合成肽，用于免疫。
肽1CVDTYDGRGDSVVYGLRS(C+V153至S169)肽2CIDSQELSKVSREFHSH(C+I261至H276)其中，肽1具有分別識別αvβ3和α9β1整合素受體的RGD序列和SVVYGLR序列。
將這些肽與甲狀腺球蛋白(thyroglobulin)結合，按常規方法免疫小鼠。然后，從免疫小鼠分離出脾細胞(splenocytes)，用聚乙二醇介導與小鼠骨髓瘤細胞P3-X63-Ag8-653的細胞融合。然后，按文獻(M.Kinebuchi等，(1991)J.Immunol.，146，3721-3728)中敘述的方法篩選出與免疫時使用的肽反應的雜交瘤。
從用肽1和肽2免疫的小鼠中分別獲得命名為2K1和4C1的單克隆抗體。生產單克隆抗體2K1的雜交瘤以FERM BP-7883保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物保藏中心(305-8566日本國茨城縣つくば市東1丁目1番地1中央第6)。另外，單克隆抗體53(mAb53)是用全長重組人OPN免疫而得的抗體(D.S.Bautista等，(1994)JBC，269，23280-23285)。
實施例3OPN及其凝血酶消化物與小鼠單克隆抗體的反應性
用Western Blotting法試驗實施例2中所得小鼠單克隆抗體2K1(以下叫做小鼠2K1抗體)和4C1對OPN及其凝血酶消化物的結合能力。發現小鼠2K1抗體可與GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Nhalf反應。另外，4C1抗體與GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Chalf反應。此外，這些單克隆抗體不僅可與大腸桿菌生產的糖鏈非結合型重組OPN結合，而且可與糖鏈結合型CHO/OPN-a蛋白及其凝血酶消化物(以下叫做凝血酶剪切OPN)反應。
實施例4小鼠單克隆抗體對OPN的細胞粘附作用的抑制用以下方法研究小鼠單克隆抗體是否抑制OPN的細胞粘附作用。首先，將各種濃度的CHO/OPN-a鋪到96孔板中，4℃一晚，然后37℃條件下，用5％BSA的PBS處理10分鐘，以封閉非特異性吸附。將用人成纖維細胞TIG-7或整合素α9亞基cDNA轉化的SW480細胞(以下叫做α9轉化SW480細胞)懸浮到含0.25％BSA的D-MEM中，將200μl細胞懸液(細胞濃度為5×104細胞/孔)加到各種濃度的單克隆抗體或合成肽存在或不存在下的條件下，用CHO/OPN-a或nOPN包被的96孔板中，37℃孵育1小時。
從板中去除培養基，用含0.25％BSA的D-MEM將各孔洗滌2次。接著固定細胞，用0.5％溶于20％甲醇的結晶紫溶液染30分鐘。
用水將各孔洗3次，用20％的醋酸溶解粘附的細胞。用immunoreader分析各孔所得結果物的上清，測定590nm的吸收，以求出各孔粘附的細胞的相對數目。所有的測定進行3次，至少進行3個獨立的實驗。所顯示的數值至少是3次獨立實驗的平均值。
已知TIG-7能很好地粘附到OPN上，如圖1A所示，GRGDSP肽(100μg/ml)可明顯抑制這種粘附，對照肽(OPN的C末端部分K296-N314)(100μg/ml)沒有抑制，表明其粘附是RGD依賴性的。另外，如圖1B所示，200μg/ml的小鼠2K1抗體抑制對OPN的細胞粘附。如圖1C所示，小鼠2K1的細胞粘附抑制效果可與mAb53相媲美，是濃度依賴性的。小鼠2K1及mAb536不抑制TIG-7在玻基粘連蛋白(VN)和纖粘連蛋白(FN)上的粘附。
圖2表示單克隆抗體對α9轉化SW480細胞與nOPN和玻基粘連蛋白間粘附的抑制。如圖2A所示，200μM的GRGDSP肽(RGD)可抑制1μg/ml玻基粘連蛋白與α9轉化SW480細胞間的粘附，所以粘附是RGD依賴性的。200μM的GRGDSP肽(RGD)與抗α9β1單克隆抗體Y9A2(A.Wang等，(1996)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，15，664-672)聯合應用可抑制3μg/ml nOPN與α9轉化SW480細胞間的粘附，所以是RGD依賴性和非依賴性粘附。另外，圖2B表示小鼠2K1抗體對α9轉化SW480細胞與nOPN和玻基粘連蛋白間粘附的影響。小鼠2K1抗體不能抑制α9轉化SW480細胞與玻基粘連蛋白間的粘附，但可抑制與nOPN間的粘附。該結果表明小鼠2K1抗體具有抑制RGD依賴性粘附的能力。
實施例5小鼠單克隆抗體對OPN誘導的單核細胞遷移的抑制應用ChemoTx101-8系統(Neuro Probe Inc.)進行應用U937細胞的細胞遷移試驗。用含0.1％BSA的DMEM將細胞調整為2×106細胞/ml，加到濾膜(孔徑8μm)的上層，將OPN蛋白質加到下層。
ChemoTx板37℃、5％CO2條件下靜置4小時。然后，用甲醇固定膜，用蘇木精和伊紅(H-E)染色。顯微鏡下，400倍放大的條件下，計算遷移到濾膜里面的細胞數。進行3次實驗，其均值作為數據。其結果如圖3所示。
圖3a表示在所示濃度下，U937細胞對CHO/OPN-a、凝血酶剪切OPN和GST-Nhalf的細胞遷移。另外，圖3b表示在50μg/ml抗原特異性純化小鼠2K1抗體、mAb53或小鼠IgG對照存在或不存在的條件下，應用10μg/ml的各OPN的抑制測定。
如圖3a和3b所示，CHO/OPN-a、凝血酶剪切OPN和GST-Nhalf濃度依賴性誘導人單核細胞U937的遷移(A)。小鼠2K1抗體明顯抑制CHO/OPN-a、凝血酶剪切OPN和GST-Nhalf誘導的單核細胞遷移。與此相對，mAb53僅抑制全長OPN誘導的單核細胞遷移(B)。
參考例1OPN與關節炎的誘發為了證明OPN在關節炎中的作用，按常規方法人工制備OPN基因缺陷小鼠(S.R.Rittling等，(1998)J.Bone Mminer.Res.，13(7)，1101-1111)，與正常小鼠比較。
應用市售的誘發關節炎藥劑-誘發關節炎用單克隆抗體雞尾酒(商品名關節炎用雞尾酒，Arthrogen-CIAmAb，Arthritogenic mAbcocktail，巖井化學藥品社制)，按照產品說明書，分別施用給OPN基因缺陷小鼠(OPN-/-)和正常小鼠(OPN+/+)，誘發關節炎，觀察其程度。給兩種小鼠施用生理鹽水作為對照。
如下用關節炎分數、施用10天后腕部的腫脹比較關節炎的程度。其結果示于圖4和圖5中。
圖4表明，施用關節炎用雞尾酒/脂多糖(以下記做LPS)的正常小鼠，從第4天開始關節炎分數上升，到第10天達到最高(12以上)。與此相對，OPN基因缺陷小鼠從第5天開始關節炎分數上升，但最高達4以下。另外，施用生理鹽水的任何組中均未見關節炎分數上升。
如圖所示，OPN基因缺陷小鼠的腕部腫脹(手腕腫脹)明顯弱于正常小鼠，這表明OPN與關節炎相關。
實施例6小鼠2K1抗體對人末梢血白細胞遷移的抑制活性按以下方法檢驗小鼠2K1抗體對細胞因子活化的人末梢血白細胞遷移的抑制活性。對中性粒細胞遷移的抑制活性的結果示于表1中，對單核細胞遷移的抑制活性的結果示于表2中。
<實驗方法>
用Ficoll法從健康人的末梢血分離出單核細胞和中性粒細胞(P.M.Dafatrian等，(1996)Journal of Immunology，157，12-20)。收集Ficoll和血清中間層的細胞，放到培養瓶中，37℃培養1小時后，應用粘附的細胞作為單核細胞。將5倍體積的3％葡聚糖-PBS加到收集單核細胞后余下的紅細胞層，使紅細胞凝集，150×g、4℃離心5分鐘。
凝集的紅細胞沉淀，中性粒細胞懸浮于上清中，將該級分500×g、室溫離心20分鐘，獲得中性粒細胞。將如此得到的單核細胞和中性粒細胞在人TNFα(20ng/ml)中培養一晚，應用活化的細胞進行遷移試驗。
用48孔微量趨化性小室(micro chemotaxis chamber)(Neuro ProbeInc.)進行遷移試驗。向凝血酶剪切的OPN中添加各種濃度的小鼠2K1抗體，在37℃預先放置15分鐘，然后加入到低層小室(LowerChamber)中(人OPN的終濃度為10μg/ml)。其上面加載聚碳酸酯的濾器(孔徑5μm)，再將50μl細胞懸液(2×106細胞/ml)加到上層小室(Upper Chamber)。
37℃、5％CO2條件下培養2小時，取下聚碳酸酯濾器，除去濾器上表面的細胞，用Diff-Quick(Baxter)對浸潤到里側的細胞進行染色。在40倍放大率下計算著色的細胞數。該結果用6孔的平均細胞數(細胞/mm3)±SD表示。
<實驗結果>
小鼠2K1抗體抑制TNFα活化的人末梢血單核細胞和中性粒細胞向凝血酶剪切的OPN的遷移。
中性粒細胞遷移抑制[表1]

**p＜0.01(單方ANOVA，Dunnett’s檢驗)單核細胞遷移抑制

**p＜0.01(單方ANOVA，Dunnett’s檢驗)實施例7嵌合2K1抗體表達質粒的構建參照國際公開號WO94/20632國際公開中記載的抗HIV單克隆抗體(C25抗體)嵌合抗體的制備方法，將實施例2中所得小鼠2K1抗體的重鏈可變區(VH)基因與人Igγ1基因連接，輕鏈可變區(VL)基因與人Igκ基因連接，制備嵌合2K1抗體(以下稱作嵌合2K1抗體或C2K1抗體)。
首先，用ISOGEN試劑(Nippo Gene)從產生小鼠2K1抗體的雜交瘤中提取mRNA，以此為模板，用pd(N)6 Random Hexamer和Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads(均為Amersham Biosciences公司產品)合成cDNA。
然后，以該cDNA為模板，應用按照Kabat的V區和J區核酸序列分類(Immunogical Interest 4thed.，Public Health Service，NIH，Washington DC，1987)設計的如下所示的與小鼠2K1抗體VH基因引導序列相對應的引物和與VH基因的J區相對應的引物，用ExTaqDNA聚合酶(寶酒造)擴增VH區。
引導序列引物(VH)5’-TTCGAAGCTTGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGATCTTT-3’
J區引物(VH)5’-GAAGATCTGGATCCACTCACCTGAGGAAACTGTGA-3’為了進行克隆，這里所用的對應引導序列的引物和對應J區的引物分別包含限制性內切酶HindIII的識別序列和BamHI的識別序列。
與VH基因同樣，用如下所示的與VL基因引導序列相對應的引物和與J區相對應的引物，獲得兩端具有HindIII識別序列和BamHI識別序列的VL基因片段。
引導序列引物(VL)5’-CTTAAGCTTGCCGCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTG-3’J區引物(VL)5’-CTAGATCTGGATCCACTTACGTTTCAGCTCCAGCTT-3’用HindIII和BamHI(均為寶酒造)消化所得VH、VL基因片段，分別重組到表達載體AG-γ1、AG-κ(國際公開WO94/20632)中。其中，AG-γ1具有β-肌動蛋白啟動子，人免疫球蛋白恒定區γ1鏈的基因及選擇性標志新霉素耐性基因(neo)，將γ1基因上游的HindI識別序列和BamHI識別序列間插入小鼠2K1抗體VH基因，獲得能表達嵌合抗體重鏈的質粒。另外，AG-κ具有β-肌動蛋白啟動子，人免疫球蛋白恒定區κ鏈的基因及選擇性標志二氫葉酸還原酶基因(dhfr)，同樣，將小鼠2K1抗體VL基因插入到κ基因上游的HindIII識別序列和BamHI識別序列間，獲得能表達嵌合2K1抗體輕鏈的表達載體。
用常規方法將這些表達質粒導入大腸桿菌HB101中，大量培養，用EndoFree Plasmid Mega Kit(QIAGEN)進行純化。
實施例8嵌合2K1抗體的表達混和上述實施例7中純化的嵌合2K1抗體重鏈、輕鏈的表達載體，通過常規的磷酸鈣法轉染CHO-DG44細胞株。用添加了0.5mg/mlGeneticin(Invitrogen)和10％通過透析除去核苷酸的FCS(Invitrogen)的MEM培養基進行篩選，獲得產生嵌合2K1抗體的轉化細胞。
在500ml添加了2％透析了的FCS的MEM培養基中培養該細胞，將所得培養上清過Protein A柱(Amersham Bioscience)，然后對PBS進行透析，獲得純化的嵌合2K1抗體。用DC蛋白質測定方法(BIO-RAD)測定純化嵌合2K1抗體的濃度。最終獲得1.4mg的純化抗體。
實施例9嵌合2K1抗體對人末梢血單核細胞遷移的抑制活性如下檢測實施例8中所得純化嵌合2K1抗體對細胞因子活化的末梢血單核細胞遷移的抑制活性。
首先，用RPMI1640培養基2倍稀釋用肝素從健康人所采血液。將稀釋的血液重懸到Ficoll-Paque(Ficoll-Paque，Pharmacia)中，400×g室溫離心30分鐘。回收血漿與Ficoll-Paque交界面可見的白色層，作為單核細胞。將所得單核細胞與人TNFα(20ng/ml)共培養一晚，應用活化的細胞進行遷移試驗。
用48孔微量趨化性小室(micro chemotaxis chamber)(Neuro ProbeInc.)進行遷移試驗。人OPN與牛凝血酶(Sigma)一起37℃反應2小時，進行消化。將添加各種濃度的2K1嵌合抗體在37℃預先放置15分鐘，然后加入到下層小室中(人OPN的終濃度為10μg/ml)。其上面加載聚碳酸酯的濾器(孔徑5μm)，再將50μl細胞懸液(2×106細胞/ml)加到上層小室。
37℃、5％CO2條件下培養2小時，取下聚碳酸酯濾器，除去濾器上側表面的細胞，用Diff-Quick(Baxter)進行染色。在40倍放大率下計算上側濾器表面的細胞數，結果用6孔的平均細胞數(細胞/mm3)±SD表示。
結果如表3所示，嵌合2K1抗體抑制TNFα活化的末梢血單核細胞對凝血酶單側切斷型OPN的遷移。
單核細胞遷移抑制[表3]

*p＜0.05，**p＜0.01(單方ANOVA，Dunnett’s檢驗)實施例10嵌合2K1抗體的KD值測定如下測定嵌合2K1抗體的KD值。首先，用生物素化試劑盒((株)同仁化學研究所)對骨橋蛋白部分肽GRGDSVVYGLR進行生物素化。將傳感器芯片裝到BISCORE-2000中，使23RU結合配體(Bin-GRGDSVVYGLR)。然后，小鼠2K1抗體作為分析物流過，得到圖6a所示的傳感器圖。另外，嵌合2K1抗體作為分析物流過，獲得圖6b所示的傳感器圖。這里，各圖的橫軸表示時間，縱軸表示相對反應(Relative response，RU)。用BISCORE公司的分析軟件BIAEvaluation Version3.0在global fitting 1∶1的條件下分析傳感器圖中的數據。結果如圖6所示。圖6a為各種濃度的小鼠2K1抗體的傳感圖；圖6b為各種濃度的嵌合2K1抗體的傳感圖。
測定結果是，小鼠2K1抗體的KD值為1.2×10-10M；嵌合2K1抗體的KD值為9.2×10-11M。未看到因小鼠2K1抗體的嵌合化而造成嵌合2K1抗體親和力的降低。
實施例11人源化2K1抗體基因的制備移植小鼠2K1抗體的VH和VL中互補性決定區域(CDR)氨基酸的人模板抗體選自其氨基酸序列與小鼠2K1抗體的VH和VL構架(FR)的氨基酸序列高度同源的人抗體種系。具體而言，選擇整合了JH6(Accession No.X69866)的DP-88(Accession No.Z49804)作為人VH模板，整合了Jκ2(Accession No.AJ399904)的DPK-18(Accession No.X93635)及整合了Jκ2的DPK-13(AccessionNo.X93631)作為人VL模板。小鼠2K1抗體的VH氨基酸序列(SEQID NO19)和VL氨基酸序列(SEQ ID NO20)與人模板抗體的VH和VL氨基酸序列的比較分別示于圖7和圖8。CDR的范圍按Kabat等的分類方法顯示。
VH的CDR具有下述氨基酸序列。
CDR1(SEQ ID NO21)DYEMHCDR2(SEQ ID NO22)AIHPGRGGTAYNQKFKGCDR3(SEQ ID NO23)ITGYFDVVL的CDR具有下述氨基酸序列。
CDR1(SEQ ID NO24)RSSQSIVHSNGNTYLECDR2(SEQ ID NO25)KVSNRFSCDR3(SEQ ID NO26)FQGSHVPLT將小鼠2K1抗體的VH、VL必要的氨基酸序列移植到上述人模板抗體中，制備出人源化抗體。具體而言，用小鼠2K1抗體的CDR氨基酸序列置換CDR氨基酸序列，設計編碼該氨基酸序列的DNA堿基序列，然后，如下所述，應用PCR及基因重組技術制備具有設計的核酸序列的基因片段。VL中僅FR2采用與小鼠2K1抗體的同源性更高的DPK-13氨基酸序列，其它的FR部分采用DPK-18。VH中僅FR4采用JH6的氨基酸序列，其它FR部分采用DP-88。
上面制備的人源化抗體(以下有時稱作R2K1抗體)的VH、VL氨基酸序列及編碼它們的堿基序列，分別記載于圖9(SEQ ID NO27和28)和圖10(SEQ ID NO29和30)中。這里使用與PCT國際公開號WO94/20632中記載的人源化抗HIV單克隆抗體(RC25抗體)相同的抗體誘導序列(圖9和圖10中下劃線部分)。另外，編碼VH、VL的堿基序列的兩端添加了HindIII識別序列和BamHI識別序列，以利于克隆。
實際上，為了獲得具有圖9和圖10所示堿基序列的DNA片段，可全部以oligo-DNA為材料，通過PCR進行合成。具體而言，針對VH，如圖11所示，設計合成6條oligo-DNA(SEQ ID NO31-36)以覆蓋圖9中VH堿基序列的全長；應用它們按如下順序進行PCR。即，混和6種oligo-DNA作為模板，各10pmol，應用Pyrobest DNA聚合酶(寶酒造)，按96℃20秒、55℃30秒、72℃3分鐘的步驟，進行10個循環。然后，以1μl PCR產物為模板，以具有圖11中下劃線部分序列的oligo-DNA(SEQ ID NO37-38)為引物，應用PyrobestDNA聚合酶，按96℃20秒、72℃3分鐘的步驟，進行25個循環，由此擴增出全長VH。應用Zero Blunt PCR Cloning kit(Invitrogen)將所得DNA片段連接到pCR-Blunt載體上，然后導入大腸桿菌進行克隆。用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)從所得大腸桿菌中制備質粒DNA，以此為模板，用M13-M4引物和M13-RV引物(均為寶酒造)和CEQ DTCS-Quick Start Kit(BECKMAN COULTER)進行測序反應，通過CEQ 2000自動測序儀(BECKMAN COULTER)解讀克隆出的DNA的堿基序列，得到與圖9中設計的堿基序列一致的克隆。
VL時，應用圖12中所示的6條oligo-DNA(SEQ ID NO39-44)，進行與上面同樣的10個循環的PCR后，用其擴增產物作模板，以有圖12中下劃線部分序列的oligo-DNA(SEQ ID NO45和46)為引物，進行與上面同樣的25個循環的PCR。其后，進行與VH同樣的操作，得到與圖10中設計的堿基序列一致的克隆。
實施例12人源化2K1抗體表達質粒的制備與實施例7中記載的制備嵌合2K1抗體表達載體同樣，制備人源化2K1抗體表達質粒。用常規方法，從實施例11中制備的具有人源化2K1抗體VH、VL基因的克隆中提取質粒DNA，用HindIII和BamHI消化，得到VH、VL的DNA片段，分別裝到前述的表達載體AG-γ1、AG-κ中。將所得人源化2K1抗體重鏈、輕鏈的表達載體導入大腸桿菌，大量培養，以此為基礎，純化轉染用的重鏈、輕鏈的表達質粒DNA。
實施例13人源化2K1抗體的表達混和實施例12制備的人源化2K1抗體重鏈、輕鏈的表達質粒，通過磷酸鈣法轉染CHO-DG44細胞株。用添加了0.5mg/ml Geneticin和10％透析過的FCS的MEM培養基培養3天，獲得培養上清，用ELISA法確認其中所含人源化2K1抗體的抗原結合活性。首先，用來源于兔的抗人IgG Fc抗體(CAPPEL)和protein A-HRP(ZYMED)進行夾心ELISA，測定培養基中所含人源化2K1抗體的濃度。此時，可制備市售人IgG1抗體(Biogenesis)的系列稀釋液，以此作為標準品。另外，也可應用上述ELISA對前面的嵌合2K1抗體進行濃度測定。
實施例14嵌合2K1抗體及人源化2K1抗體與骨橋蛋白肽結合性的確認以實施例13中測定的人源化2K1抗體及嵌合2K1抗體的濃度為基礎，參照今等的ELISA法(Journal of Cellular Biology，88420-432(2002))，比較人源化2K1抗體及嵌合2K1抗體對骨橋蛋白肽(CVDTYDGRGDSVVYGLRS)的結合活性。
將BSA交聯的骨橋蛋白肽(BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS)固定到微滴度板上，系列稀釋的人源化2K1抗體及嵌合2K1抗體與之反應，結合了BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS的抗體與proteinA-HRP反應，最后與TMB(同仁化學研究所)反應，在450nm處測定吸光度。
另外，用只固定了BSA的板上的反應作為陰性對照，進行同樣地測定。結果如圖13所示。
圖13中，橫軸為抗體濃度，縱軸為吸光度。●表示嵌合2K1抗體對BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS的結合性；■表示人源化2K1抗體對BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS的結合性。另外，作為陰性對照，○表示嵌合2K1抗體對BSA的結合性；□表示人源化2K1抗體對BSA的結合性。
結果，人源化2K1抗體和嵌合2K1抗體對BSA無結合性，只對BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS顯示結合活性，由此可以判斷這些抗體的結合活性是骨橋蛋白肽特異的。另外，兩種抗體對BSA-CVDTYDGRGDSVVYGLRS的結合活性在同一水平。
如前所述，嵌合2K1抗體與源小鼠2K1抗體具有同等的抗原結合活性，這表明按本發明制備的人源化2K1抗體與源小鼠2K1抗體具有同等的抗原結合活性。
實施例15M5抗體的制備準備下面與小鼠OPN內部序列(C+V138-153)相對應的肽，用于免疫。
M5肽CVDVPNGRGDSLAYGLR將該肽與甲狀腺球蛋白結合，按常規方法免疫兔子。收集免疫兔的抗血清，應用通過二硫鍵而結合了M5肽N末端半胱氨酸與巰基葡聚糖珠(Amersham Pharmacia Biotech)的柱子制備M5抗體。
實施例16OPN及其凝血酶消化物與M5抗體的反應性應用Western Blotting方法進行實施例15中所得M5抗體與OPN及其凝血酶消化物結合能力的實驗。應用CHO細胞產生的糖基化形式的重組小鼠OPN。M5抗體與OPN及其凝血酶消化物反應。
實施例17M5抗體對細胞對OPN粘附的抑制用文獻(S.Kon等，(2002)J.Cell.Biochem.，84(2)，420-432)中敘述的方法檢測M5抗體是否抑制細胞對OPN的粘附。使用經PreScission蛋白酶(Amersham Pharmacia Biotech)除去了GST的全長小鼠OPN(以下記做mOPN/de-GST)。使用小鼠NIH3T3細胞。
如圖14所示，NIH3T3細胞對mOPN/de-GST的粘附呈濃度依賴性。另外，如圖15所示，GRGDSP肽(100μg/ml)明顯抑制這種粘附，表明是RGD依賴性的。圖16表明，200μg/ml的M5抗體抑制細胞對OPN的粘附。
實施例18M5抗體對小鼠脾臟來源的單核細胞遷移的抑制活性按以下方法檢測M5抗體對細胞因子活化的小鼠脾臟來源的單核細胞遷移的抑制活性。結果示于表4中。
<實驗方法>
在載玻片上研磨C57BL/6小鼠的脾臟細胞，以制備單個細胞，在培養瓶中37℃培養1小時，粘附的細胞用作單核細胞。將單核細胞與人TNFα(20ng/ml)共培養一晚，用活化的細胞進行遷移試驗。用與前面實施例6中人同樣的方法進行遷移試驗。
<實驗結果>
M5抗體抑制TNFα活化的小鼠脾臟來源的單核細胞對用牛凝血酶(Sigma)消化全長小鼠OPN(Genzyme)而得到的凝血酶切斷型小鼠OPN的遷移。


*p＜0.05(單方ANOVA，Dunnett’s檢驗)實施例19
M5抗體的骨破壞抑制作用按以下方法檢測M5抗體在小鼠顱蓋器官培養體系中的骨破壞抑制作用。結果示于表5中。
<實驗方法>
切下出生后第1天的新生鼠的顱蓋骨，調整大小后，將其一半加入到24孔板的各孔中。向其中加入添加了終濃度為10nM的人甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)的DMEM培養基(添加10％牛血清)，引起骨破壞。添加終濃度達200μg/ml的M5抗體。37℃培養1周后，從骨頭釋放到培養液中的鈣含量用Calcium E TestWAKO(和光純藥)對從骨頭釋放到培養液中的鈣含量進行定量。
<實驗結果>
未添加PTH時，鈣值為7.02mg/ml，添加PTH后達9.11mg/ml，可以看出PTH的添加促進了骨鈣的游離。可以確認，添加200μg/ml的M5抗體，可70％抑制骨吸收。


**p＜0.01(單方ANOVA，Dunnett’s檢驗)實施例20M5抗體在小鼠膠原性關節炎模型中的效果按以下方法檢測M5抗體在小鼠膠原性關節炎模型中的效果。對關節炎分數的結果如表6所示，對腿浮腫的結果如表7所示，對體重變化的結果如表8所示，對攝食變化的結果如表9所示。
<實驗方法>
用識別膠原特異的4個表位的關節炎誘發抗體雞尾酒(商品名關節炎用雞尾酒，Arthrogen-CIAmAb，Arthritogenic mAb cocktail，巖井化學藥品社制)誘發關節炎。靜脈內施用該關節炎用雞尾酒，3天后腹腔內施用LPS(100μg)，誘發小鼠關節炎。施用LPS后第3天開始觀察到關節炎，到第6天達最大。
施用LPS之前和施用3天后，靜脈內施用M5抗體，用量為40μg、對照組中應用兔IgG(400μg)。另外，施用LPS之前和施用3天后，靜脈內施用抗TNF-α抗體，用量為200μg/只。對照組中應用大鼠IgG(200μg)。另外，從LPS施用日開始施用MTX，每天一次(3.2mg/kg)。此時，MTX溶解到5ml 0.5％甲基纖維素溶液中。對照組應用5ml 0.5％甲基纖維素溶液。
進行與關節炎分數、腿浮腫、體重變化、攝食量4項相關的評價，每組5只。
<實驗結果>
如表6-9所示，在小鼠關節炎模型(治療效果)中，M5抗體明確抑制關節炎分數的改善、發病延遲和腿浮腫的改善等。對關節炎發病呈用量依賴性抑制，其程度超過了施用抗TNF-α抗體(施用量200μg/只)的效果。而MTX幾乎無藥效。
本模型的正常組中，在施用LPS后3天，觀察到體重顯著減輕約3g，該傾向持續到第3-6天，雖然減少率比較緩和。與此相對，M5抗體施用組(150μg，400μg)和抗TNF-α抗體施用組組中可看到體重減少明顯改善。另外，對于攝食量，施用LPS后第3天，任何藥劑均可看到體重快速減少，但到3-6天，M5抗體施用組和抗TNF-α抗體施用組中可看到改善。對關節炎分數的結果如表6所示，對腿浮腫的結果如表7所示，對體重變化的結果如表8所示，對攝食變化的結果如表9所示。


**P＜0.01，*P＜0.05(無參數Mann-Whitney檢驗)

*P＜0.05(無參數Mann-Whitney檢驗)


**p＜0.01，*p＜0.05(單方ANOVA，Dunnett’s檢驗)


表8



表9



實施例21OPN相關片段肽的獲得從Auspep(Auspep Inc.，Parkiville，Australia)購買HPLC色譜純化的OPN相關片段肽。其氨基酸序列如下面(1)-(3)所示。
hOPN5CVDTYDGRGDSVVYGLRS(C+V153至S169) (1)hOPN3KSKKFRRPDIQYPDATDEC(K170至E187+C) (2)hOPN1IPVKQADSGSSEEKQC(I17至Q31+C)(3)實施例22免疫用抗原的制備按EMCS(N-(6-maleimidocaproyloxy)-琥珀酰亞胺)法，如下制備OPN相關片段肽與甲狀腺球蛋白的結合體，作為免疫原。制作結合體時，甲狀腺球蛋白與OPN相關片段肽和EMCS的摩爾比為1∶300∶400。
將實施例21中的各OPN相關片段肽4mg分別溶解到1ml蒸餾水中。另一方面，將5mg的甲狀腺球蛋白溶解到1ml 0.01M磷酸緩沖液(pH7.0)中，與80μg/μl用二甲基亞砜溶解的EMCS分別按上述摩爾比混和，制備甲狀腺球蛋白-EMCS復合體溶液。將該復合體溶液分成3份，按上述摩爾比分別加入OPN相關片段肽溶液，制備EMCS交聯的OPN相關片段肽與甲狀腺球蛋白的結合體溶液。
用PBS透析該結合體溶液，將結合體的濃度調整為10/μl。用所得OPN相關片段肽與甲狀腺球蛋白的結合體作為免疫原。
實施例23用于篩選的抗原的制備分別按照實施例1中所述方法制備GST與OPN相關片段肽的融合蛋白GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c、凝血酶斷裂部位氨基側的OPN片段(GST-Nhalf)及羧基側的OPN片段(GST-Chalf)，作為篩選用OPN蛋白質，用于抗血清對OPN的反應性。
實施例24免疫致敏用實施例22中所得OPN相關片段肽與甲狀腺球蛋白的結合體作為免疫原免疫兔子。每1周或2周施用結合體溶液100μl(100μg)進行免疫。初次免疫時抗原與氟氏完全佐劑混和，第二次與氟氏不完全佐劑混和。免疫8次后，采血，分離血清作為抗血清。
實施例25抗血清對OPN的反應性將實施例21中制備的OPN相關片段肽稀釋到0.1M碳酸緩沖液中(pH9.5)，濃度達10μg/ml，50μl/孔固化到96孔培養板中。
用PBS洗滌，用0.1％BSA/0.05％NaN3溶液封閉，然后將實施例24中所得抗血清的100倍稀釋液順次2倍稀釋，50μl/孔，37℃反應30分鐘。
反應終止后，用0.05％Tween 20-PBS洗滌4次，加入HRP標記的抗兔IgG(IBL)，50μl/孔，37℃反應30分鐘。反應終止后，加入含0.4mg/ml鄰苯二胺(OPD)和0.03％過氧化氫的0.05M檸檬酸緩沖液(pH49.5)，100μl/孔，室溫避光放置15分鐘，進行顯色反應。顯色后，每孔加入100μl 1N硫酸以終止反應，測定492nm的吸光度。
另一方面，用實施例23中制備的OPN蛋白質，通過WesternBlotting檢測抗血清的反應性。結果，針對OPN相關片段肽hOPN1和hOPN5的抗血清與GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Nhalf反應，但不與GST-Chalf反應。另一方面，針對OPN相關片段肽hOPN3的抗血清與GST-OPN-a、GST-OPN-b、GST-OPN-c和GST-Chalf反應，但不與GST-Nhalf反應。
實施例26抗OPN相關片段肽抗體與HRP的結合體的制備OPN相關片段肽hOPN3和hOPN1的抗體與HRP的結合體的制備如下。用胃蛋白酶消化各種抗OPN相關片段肽抗體20mg，通過凝膠過濾純化抗OPN相關片段肽抗體的F(ab’)2片段，用2-巰基乙醇將F(ab’)2片段還原為Fab’片段。HRP與EMCS37℃反應60分鐘，通過凝膠過濾制備HRP-EMCS結合體，再與抗OPN相關片段肽抗體Fab’片段4℃反應一晚，通過凝膠過濾制備EMCS交聯的抗OPN相關片段肽抗體與HRP的結合體。
實施例27夾心ELISA體系的構建根據夾心ELISA所用板與標記抗體的組合，制作1-3、5-1兩種體系。1-3體系的構建如下。將10μg/ml的針對OPN相關片段肽hOPN1的抗體加到96孔ELISA板中，100μl/孔。4℃反應一晚后，用10％BSA/PBS/0.05％NaN3溶液封閉，該狀態下作為夾心ELISA用板。將實施例26中制備的針對OPN相關片段肽hOPN3的抗體與HRP的結合抗體作為標記抗體。如此，用hOPN1的抗體固化板子，用hOPN3的抗體作為酶標抗體的組合作為體系1-3。
同樣，以針對hOPN5的抗體固化板子，用hOPN1的抗體作為酶標抗體的組合作為體系5-1。
實施例28用夾心ELISA測定被驗者中的骨橋蛋白OPN蛋白質的測定如下進行。將100μl包含從被驗者采集的血漿和關節腔液樣品的溶液加入到1-3體系和5-1體系的夾心ELISA所用板中，37℃反應1小時。反應后，用0.05％Tween20-PBS洗滌4次，各體系中加入100μl特異性標記抗體，4℃反應30分鐘。反應后，用0.05％Tween20-PBS洗滌6次，加入100μl TMB(四甲基聯苯胺)溶液，室溫避光放置30分鐘。用1N硫酸終止反應，測定450nm的吸光度。
用上述方法測定的風濕病患者關節腔液(13例)的OPN值如表10所示，變形性關節炎患者的關節腔液(12例)的OPN值如表11所示。另外，風濕病患者血漿(16例)的OPN值如表12所示，變形性關節炎患者的血漿(7例)的OPN值如表13所示，正常人血漿(6例)的OPN值如表14所示。
結果表明，比較血漿中的OPN值，在1-3體系中，類風濕性關節炎患者、變形性關節炎患者和健康人間未看到顯著性差異。但是，在5-1體系，與健康人間相比類風濕性關節炎患者、變形性關節炎患者中其測定值均有顯著性增高，類風濕性關節炎患者增高更明顯。這提示5-1體系反映的總OPN量對關節炎整體診斷的有效性。
另一方面，類風濕性關節炎患者和變形性關節炎患者的關節腔液中OPN值比血漿中OPN值升高，這提示局部的OPN產生增強。
另外，在類風濕性關節炎患者和變形性關節炎患者間比較關節腔液中的OPN值，無論1-3體系還是5-1體系，與變形性關節炎患者相比，類風濕性關節炎患者的OPN值顯著性增高。
作為新指標，對1-3體系/5-1體系間的OPN值比進行檢測。該指標可比較凝血酶斷開的OPN的比例。類風濕性關節炎患者的血漿和關節腔液的OPN值1以下，變形性關節炎患者2以上，有顯著性差異。因此，利用1-3體系/5-1體系間的OPN值可區別風濕病患者和變形性關節炎患者，可作為早期的檢測方法應用。
表10

表11

表12

表13

表14

序列表<110>Immuno-Biological Laboratkries Co.，Ltd.
Fujisawa Pharmaceutical Co.，Ltd.
<120>重組的抗骨橋蛋白抗體及其用途<130>PF-020016-WO<140>
<141>
<150>JP <151>2001-09-25<160>50<170>PatentIn Ven 2.1<210>1<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>InventorUEDE，Toshimitsu；KON，Shigeyuki；YAMAMOTO，Nobuchika；HIGUCHI，Hirofumi；TORIKAI，Masaharu；TOKIEDA，Yoshiyuki；NAKASHIMA，Toshihiro；MAEDA，Hiroaki<220>
<223>人工序列的描述(1)hOPN5<400>1Cys Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu1 5 10 15
Arg Ser<210>2<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述(2)hOPN3<400>2Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr1 5 10 15Asp Glu Cys<210>3<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述(3)hOPN1<400>3Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Cys1 5 10 15<210>4<211>35
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPN-5<400>4cgggatccac taccatgaga attgcagtga tttgc 35<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPN-3<400>5ccgctcgagt taattgacct cagaagatgc actatc 36<210>6<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNct-3<400>6acacagcatt cttttccaca gaacttccag aatcagc37<210>7<211>35
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNct-5<400>7tgaggaaaag aatgctgtgt cctctgaaga aaacc 35<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNnh-3<400>8gcctcgagtt acctcagtcc ataaaccaca ct 32<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNch-3<400>9tcttagattt ggcacaggtg atgcctagga g 31<210>10<211>31
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述OPNch-5<400>10cacctgtgcc aaatctaaga agtttcgcag a 31<210>11<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽1<400>11Cys Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu1 5 10 15Arg Ser<210>12<210>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽2<400>12Cys Ile Asp Ser Gln Gln Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu Phe His Ser
1 5 10 15His<210>13<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述M5肽<400>13Cys Val Asp Val Pro Asn Gly Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu1 5 10 15Arg<210>14<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽片段<400>14Ser Val Val Tyr Gly Arg Leu1 5<210>15
<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽片段<400>15Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser1 5 10<210>16<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽片段<400>16Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg1 5 10 15Ser<210>17<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述肽片段
<400>17Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Len Arg Ser1 5 10<210>18<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽片段<400>18Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg1 5 10 15Ser<210>19<211>116<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>小鼠抗體2K1 VH區<400>19Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val100 105 110Thr Val Ser Ser115<210>20<211>113<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>小鼠抗體2K1 VL區<400>20Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Thr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly85 90 95Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105 110Arg<210>21<211>5<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>CDR1(VH)<400>21Asp Tyr Glu Met His1 5<210>22<211>17<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>CDR2(VH)<400>22Ala Ile His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>23<211>7<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>CDR3(VH)<400>23Ile Thr Gly Tyr Phe Asd Val1 5<210>24<211>16<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>CDR1(VL)<400>24Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu1 5 10 15
<210>25<211>7<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>CDR2(VL)<400>25Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser1 5<210>26<211>9<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>CDR3(VL)<400>26Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr1 5<210>27<211>441<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人抗休2K1 VH區<220>
<221>CDS
<222>(20)..(424)<400>27cacgaagctt gccgccacc atg gac tgg acc tgg cgc gtg ttt tgc ctg ctc 52Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu1 5 10gcc gtg gct cct ggg gcc cac agc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg 100Ala Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gln Val Glu Leu Val Gln Ser Gly15 20 25gct gag gtg aag aag cct ggg tcc tcc gtg aag gtc tcc tgc aag gct 148Ala Gln Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala30 35 40tct gga ggt acc ttc agc gac tat gaa atg cac tgg gtg cga cag gcc 196Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala45 50 55cct gga caa ggg ctt gag tgg atg gga gct att cat cca gga aga ggt 244Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile His Pro Gly Arg Gly60 65 70 75ggt act gcc tac aat cag aag ttc aag ggc aga gtc acg att acc gcg 292Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala80 85 90gac aaa tcc act agt aca gcc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct 340Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser95 100 105gag gac acg gcc gtg tat tac tgt gcg aga att act ggg tac ttc gat 388Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Asp110 115 120gtc tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca ggtgagtgga434
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser125 130 135tccgcga 441<210>28<211>135<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的描述人抗體2K1 VH區<400>28Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly1 5 10 15Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe35 40 45Ser Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Met Gly Ala Ile His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn65 70 75 80Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly115 120 125
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135<210>29<211>455<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人抗體2K1 VL區<220>
<221>CDS<222>(20)..(415)<400>29cacgaagctt gccgccacc atg gga tgg agc tgt atc act ctc ttc ttg gta 52Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val1 5 10gca aca gct aca ggt gtc cac tcc gat gtt gtg atg act cag tct cca 100Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro15 20 25ctc tcc ctg ccc gtc acc ctt gga cag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg 148Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg30 35 40agc tct caa agc att gta cat agt aat gga aac acc tat ttg gaa tgg 196Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp45 50 55tac ctg cag aag cca ggg cag tct cca cag ctc ctg atc tat aaa gtt 244
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val60 65 70 75tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac aga ttc agc ggc agt ggg tca292Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Aso Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser80 85 90ggc act gat ttc aca ctg aaa atc agc agg gtt gaa gct gaa gac gtc340Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val95 100 105gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt tca cat gtt ccg ctc acg ttt ggc388Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly110 115 120cag ggg acc aag ctg gag atc aaa cgt gagtagaatt taaactttgc 435Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg125 130ttcctcagtt ggatccgcga 455<210>30<211>132<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的描述人抗體2K1 VL區<400>30Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile
35 40 45Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser65 70 75 80Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys100 105 110Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu115 120 125Glu Ile Lys Arg130<210>31<211>97<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH區引物1<400>31cacgaagctt gccgccacca tggactggac ctggcgcgtg ttttgcctgc tcgccgtggc 60tcctggggcc cacagccagg tgcagctggt gcagct 97<210>32
<211>88<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH區引物2<400>32tcgctgaagg tacctccaga agccttgcag gagaccttca cggaggaccc aggcttcttc 60acctcagccc cagactgcac cagctgca88<210>33<211>103<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH區引物3<400>33ttctggaggt accttcagcg actatgaaat gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagg 60gcttgagtgg atgggagcta ttcatccagg aagaggtggt act 103<210>34<211>90<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH區引物4<400>34catgtaggct gtactagtgg atttgtccgc ggtaatcgtg actctgccct tgaacttctg 60attgtaggca gtaccacctc ttcctggatg 90
<210>35<211>95<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH區引物5<400>35tccactagta cagcctacat ggagctgage agcctgagat ctgaggacac ggccgtgtat 60tactgtgcga gaattactgg gtacttcgat gtctg95<210>36<211>69<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH區引物6<400>36tcgcggatcc actcacctga ggagacggtg accgtggtcc cttgccccca gacatcgaag 60tacccagta 69<210>37<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH區引物(1)
<400>37cacgaagctt gccgccacca tggactggac ctggcgcgtg 40<210>38<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH區引物(2)<400>38tcgcggatcc actcacctga ggagacggtg accgtggtcc 40<210>39<211>82<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL區引物1<400>39cacgaagctt gccgccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc 60tacaggtgtc cactccgatg tt 82<210>40<211>102<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL區引物2
<400>40aatgctttga gagctcctgc aggagatgga ggccggctgt ccaagggtga cgggcaggga 60gagtggagac tgagtcatca caacatcgga gtggacacct gt102<210>41<211>113<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL區引物3<400>41tgcaggagct ctcaaagcat tgtacatagr aatggaaaca cctatttgga atggtacctg 60cagaagccag ggcagtctcc acagctcctg atctataaag tttccaaccg att113<210>42<211>114<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL區引物4<400>42tccgacgtct tcagcttcaa ccctgctgar tttcagtgtg aaatcagtgc ctgacccact 60gccgctgaat ctgtctggga ccccagaaaa tcggttggaa actttataga tcag 114<210>43<211>64<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述VL區引物5<400>43gttgaagctg aagacgtcgg agtttattac tgctttcaag gttcacatgt tccgctcacg 60tttg64<210>44<211>90<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL區引物6<400>44tcgcggatcc aactgaggaa gcaaagttta aattctactc acgtttgatc tccagcttgg 60tcccctggcc aaacgtgagc ggaacatgtg90<210>45<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL區引物(1)<400>45cacgaagctt gccgccacca tgggatggag ctgtatcatc40<210>46<211>40
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL區引物(2)<400>46ctcgcggatc caactgagga agcaaagttt aaattctact 40<210>47<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH區引導序列引物<400>47ttcgaagctt gccgccacca tggaatggag ctggatcttt 40<210>48<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VH區的J區的引物<400>48gaagatctgg atccactcac ctgaggaaaac tgtga 35<210>49<211>39
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL區的引導序列的引物<400>49cttaagcttg ccgccaccat gaagttgcct gttaggctg 39<210>50<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述VL區的J區的引物<400>50ctagatctgg atccacttac gtttcagctc cagctt 3權利要求
1.一種抗骨橋蛋白抗體或源于該抗體的抗體片段，它能抑制識別RGD序列的整合素與骨橋蛋白或其片段的結合，且可抑制識別SVVYGLR序列的整合素與骨橋蛋白或其片段的結合。
2.權利要求1中的抗骨橋蛋白抗體，它是用包含部分氨基酸序列RGDSVVYGLRS的肽作為抗原而獲得的。
3.權利要求1或2中的抗骨橋蛋白抗體，它是用肽VDTYDGRGDSVVYGLRS作為抗原而獲得的。
4.權利要求1-3任一項中的抗骨橋蛋白抗體，它是單克隆抗體。
5.權利要求1-3任一項中的抗骨橋蛋白抗體，它是嵌合抗體。
6.權利要求5中的抗骨橋蛋白抗體，具有以下重鏈(a)和輕鏈(b)(a)具有小鼠來源的重鏈可變區和人源重鏈恒定區的重鏈；(b)具有小鼠來源的輕鏈可變區和人源輕鏈恒定區的輕鏈。
7.權利要求5或6中的抗骨橋蛋白抗體，其特征在于，其重鏈(a)的小鼠來源的重鏈可變區具有SEQ ID NO19中的氨基酸序列。
8.權利要求5或6中的抗骨橋蛋白抗體，其特征在于，其輕鏈(b)的小鼠來源的輕鏈可變區具有SEQ ID NO20中的氨基酸序列。
9.權利要求5或6中的抗骨橋蛋白抗體，其中重鏈(a)的重鏈恒定區為人Igγ1。
10.權利要求5或6中的抗骨橋蛋白抗體，其中輕鏈(b)的輕鏈恒定區為人Igκ。
11.權利要求1-3任一項中的抗骨橋蛋白抗體，它是人化抗體。
12.權利要求11中的抗骨橋蛋白抗體，具有以下重鏈(c)和輕鏈(d)(c)具有小鼠來源的重鏈可變區的互補性決定區域及人源重鏈可變區的構架區域的重鏈可變區和人源重鏈恒定區的重鏈；(d)具有小鼠來源的輕鏈可變區的互補性決定區域及人源輕鏈可變區的構架區域的輕鏈可變區和人源輕鏈恒定區的輕鏈。
13.權利要求11或12中的抗骨橋蛋白抗體，其特征在于，其重鏈(c)的小鼠來源的重鏈可變區的互補性決定區域具有SEQ ID NO21-23中的氨基酸序列。
14.權利要求11或12中的抗骨橋蛋白抗體，其特征在于，其輕鏈(d)的小鼠來源的輕鏈可變區的互補性決定區域具有SEQ ID NO24-26中的氨基酸序列。
15.權利要求11或12中的抗骨橋蛋白抗體，其特征在于，其重鏈(c)的重鏈可變區具有SEQ ID NO28中的氨基酸序列。
16.權利要求11或12中的抗骨橋蛋白抗體，其特征在于，其輕鏈(d)的輕鏈可變區具有SEQ ID NO30中的氨基酸序列。
17.權利要求11或12中的抗骨橋蛋白抗體，其重鏈(c)的重鏈恒定區為人Igγ1。
18.權利要求11或12中的抗骨橋蛋白抗體，其輕鏈(d)的輕鏈恒定區為人Igκ。
19.一種堿基序列，它編碼SEQ ID NO19中記載的氨基酸序列。
20.一種堿基序列，它編碼SEQ ID NO20中記載的氨基酸序列。
21.一種堿基序列，它編碼SEQ ID NO28中記載的氨基酸序列列。
22.一種堿基序列，它編碼SEQ ID NO30中記載的氨基酸序列。
23.一種載體，它具有權利要求19中堿基序列和人Igγ1基因。
24.一種載體，它具有權利要求20中堿基序列和人Igκ基因。
25.一種載體，它具有權利要求21中堿基序列和人Igγ1基因。
26.一種載體，它具有權利要求22中堿基序列和人Igκ基因。
27.一種宿主細胞，它是用權利要求23和24中記載的載體轉化的。
28.一種宿主細胞，它是用權利要求25和26中記載的載體轉化的。
29.一種權利要求5或6的抗骨橋蛋白嵌合體抗體的制備方法，其特征在于，培養權利要求27中的宿主細胞，從培養液中收集抗骨橋蛋白嵌合體抗體。
30.一種權利要求11或12的抗骨橋蛋白人源化抗體的制備方法，其特征在于，培養權利要求28中的宿主細胞，從培養液中收集抗骨橋蛋白人源化抗體。
31.一種自身免疫性疾病的治療劑，它包含權利要求1-6或11或12任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段作有效成分。
32.一種風濕病的治療劑，它包含權利要求1-6或11或12任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段作有效成分。
33.一種類風濕性關節炎的治療劑，它包含權利要求1-6或11或12任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段作有效成分。
34.一種變形性關節炎的治療劑，它包含權利要求1-6或11或12任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段作有效成分。
35.一種自身免疫性疾病的治療方法，其特征在于，給自身免疫性疾病的患者施用權利要求1-6或11或12任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段。
36.一種類風濕病的治療方法，其特征在于，給類風濕病的患者施用權利要求1-6或11或12任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段。
37.一種類風濕性關節炎的治療方法，其特征在于，給類風濕性關節炎的患者施用權利要求1-6或11或12任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段。
38.一種變形性關節炎的治療方法，其特征在于，給變形性關節炎的患者施用權利要求1-6或11或12任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段。
39.權利要求1-6或11或12任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段在制備自身免疫性疾病治療劑中的應用。
40.權利要求1-6或11或12任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段在制備風濕病治療劑中的應用。
41.權利要求1-6或11或12任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段在制備類風濕性關節炎治療劑中的應用。
42.權利要求1-6或11或12任一項中的抗體或由該抗體產生的抗體片段在制備變形性關節炎治療劑中的應用。
43.一種自身免疫性疾病治療劑的篩選方法，其特征在于，評價待檢化合物對骨橋蛋白的RGD序列與整合素結合和/或SVVYGLR序列與整合素結合的抑制程度。
44.一種風濕病治療劑的篩選方法，其特征在于，評價待檢化合物對骨橋蛋白的RGD序列與整合素結合和/或SVVYGLR序列與整合素結合的抑制程度。
45.一種類風濕性關節炎治療劑的篩選方法，其特征在于，評價待檢化合物對骨橋蛋白的RGD序列與整合素結合和/或SVVYGLR序列與整合素結合的抑制程度。
全文摘要
一種重組抗骨橋蛋白抗體，至少其重鏈和輕鏈的恒定區轉換成人源區域的抗體，它能抑制識別RGD序列的整合素與骨橋蛋白或其片段的結合，且能抑制識別SVVYGLR序列或其相當序列的整合素與骨橋蛋白或其片段的結合。該抗體作為自身免疫疾病治療劑、風濕病治療劑乃至類類風濕性關節炎的治療劑的應用；提供治療自身免疫性疾病、風濕病乃至類類風濕性關節炎的方法。另外，所講骨橋蛋白抗體在風濕病的診斷藥及診斷方法中應用。
文檔編號A61P37/02GK1688604SQ0282341
公開日2005年10月26日 申請日期2002年9月25日 優先權日2001年9月25日
發明者上出利光, 今重之, 山本宣哉, 樋口浩文, 鳥飼正治, 時枝養之, 中島敏博, 前田浩明 申請人:株式會社免疫生物研究所, 藤澤藥品工業株式會社