本發明屬(shu)于生(sheng)物醫(yi)藥，具體是重(zhong)組(zu)蛋(dan)白制(zhi)備(bei)技(ji)術，更具體涉及(ji)一種重(zhong)組(zu)人nmdar融合蛋(dan)白及(ji)其(qi)制(zhi)備(bei)方法和(he)應用。

背景技術：

1、腦炎(yan)是(shi)由細菌(jun)、病毒或其他病原物(wu)感染(ran)腦實質(zhi)所(suo)導致的(de)神經(jing)功能(neng)障礙性疾病的(de)統稱，除病毒和細菌(jun)感染(ran)所(suo)致外，自(zi)身免疫性腦炎(yan)(ae)也占有相當(dang)的(de)比(bi)例。

2、自(zi)(zi)(zi)身免疫(yi)性腦炎(autoimmune?encephalitis，ae)是(shi)近10余年來新進被認識(shi)的一(yi)類中樞神(shen)經系統自(zi)(zi)(zi)身免疫(yi)性疾病，ae患者常表(biao)現出精神(shen)行為異常、癲(dian)癇發(fa)作(zuo)、記憶障礙、認知異常、運(yun)動異常、自(zi)(zi)(zi)主神(shen)經功能紊亂、意識(shi)下降等嚴重的臨床癥狀。

3、ae的(de)特(te)點(dian)是患(huan)者(zhe)體(ti)(ti)(ti)內(nei)存(cun)在抗(kang)(kang)神(shen)經元表面蛋白、離子(zi)通道和受(shou)體(ti)(ti)(ti)的(de)自(zi)身(shen)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)，這(zhe)些自(zi)身(shen)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)被認(ren)為(wei)具有致病性，可(ke)以成為(wei)疾病診斷的(de)標志物。目前，常見的(de)介導ae的(de)特(te)異性自(zi)身(shen)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)分別(bie)有抗(kang)(kang)nmdar抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)、抗(kang)(kang)ampar抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)等(deng)，不同抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)介導的(de)ae患(huan)者(zhe)與伴發腫瘤及預后均有較大差異。因此，及時準(zhun)確檢測相關自(zi)身(shen)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)對(dui)ae早期診治具有極其重要的(de)意義，而本領域尚缺乏敏(min)感性和特(te)異性均高的(de)ae自(zi)身(shen)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)檢測方法。

4、抗n-甲基-d-天冬氨酸受體(n-methyl-d-aspartate?receptor，nmdar)腦(nao)炎在(zai)2007年首次被發現。2010年的調(diao)查顯示，自身免疫(yi)性(xing)腦(nao)炎約占(zhan)所有腦(nao)炎的4％，其中抗nmdar腦(nao)炎約占(zhan)ae的50％，為(wei)不(bu)明原因的癲癇發作，認知功能障礙和精(jing)神行為(wei)異常等(deng)癥(zheng)狀(zhuang)的診斷提供了參考。

5、nmdar是(shi)一種(zhong)廣(guang)泛分(fen)布于cns神經(jing)細胞細胞膜表面的(de)(de)離(li)子型(xing)谷(gu)氨酸受體(ti)，通過(guo)鈣離(li)子介(jie)導谷(gu)氨酸的(de)(de)快速興奮(fen)作(zuo)用。抗(kang)(kang)nmdar自身抗(kang)(kang)體(ti)可以交(jiao)聯nmdar，破壞nmdar-ephb2相互作(zuo)用，通過(guo)導致nmdar內化使其(qi)功能減(jian)退，產生一系(xi)列(lie)的(de)(de)臨床癥狀。抗(kang)(kang)n-甲(jia)基-d-天冬氨酸受體(ti)抗(kang)(kang)體(ti)識(shi)別的(de)(de)抗(kang)(kang)原nmdar是(shi)一種(zhong)異源四聚體(ti)，人體(ti)的(de)(de)3種(zhong)nmdar亞基為(wei)nr1、nr2和nr3。nmdar已被證(zheng)明參與長時程增強(qiang)，在神經(jing)元發(fa)育中發(fa)揮(hui)作(zuo)用，與阿爾茨(ci)海默病、癲癇和缺(que)血性神經(jing)元細胞死亡等中樞神經(jing)系(xi)統疾病有(you)關。

6、針對自身抗(kang)體的鑒定(ding)可以通過間接法elisa、熒光免疫(yi)印跡、膠體金試(shi)紙(zhi)條和(he)(he)間接細胞免疫(yi)熒光分析(cba)等方法，各類方法的關鍵(jian)是制(zhi)(zhi)備特異性好、敏感度高的自身抗(kang)原，而(er)自身抗(kang)原的來源可以通過提取純化天然產物(wu)、多肽(tai)類化學合(he)(he)成、原核或真核重(zhong)組(zu)表達(da)(da)以及穩定(ding)轉(zhuan)染細胞的方式獲得(de)，針對不(bu)同(tong)的抗(kang)原類型，需要選擇適宜的制(zhi)(zhi)備方案，或者將(jiang)上述方案進(jin)行(xing)組(zu)合(he)(he)使用。其(qi)中(zhong)最(zui)常(chang)(chang)見的方法為重(zhong)組(zu)表達(da)(da)，對于多次跨膜的受體蛋(dan)白，表達(da)(da)和(he)(he)純化都(dou)非(fei)常(chang)(chang)困難，必須考(kao)慮其(qi)他方法。

7、因此，在(zai)抗(kang)體鑒定(ding)中，nmdar蛋(dan)白的設(she)計尤為重要(yao)，既要(yao)保證涵蓋(gai)重要(yao)的自身抗(kang)原表(biao)位，還要(yao)在(zai)表(biao)達和純(chun)化中獲得有功能和天(tian)然抗(kang)體有結(jie)合能力(li)的重組蛋(dan)白，而且nmdar的異(yi)源四聚體結(jie)構特征(zheng)進(jin)一步增加(jia)了表(biao)達和純(chun)化難度。

8、為了解決上述(shu)問題，本發明提供一種重組人nmdar融合蛋白，所(suo)述(shu)重組蛋白可用于檢(jian)測(ce)抗nmdar型腦炎。

技術實現思路

1、本發(fa)(fa)明的(de)(de)一(yi)個目的(de)(de)是(shi)提供一(yi)種重組(zu)人nmdar融(rong)合蛋(dan)白(bai)的(de)(de)制(zhi)備方法(fa)；本發(fa)(fa)明的(de)(de)另一(yi)個目的(de)(de)是(shi)提供一(yi)種根據所述方法(fa)制(zhi)備得到的(de)(de)重組(zu)人nmdar融(rong)合蛋(dan)白(bai)及其在檢測抗nmdar型(xing)腦炎中的(de)(de)用途。

2、本發(fa)明的目的通(tong)過如下技術(shu)方案實現：

3、第一(yi)方面，本(ben)發(fa)明(ming)提(ti)供(gong)一(yi)種重組(zu)人nmdar融合(he)蛋(dan)白(bai)(bai)，所(suo)述重組(zu)人nmdar融合(he)蛋(dan)白(bai)(bai)是由融合(he)蛋(dan)白(bai)(bai)1與融合(he)蛋(dan)白(bai)(bai)2形成(cheng)的二聚體結(jie)構，其中，融合(he)蛋(dan)白(bai)(bai)1由nmdar1胞外區1、nmdar1胞外區3和(he)兔疫(yi)球蛋(dan)白(bai)(bai)fc段依(yi)次連接組(zu)成(cheng)；融合(he)蛋(dan)白(bai)(bai)2由nmdar2胞外區1、nmdar2胞外區3和(he)兔疫(yi)球蛋(dan)白(bai)(bai)fc段依(yi)次連接組(zu)成(cheng)。

4、優選(xuan)的，上述各區段通(tong)過連(lian)接(jie)肽連(lian)接(jie)，所述連(lian)接(jie)肽選(xuan)自本領域常規使用的連(lian)接(jie)肽，包括但(dan)不限(xian)于(yu)ggggs連(lian)接(jie)肽。

5、在本發明的(de)優選實(shi)施方(fang)式(shi)中，所述融(rong)合蛋白1的(de)氨(an)基酸序列如seq?id?no:1所示，融(rong)合蛋白2的(de)氨(an)基酸序列如seq?id?no:2所示。

6、第二方(fang)面，本發明提供一(yi)種(zhong)(zhong)編碼重組人nmdar融(rong)(rong)合蛋白的(de)核(he)(he)苷(gan)酸(suan)序列(lie)，其(qi)特征在(zai)于，所(suo)述核(he)(he)苷(gan)酸(suan)序列(lie)包(bao)括(kuo)編碼融(rong)(rong)合蛋白1的(de)序列(lie)和編碼融(rong)(rong)合蛋白2的(de)序列(lie)，所(suo)述序列(lie)選自下列(lie)方(fang)式中的(de)一(yi)種(zhong)(zhong)：

7、1)編(bian)碼融合蛋(dan)白1和(he)融合蛋(dan)白2的核苷酸序列分別為seq?id?no:3和(he)seq?id?no:4序列的全部(bu)；

8、2)編碼融合蛋(dan)白(bai)1和融合蛋(dan)白(bai)2的(de)核(he)苷酸序列分別與(yu)seq?id?no:3和seq?id?no:4序列具有(you)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或(huo)99％的(de)同(tong)一性程度的(de)序列；

9、3)編碼融合蛋(dan)白1和融合蛋(dan)白2的核(he)(he)苷酸(suan)序列分別與seq?id?no:3和seq?id?no:4序列的差(cha)異不超(chao)過5、4、3、2或1個核(he)(he)苷酸(suan)。

10、優選的，編碼融合蛋白1和(he)融合蛋白2的核苷酸序列(lie)分別為seq?id?no:3和(he)seq?idno:4序列(lie)的全部(bu)。

11、第(di)三方(fang)面，本發明提供一(yi)種表達載(zai)體，其特征在于，所述(shu)表達載(zai)體中分別含(han)有(you)編碼融合蛋(dan)白(bai)(bai)1和編碼融合蛋(dan)白(bai)(bai)2的(de)核苷酸(suan)序列。

12、第四方面(mian)，本發(fa)明提供一(yi)種由所述表達載體轉化的轉化細胞。

13、優選的(de)(de)，所述轉化(hua)細(xi)胞(bao)的(de)(de)宿主細(xi)胞(bao)選自hek293細(xi)胞(bao)、中國倉鼠(shu)卵巢細(xi)胞(bao)或bhk細(xi)胞(bao)。

14、第(di)五方面，本發(fa)明(ming)提供(gong)一種(zhong)重組人nmdar融合(he)蛋白(bai)的制備(bei)方法(fa)，所述(shu)方法(fa)為培養上述(shu)轉化細胞(bao)，誘導表達，獲得(de)重組人nmdar融合(he)蛋白(bai)。

15、優選的，所(suo)述(shu)重(zhong)(zhong)組(zu)人nmdar融合(he)蛋白的制備方(fang)法包(bao)括(kuo)：將seq?id?no:3所(suo)示的基因整合(he)到質(zhi)(zhi)粒中(zhong)，構建得(de)(de)到重(zhong)(zhong)組(zu)質(zhi)(zhi)粒1；將seq?id?no:4所(suo)示的基因整合(he)到質(zhi)(zhi)粒中(zhong)，構建得(de)(de)到重(zhong)(zhong)組(zu)質(zhi)(zhi)粒2；將所(suo)述(shu)質(zhi)(zhi)粒經轉(zhuan)(zhuan)化、提取、酶(mei)切鑒定(ding)后轉(zhuan)(zhuan)染至宿主細胞(bao)(bao)得(de)(de)到轉(zhuan)(zhuan)化細胞(bao)(bao)，培養轉(zhuan)(zhuan)化細胞(bao)(bao)，誘導表達(da)，分離純化，獲(huo)得(de)(de)重(zhong)(zhong)組(zu)人nmdar融合(he)蛋白。

16、更優選(xuan)的，所述(shu)重組(zu)人nmdar融合蛋白的制備方法(fa)包(bao)括如(ru)下(xia)步驟：

17、(1)將經密碼子優(you)化后的(de)nmdar1胞外(wai)區(qu)1基因(yin)序列、nmdar1胞外(wai)區(qu)3基因(yin)序列整合在puc57質粒(li)(li)(li)中，再通(tong)過(guo)亞(ya)克隆構(gou)建至含有(you)兔(tu)疫球(qiu)(qiu)蛋白(bai)fc段(duan)基因(yin)的(de)載(zai)體(ti)pcdna3.4上(shang)，得到(dao)(dao)重組質粒(li)(li)(li)1；同樣的(de)，將經由密碼子優(you)化后的(de)nmdar2胞外(wai)區(qu)1基因(yin)序列、nmdar2胞外(wai)區(qu)3基因(yin)序列整合在puc57質粒(li)(li)(li)中，再通(tong)過(guo)亞(ya)克隆構(gou)建至含有(you)兔(tu)疫球(qiu)(qiu)蛋白(bai)fc段(duan)基因(yin)的(de)載(zai)體(ti)pcdna3.4上(shang)，得到(dao)(dao)重組質粒(li)(li)(li)2；

18、(2)將重組質粒1和重組質粒2轉染至宿主(zhu)細(xi)胞，誘導表(biao)達，分(fen)離(li)純化得到重組人nmdar融合蛋白(bai)。

19、在本發明的具體(ti)實施(shi)方(fang)式中，所述重組人nmdar融合蛋白的制(zhi)備方(fang)法包(bao)括如下步驟(zou)：

20、s1：將(jiang)經密碼子優化后的(de)nmdar1胞(bao)外區1基(ji)因(yin)序列(lie)(lie)(lie)、nmdar1胞(bao)外區3基(ji)因(yin)序列(lie)(lie)(lie)整(zheng)合(he)在puc57質粒中，轉化，篩選得(de)到陽(yang)性轉化子1；同時(shi)，將(jiang)經密碼子優化后的(de)nmdar2胞(bao)外區1基(ji)因(yin)序列(lie)(lie)(lie)、nmdar2胞(bao)外區3基(ji)因(yin)序列(lie)(lie)(lie)整(zheng)合(he)在puc57質粒中，轉化，篩選得(de)到陽(yang)性轉化子2；

21、s2：使(shi)用(yong)質(zhi)粒(li)(li)小提(ti)試(shi)劑(ji)盒分別提(ti)取上述質(zhi)粒(li)(li)；

22、s3：使(shi)用限(xian)制酶(mei)ecorⅰ和ecorⅴ對載(zai)體(含有兔fc的載(zai)體pcdna3.4)和上述(shu)質(zhi)粒分別進行雙酶(mei)切，通過瓊脂糖電(dian)泳、膠回收(shou)試劑(ji)盒切膠回收(shou)提取的基因片(pian)段和載(zai)體片(pian)段；

23、s4：用t4連(lian)接(jie)酶分別將(jiang)兩種(zhong)基因(yin)片段與(yu)載體(ti)片段連(lian)接(jie)，將(jiang)連(lian)接(jie)產(chan)物轉化(hua)(hua)，篩選得到陽(yang)性(xing)轉化(hua)(hua)子1和陽(yang)性(xing)轉化(hua)(hua)子2；

24、s5：pcr擴增，通(tong)過瓊脂糖電泳進行鑒定正確后大提質(zhi)(zhi)粒(li)，獲(huo)得重(zhong)(zhong)組質(zhi)(zhi)粒(li)1和重(zhong)(zhong)組質(zhi)(zhi)粒(li)2；

25、s6：將(jiang)重(zhong)組質(zhi)粒1和2轉染至(zhi)宿主細(xi)胞，誘(you)導表(biao)達，分離(li)純化得到(dao)重(zhong)組人nmdar融合蛋白(bai):。

26、第(di)六方面，本發明提供(gong)一種所(suo)述重組人nmdar融合蛋(dan)白在制備自身免疫性(xing)腦炎診斷試劑和/或試劑盒中(zhong)的應用。

27、優選的，所述(shu)自身免疫(yi)性腦(nao)(nao)炎(yan)為抗nmdar型(xing)腦(nao)(nao)炎(yan)。

28、在一些實(shi)施例中，所(suo)述診斷試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)選自流式細胞分析試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)、免疫(yi)印跡檢(jian)(jian)測(ce)(ce)試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)、免疫(yi)層析檢(jian)(jian)測(ce)(ce)試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)、免疫(yi)組(zu)化(hua)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)、elisa試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)、蛋白沉淀試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)、免疫(yi)熒光試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)或電(dian)化(hua)學(xue)發光檢(jian)(jian)測(ce)(ce)試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)。

29、優選的，所述試(shi)劑盒為流式細胞分析試(shi)劑盒。

30、第七方面(mian)，本發(fa)明一種用于診斷(duan)抗(kang)nmdar型腦炎的流式細胞分析試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括(kuo)如下組分：

31、(1)微(wei)球混懸液(ye)：將加入保(bao)存(cun)液(ye)的微(wei)球按照(zhao)50μl/管分裝(zhuang)，加入950μl保(bao)存(cun)液(ye)；

32、(2)檢測抗體溶液：將生物(wu)素標記的重組人nmdar融合蛋白按照(zhao)10μl/管分裝，加入4990μl純化水；

33、(3)熒光素(su)溶液(ye)：含(han)有(you)親(qin)和素(su)和藻紅(hong)蛋(dan)白1μg/ml，5ml/管；

34、(4)樣(yang)本稀釋液：含0.5％bsa的pb溶液；

35、(5)清(qing)洗(xi)液：20×pbst緩(huan)沖液。

36、本(ben)發明提供(gong)的重組人nmdar融合蛋白具有如下(xia)技術優勢(shi)：

37、1、作為重組(zu)nmdar蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)，既(ji)要(yao)保證涵(han)蓋重要(yao)的(de)自身抗原(yuan)表(biao)位(wei)，具有(you)與天然抗體特(te)異(yi)性(xing)結合(he)的(de)能(neng)力，還要(yao)易于表(biao)達和純(chun)化，能(neng)實(shi)現規模化生產。而且，nmdar屬于多次跨膜的(de)受體蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)，其異(yi)源四聚體結構特(te)征使表(biao)達和純(chun)化難度較大。本(ben)發明通過(guo)對nmdar蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)結構特(te)征和抗原(yuan)表(biao)位(wei)分析(xi)驗證，選(xuan)擇具有(you)明顯抗原(yuan)性(xing)結構區域，選(xuan)擇具備nmdar蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)特(te)異(yi)性(xing)功能(neng)表(biao)位(wei)的(de)部分制備融合(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)，同時(shi)兼顧選(xuan)擇片(pian)段(duan)的(de)溶(rong)解(jie)(jie)性(xing)問題(ti)，使制備得到的(de)融合(he)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)不僅可以顯著提高(gao)檢測(ce)的(de)敏感度，而且溶(rong)解(jie)(jie)度較好，易于純(chun)化；

38、2、本發明篩(shai)選的(de)不(bu)同分子片段以融合形(xing)式組(zu)合，并且選擇有利的(de)融合骨(gu)架(jia)，即含有兔fc的(de)載體pcdna3.4作為(wei)融合骨(gu)架(jia)，不(bu)僅使表達的(de)重(zhong)組(zu)蛋白(bai)易于純化(hua)，而且fc片段的(de)加入(ru)使重(zhong)組(zu)蛋白(bai)的(de)構象(xiang)更接近(jin)天然蛋白(bai)，提高檢測敏感度；

39、3、根據本發明提供的方(fang)法制備得到的重(zhong)組(zu)人nmdar融合蛋白(bai)溶解(jie)性(xing)好，易于純化(hua)，便于定(ding)量(liang)和質(zhi)量(liang)控(kong)制，也方(fang)便其與自身免疫性(xing)腦(nao)炎的其他重(zhong)組(zu)抗原組(zu)合使用，提高檢測(ce)和診斷效能。