一組腺相關重組病毒疫苗早期干預老年性癡呆癥的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一組腺相關重組病毒與化合物預防與治療老年癡呆的應用
【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默病（Alzheimer' s disease，AD)是一種與年齡相關的多病因的中樞神 經系統退行性疾病。其病理表現為細胞外β-淀粉樣蛋白（i3-Amyl 〇id，Ai3)沉積，神經纖 維纏結，神經元缺失及突觸功能降低等。AD的發病機制尚不明確，并且缺乏有效的干預措 施，是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。目前常用的AD干預藥物包括乙酰膽堿酯酶抑制 劑及NMDA受體阻斷劑，尚不能從根本上對阿爾茲海默病進行提前的干預及治療，世界上許 多醫療領域頂級期刊，例如lancet、New England of Medicine等公認一個事實就是：AD病 人出現明顯癥狀，則治療方法已經無法逆轉病程。我國已經進入老年化社會，因此研究AD 早期干預措施，對提高老年人的生活質量具有深刻的社會意義，是當今社會的重要研究課 題之一。
[0003] AD的病程進展呈現逐步加重的趨勢。近期研究提示，阿爾茨海默癥臨床癥狀出現 前期（Pre-clinical Alzheimer' s disease，PCAD)對疾病的干預具有重要意義。PCAD階 段腦內和血液中均能夠檢測到AD的生物標志物（如Α β )，但認知功能正常。隨著病程進 展，Αβ沉積逐漸增多，進而導致神經元損傷加重，誘發神經炎癥，血腦屏障完整性降低，最 終導致AD的不可逆性發生。因此在PCAD階段對疾病進行早期干預，能夠延緩疾病的進展。
[0004] 在眾多PCAD早期干預研究中，AD疫苗起到了十分重要的作用。近年來研究證實 以腺相關病毒為載體的重組DNA疫苗，具有較好的早期干預前景，可應用于PCAD，pre-MCI 以及AD的干預中。但目前已報道的疫苗仍存在較明顯的不足，例如安全性低，需要重復注 射，降低了患者耐受性，免疫效率低等問題。針對這些問題，我們設計了新的重組DNA疫苗， 并改善了其免疫途徑。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是針對目前AD疫苗領域內存在的難題，提供一組新的DNA重組疫 苗，該疫苗通過特定的linker將編碼Α β肽片段和白細胞介素-10 (IL-10)的DNA序列鏈 接，導入到腺相關病毒載體9(adeno_associated virus，AAV)中，形成重組AAV病毒。本發 明提供的病毒進入機體后能夠編碼Αβ片段和IL-10,在佐劑的存在下能夠誘導機體產生 大量的抗Α β抗體。
[0006] 發明相關的對于插入的序列為Α β 43片段以及白細胞介素-10的DNA序列連接， 其采用一個柔軟的蛋白質linker連接，可以能夠使兩段蛋白能夠正常的構型起到作用。
[0007] 本發明所用的佐劑包括：鋁鹽，脂質體佐劑、不完全佐劑等。
[0008] 本發明聯合采用的藥物為抗變態反應免疫藥物、抗炎抗氧化藥物。
[0009] 本發明的組合物的給藥途徑包括但不限于直腸，口服，鼻飼，皮下、肌肉注射給藥 等。
[0010] 本發明采用的實驗動物為國際上通用的Α β聚集為病理特征的AD模型小鼠，通過 實驗發現能夠改善小鼠的認知功能。
[0011] 為實現上述目的，本發明解決技術問題的方案為：
[0012] 本發明得到的組合物通過口服或者直腸給藥的方式，能夠有效的誘導機體產生抗 Αβ抗體，減少小鼠體內Αβ水平，并降低小鼠的腦部老年斑的生成，最終改善小鼠的認知 功能，實現對老年癡呆癥的早期干預。
[0013] 本發明的優點在于：
[0014] 通過采用AAV9的病毒載體，與以往的載體相比極大的提高疫苗的效應，在插入片 段中連接了 IL-10,降低了小鼠的變態免疫反應。同時與佐劑和藥物的連用，能夠保證疫苗 的效應，降低了疫苗可能帶來的副作用。注射部位采用肛門注射的方法，可以降低給小鼠帶 來的副作用。總之，該發明能夠明顯的提高疫苗的效應，同時降低了小鼠的副作用
【附圖說明】
[0015] 圖1 :以腺相關病毒AAV9為載體的疫苗的構建技術路線；
[0016] 圖2 :腺相關重組病毒與化合物免疫小鼠后，外周血和中樞內Αβ水平的變化；
[0017] 圖3 :腺相關重組病毒與化合物免疫小鼠后外周血抗Α β抗體的IgG以及IgM水 平；
[0018] 圖4 :腺相關重組病毒與化合物對小鼠的認知功能的改善作用。
【具體實施方式】
[0019] 本發明結合附圖和實施例作進一步的說明
[0020] 實施例1 :參見圖1，重組腺相關病毒以及疫苗的構建路線。
[0021] 首先采用從頭合成的方法合成插入序列，將插入序列采用限制性內切酶Hindlll 以及Notch，進行雙酶切后插入到AAAV9的載體質粒。將AAV9的三種質粒轉染進入到293T 細胞中，提取AAV病毒、純化，驗證病毒的滴度。將驗證后的病毒與佐劑聯用，制成最終的劑 型。合成示意圖見圖1
[0022] 實施例2 :參見圖3,腺相關重組病毒疫苗能夠明顯降低小鼠腦部的Αβ的水平
[0023] 選取6月齡的APP/PS1轉基因小鼠（相當于PCAD階段）及同窩出生的野生型 C57BL6j小鼠。將小鼠做如下分組：正常APP/PS1對照組；陽性對照野生型組；APP/PS1給 腺相關重組病毒與化合物組；每組η = 10只。每只小鼠提前一天禁水禁食，之后將腺相關 重組病毒的疫苗采用肛門注射的方法給予一次用藥，每只〇. 6ml，給藥完畢之后將小鼠提起 半個小時，保證疫苗無損失。在SPF級別的動物飼養室中飼養一個月。采用ELISA的方法 檢測小鼠腦部的Αβ的水平，按照說明書要求取腦組織加入裂解液之后離心，取上清，之 后滴加到已經提供的ELISA板中，加入一抗室溫孵育1個小時，清洗三次后加入二抗，室溫 孵育1個小時后清洗三次，最終加入底物反應30分鐘，在加入終止液，在30分鐘內使用分 光光度計450nm讀數。分析相關數據。發現小鼠腦部的Αβ40以及Αβ42的水平發生了顯 著性的降低，如圖2
[0024] 實施例3 :參見圖2,腺相關重組病毒疫苗能夠有效的提高小鼠血液中IgG以及 IgM的濃度
[0025] 選取6月齡的APP/PS1轉基因小鼠（相當于PCAD階段）及同窩出生的野生型 C57BL6j小鼠。將小鼠做如下分組：正常APP/PS1對照組；陽性對照野生型組；APP/PS1給 腺相關重組病毒與化合物組；每組η = 10只。每只小鼠提前一天禁水禁食，之后將腺相關 重組病毒的疫苗采用肛門注射的方法給予一次用藥，每只〇. 6ml，給藥完畢之后將小鼠提起 半個小時，保證疫苗無損失。在SPF級別的動物飼養室中飼養一個月。之后采用尾靜脈取 血方式取血，采用ELISA的方法檢測IgM和IgG的抗體濃度，按照說明書要求取血之后離 心，取上清，之后滴加到已經提供的ELISA板中，后滴加到已經提供的ELISA板中，加入一抗 室溫孵育1個小時，清洗三次后加入二抗，室溫孵育1個小時后清洗三次，最終加入底物反 應30分鐘，在加入終止液，在30分鐘內使用分光光度計450nm讀數。分析相關數據。發現 IgG抗體以及IgM抗體含量發生了顯著性變化，如圖3
[0026] 實施例4 :參見圖4,腺相關重組病毒疫苗能夠有效的提1?小鼠的認知功能
[0027] 選取6月齡的APP/PS1轉基因小鼠（相當于PCAD階段）及同窩出生的野生型 C57BL6j小鼠。將小鼠做如下分組：正常APP/PS1對照組；陽性對照野生型組；APP/PS1給腺 相關重組病毒與化合物組；每組η = 10只。每只小鼠提前一天禁水禁食，之后將腺相關重 組病毒的疫苗采用肛門注射的方法給予一次用藥，每只〇. 6ml，給藥完畢之后將小鼠提起半 個小時，保證疫苗無損失。在SPF級別的動物飼養室中飼養一個月。在一個月后后對各組 小鼠用水迷宮檢測空間認知能力，研究發現給藥組的空間認知能力得到了明顯的提升。如 圖4。
【主權項】
1. 一組腺相關重組病毒疫苗早期干預老年性癡呆癥的應用，其特征在于重組基因疫苗 含有IL亞基以及A-beta肽段的DNA片段。2. 如權利要求1所示，其特征在于，其中的堿基序列為A-beta為1-39,40,42,43， 2*1-15的堿基序列。3. 如權利要求1所示，其特征在于，其IL亞基為IL-2、IL-6、IL-18。4. 如權利要求2所示，其特征在于A-beta為1-39,40,42,43, 2*1-15。5. 如權利要求3所示，其特征在于接頭序列為：GGGGS、GGGS、KKK等排列。6. 如權利要求4所示，其特征在于：載體為腺病毒、腺相關病毒、慢病毒、仙臺病毒。7. 如權利要求5所示，其特征在于包含了 DNA的運載體以及相關佐劑。8. 如權利要求6所示，其特征在于佐劑為鋁化合物、弗式不完全佐劑、病毒亞基、脂質 體、抗炎、抗氧化藥物等。9. 如權利要求7所示，其特征在于給藥途徑為口服、肛門、靜脈、腹腔等。10. 如權利要求7所示，其特征在于預防和治療PCAD、Pre-MCI、MCI以及AD的應用。
【專利摘要】本發明公開了一組腺相關重組病毒與化合物早期預防與治療在老年癡呆的應用。本發明中的疫苗以腺相關病毒為載體，包裹了能夠編碼Aβ相關肽段及IL-10的融合蛋白的DNA分子，通過與其他化合物連用，能夠有效的提高小鼠的認知功能，減少腦內Aβ的水平和老年斑沉積，達到早期預防與治療在老年癡呆的作用。
【IPC分類】A61P25/00, A61P25/28, A61K47/48, A61K48/00
【公開號】CN105617397
【申請號】CN201410452787
【發明人】崔德華
【申請人】崔德華
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2014年9月9日