本發明涉(she)及(ji)生物，尤(you)其是涉(she)及(ji)一株內生真菌中(zhong)聚酮類化合物的(de)制備(bei)方法與應用。

背景技術：

1、抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)主要是由(you)細菌、霉(mei)菌或其他(ta)微生(sheng)物(wu)(wu)產(chan)生(sheng)的(de)次級代謝產(chan)物(wu)(wu)或人工合成(cheng)(cheng)的(de)類(lei)(lei)似物(wu)(wu)，主要用(yong)(yong)于(yu)治療(liao)各種(zhong)(zhong)細菌感(gan)染(ran)或致病微生(sheng)物(wu)(wu)感(gan)染(ran)類(lei)(lei)疾病，一(yi)般情況下(xia)對其宿主不會產(chan)生(sheng)嚴重的(de)副(fu)作用(yong)(yong)。上(shang)(shang)世(shi)紀(ji)20年(nian)(nian)代，青(qing)霉(mei)素(su)(su)(su)的(de)發(fa)現(xian)標(biao)志(zhi)著抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)時代的(de)來臨(lin)，并(bing)隨后(hou)進入約50年(nian)(nian)的(de)黃金發(fa)展期。現(xian)抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)的(de)種(zhong)(zhong)類(lei)(lei)已達幾千(qian)種(zhong)(zhong)，在(zai)臨(lin)床上(shang)(shang)常用(yong)(yong)的(de)亦有(you)幾百種(zhong)(zhong)。眾(zhong)所周知，超范圍、大劑(ji)量、長時間使用(yong)(yong)抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)，可以導(dao)致耐藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)性(xing)的(de)產(chan)生(sheng)。耐藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)性(xing)是指(zhi)微生(sheng)物(wu)(wu)、寄生(sheng)蟲(chong)以及腫瘤細胞對于(yu)化療(liao)藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)作用(yong)(yong)的(de)耐受性(xing)，耐藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)性(xing)一(yi)旦產(chan)生(sheng)，藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)的(de)化療(liao)作用(yong)(yong)就明(ming)顯下(xia)降。對于(yu)不斷(duan)出現(xian)的(de)新型抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)，細菌等微生(sheng)物(wu)(wu)為(wei)了(le)生(sheng)存，會慢慢適(shi)應這種(zhong)(zhong)藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)環(huan)(huan)境，并(bing)不斷(duan)地產(chan)生(sheng)變(bian)異，形成(cheng)(cheng)新的(de)更強大的(de)細菌，以此循環(huan)(huan)往復。甚至(zhi)出現(xian)多重耐藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)菌，即一(yi)種(zhong)(zhong)細菌對三類(lei)(lei)或以上(shang)(shang)抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)(su)(su)同時耐藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)，“超級細菌”便應運而生(sheng)。

2、我國的耐(nai)藥菌問題也已變得十分(fen)突出(chu)，耐(nai)藥菌引起的醫院(yuan)(yuan)內感染(ran)人數，已占到住院(yuan)(yuan)感染(ran)患(huan)者總人數30％左右(you)。這對于抗菌治療(liao)帶來了嚴峻(jun)的挑戰。因(yin)此(ci)發(fa)現并研究具有高效、低(di)毒的抗菌藥物(wu)成(cheng)為當務(wu)之急(ji)。

技術實現思路

1、本(ben)發明的目(mu)的是為了克服現有(you)耐藥菌的限制(zhi)而提供一株(zhu)內(nei)生真菌中聚酮類化(hua)合物的制(zhi)備方法與應(ying)用。

2、本發明的目的可以通過(guo)以下(xia)技術方(fang)案來實現：

3、本發明的(de)技術方案之一為(wei)提供(gong)一株內(nei)生真菌(jun)中(zhong)聚(ju)酮類化合物的(de)制(zhi)備方法，包括如下步(bu)驟：

4、s1、將內生真菌stemphylium?globuliferum?17035接種于大米培(pei)養基中發(fa)酵培(pei)養，將發(fa)酵產物用有機溶劑萃取(qu)，得(de)提取(qu)物；

5、s2、將s1步驟得到的提取物經分離、純化，得到結構式如式i、式ii或式iii所示的聚(ju)酮類化合物，

6、

7、在一些具體(ti)實施方式中(zhong)，所述(shu)內生(sheng)真菌stemphylium?globuliferum?17035，于2023年6月15日保藏于中(zhong)國微生(sheng)物菌種保藏管(guan)理委員(yuan)會普通微生(sheng)物中(zhong)心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmcc?no.40666。

8、在一些具體實施方(fang)式中(zhong)，于s1步驟，大米(mi)(mi)培養(yang)基(ji)的(de)成分包(bao)括如下質量份(fen)數的(de)原料(liao)：80份(fen)大米(mi)(mi)、120份(fen)水。

9、在一些具體實施方(fang)式中，于s1步(bu)驟，內生真(zhen)菌stemphylium?globuliferum?17035的接種量為(wei)大米培養(yang)基體積的2-3％；發酵培養(yang)的溫度(du)為(wei)28±2℃，發酵培養(yang)的時間為(wei)25-40d。

10、在(zai)一(yi)(yi)些(xie)具體實施方式中(zhong)，于s1步驟，有機溶劑選自乙(yi)酸乙(yi)酯(zhi)、石油醚(mi)中(zhong)的(de)任(ren)意(yi)一(yi)(yi)種或多種。

11、作(zuo)為(wei)優選的，所述(shu)發酵產物依次經乙酸乙酯、石油醚進行萃取。

12、作為(wei)更優選的，在所述(shu)發酵產物(wu)(wu)(wu)中加(jia)入(ru)乙(yi)(yi)酸(suan)乙(yi)(yi)酯進行浸泡萃取，收集(ji)乙(yi)(yi)酸(suan)乙(yi)(yi)酯層(ceng)(ceng)減壓濃縮，重復(fu)多次(ci)后(hou)(hou)，得(de)到(dao)乙(yi)(yi)酸(suan)乙(yi)(yi)酯萃取物(wu)(wu)(wu)；在乙(yi)(yi)酸(suan)乙(yi)(yi)酯萃取物(wu)(wu)(wu)中加(jia)入(ru)石油醚(mi)(mi)萃取，收集(ji)石油醚(mi)(mi)層(ceng)(ceng)，重復(fu)多次(ci)后(hou)(hou)，將石油醚(mi)(mi)層(ceng)(ceng)減壓濃縮，得(de)到(dao)石油醚(mi)(mi)萃取物(wu)(wu)(wu)。

13、作為(wei)更優選的，在(zai)乙酸(suan)乙酯萃取物中加入水和石油醚(mi)萃取，收(shou)集水層，在(zai)水層中加入石油醚(mi)萃取，收(shou)集石油醚(mi)層，重復多次后(hou)，將(jiang)石油醚(mi)層減壓濃縮，得到石油醚(mi)萃取物。

14、在一些具體實施方式(shi)中，于s2步驟(zou)，分(fen)離、純化的工藝包括如下步驟(zou)：

15、s2-1、將s1步驟得到(dao)的(de)提(ti)取物(wu)經一(yi)次硅膠柱層析(xi)分(fen)離(li)，在(zai)一(yi)次洗脫液的(de)梯度洗脫下，得到(dao)含(han)有所述聚酮類化合物(wu)組分(fen)的(de)一(yi)次萃取粗提(ti)物(wu)；

16、s2-2、將s2-1步(bu)驟得到(dao)的一(yi)次(ci)萃(cui)取粗提(ti)物(wu)經二(er)次(ci)硅膠柱層(ceng)析分離，在(zai)二(er)次(ci)洗(xi)脫液的梯(ti)度洗(xi)脫下，得到(dao)含(han)有(you)所述聚酮類化(hua)合物(wu)組(zu)分的二(er)次(ci)萃(cui)取粗提(ti)物(wu)；

17、s2-3、將s2-2步驟得到(dao)的(de)二次萃取(qu)粗提物經色譜柱層析(xi)分離，在流動(dong)相的(de)洗脫下，得到(dao)如式(shi)(shi)i、式(shi)(shi)ii或式(shi)(shi)iii所示結構式(shi)(shi)的(de)聚酮(tong)類化合物。

18、在一些具體實施方式中(zhong)(zhong)，于s2-1步驟中(zhong)(zhong)，所(suo)述一次硅(gui)膠(jiao)柱層析(xi)中(zhong)(zhong)的硅(gui)膠(jiao)為(wei)100-200目(mu)的正向(xiang)硅(gui)膠(jiao)；

19、所(suo)述(shu)一次洗脫(tuo)(tuo)液為石油醚與(yu)(yu)乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯(zhi)的(de)混(hun)合洗脫(tuo)(tuo)劑(ji)，提取物在石油醚與(yu)(yu)乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯(zhi)按體積比為(1:1)～(50:1)的(de)梯度下進行(xing)洗脫(tuo)(tuo)，每個(ge)梯度混(hun)合洗脫(tuo)(tuo)劑(ji)的(de)洗脫(tuo)(tuo)體積為(1500-2500)ml。

20、作(zuo)為優選的(de)(de)，提取物(wu)經體積(ji)比依次為50:1、20:1、10:1、5:1、1:1的(de)(de)石(shi)油醚與乙酸乙酯的(de)(de)混合洗(xi)脫劑處理，每個梯度的(de)(de)洗(xi)脫體積(ji)為2000ml。

21、在(zai)一些具體實施方式中，于(yu)s2-2步(bu)驟中，所述二(er)次硅膠(jiao)(jiao)柱層析中的(de)(de)硅膠(jiao)(jiao)為300-400目的(de)(de)減壓反向硅膠(jiao)(jiao)；

22、所述二次(ci)(ci)洗(xi)脫(tuo)(tuo)液(ye)為(wei)甲醇(chun)(chun)和水的(de)混合(he)洗(xi)脫(tuo)(tuo)劑，一次(ci)(ci)萃取粗提物在甲醇(chun)(chun)與水按(an)體積(ji)比(bi)為(wei)(0:100)～(20:1)的(de)梯(ti)度下進行(xing)洗(xi)脫(tuo)(tuo)，每個梯(ti)度混合(he)洗(xi)脫(tuo)(tuo)劑的(de)洗(xi)脫(tuo)(tuo)體積(ji)為(wei)(500-700)ml。

23、作為優選的，經體積比依次(ci)為20:1、40:1、60:1、80:1、0:100的甲醇和水(shui)的混(hun)合洗脫(tuo)劑處理，每個(ge)梯度(du)的洗脫(tuo)體積為600ml。

24、在(zai)一(yi)些具體(ti)實(shi)施方(fang)式中，于s2-3步(bu)驟(zou)中，所述色譜(pu)柱(zhu)層析的色譜(pu)柱(zhu)為c18色譜(pu)柱(zhu)；

25、所述流動相分(fen)別(bie)為(wei)(wei)甲(jia)酸(suan)水(shui)(shui)(shui)、乙腈(jing)，其中(zhong)甲(jia)酸(suan)水(shui)(shui)(shui)中(zhong)的甲(jia)酸(suan)體積份(fen)數(shu)為(wei)(wei)0.1％，二次萃取粗提物(wu)在乙腈(jing)與(yu)甲(jia)酸(suan)水(shui)(shui)(shui)按25-85％的梯度(du)下進行洗脫，洗脫速度(du)為(wei)(wei)(2.5-3.5)ml/min。

26、作為(wei)優(you)選的(de)，二(er)次(ci)萃取粗提(ti)物經(jing)乙腈(jing)與甲酸(suan)水按(25-35％)梯度進(jin)行洗(xi)脫(tuo)，洗(xi)脫(tuo)速度為(wei)2.5ml/min。

27、作為優(you)選的，二(er)次(ci)萃取粗(cu)提物經乙腈與甲酸水(shui)按(58-60％)梯度(du)進行洗脫，洗脫速度(du)為3.5ml/min。

28、作為(wei)優選的(de)，二次(ci)萃取(qu)粗提物經乙腈(jing)與(yu)甲(jia)酸(suan)水按(60-85％)梯度進(jin)行洗(xi)脫，洗(xi)脫速(su)度為(wei)3.0ml/min。

29、本發明(ming)的技術方案之(zhi)二為(wei)提供(gong)一種如(ru)上述技術方案之(zhi)一所(suo)述方法制備的聚酮類(lei)化(hua)合物(wu)的應(ying)用，所(suo)述聚酮類(lei)化(hua)合物(wu)用于制備抗菌藥物(wu)。

30、在(zai)一些具體實施方式中，所述抗菌藥物為抗耐藥致病(bing)菌藥物。

31、與現(xian)有(you)(you)技術相比，本(ben)發明(ming)具有(you)(you)如(ru)下有(you)(you)益效果：

32、(1)本(ben)發明(ming)在內生真菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)stemphylium?globuliferum?17035中分(fen)離得到三個新結構的聚酮類化合物(wu)(wu)，分(fen)別測定其(qi)對(dui)多種(zhong)耐藥致病(bing)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)如白色(se)念(nian)珠菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、金(jin)黃(huang)色(se)葡(pu)萄(tao)(tao)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、變異鏈球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、牙齦(yin)卟啉單胞菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)、耐甲氧西林金(jin)黃(huang)色(se)葡(pu)萄(tao)(tao)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)的抗(kang)(kang)(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)活(huo)性(xing)，其(qi)中化合物(wu)(wu)i、ii均(jun)對(dui)牙齦(yin)卟啉單胞菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)有抗(kang)(kang)(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)活(huo)性(xing)，化合物(wu)(wu)iii對(dui)多種(zhong)耐藥致病(bing)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)有較高(gao)的抗(kang)(kang)(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)活(huo)性(xing)。適宜于抗(kang)(kang)(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)先導化合物(wu)(wu)研(yan)究或用于制備(bei)抗(kang)(kang)(kang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(jun)藥物(wu)(wu)。

33、(2)本(ben)發明的提取方法成熟(shu)，工(gong)藝(yi)簡便(bian)，所得(de)產物(wu)產率高(gao)，經核(he)磁(ci)共(gong)振、紅(hong)外光(guang)譜、質譜檢測，其結(jie)構正確。

技術特征：

1.一株內(nei)生真(zhen)菌中聚酮類化合物的(de)制備方法，其特征在于，包(bao)括如(ru)下步驟：

2.根據權利要(yao)求1所述(shu)的制備方法(fa)，其特征(zheng)在(zai)于(yu)，于(yu)s1步驟，所述(shu)內(nei)生(sheng)(sheng)真菌stemphyliumglobuliferum?17035，于(yu)2023年6月15日保藏于(yu)中國(guo)微生(sheng)(sheng)物菌種保藏管理委(wei)員(yuan)會普通微生(sheng)(sheng)物中心，地址為北(bei)京市朝陽區(qu)北(bei)辰西路1號院3號，保藏編號為cgmcc?no.40666。

3.根據權利要(yao)求1所(suo)述的(de)制備方法，其(qi)特征在于，于s1步驟，內(nei)生真菌stemphyliumglobuliferum?17035的(de)接種(zhong)量為大米培養基質量的(de)2-3％；發酵培養的(de)溫度為28±2℃，發酵培養的(de)時間(jian)為25-40d。

4.根據權利要求1所述的(de)(de)制(zhi)備方(fang)法，其特征在于(yu)，于(yu)s1步驟，有機(ji)溶(rong)劑選自乙酸乙酯、石油(you)醚中(zhong)的(de)(de)任意(yi)一種或(huo)多(duo)種。

5.根據(ju)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，于s2步驟，分離、純化的工藝包括(kuo)如下步驟：

6.根據權利要求5所(suo)述的(de)制備方法，其特征在(zai)于(yu)，于(yu)s2-1步驟中，所(suo)述一次(ci)硅(gui)膠(jiao)(jiao)柱層析中的(de)硅(gui)膠(jiao)(jiao)為100-200目的(de)正向硅(gui)膠(jiao)(jiao)；

7.根據權利要求5所(suo)述(shu)的(de)制備方法，其特征(zheng)在(zai)于，于s2-2步(bu)驟中，所(suo)述(shu)二次硅膠柱層析中的(de)硅膠為300-400目的(de)減壓反向硅膠；

8.根(gen)據權利(li)要求5所述的制備方法，其特征在于，于s2-3步(bu)驟中，所述色(se)譜柱層析的色(se)譜柱為(wei)c18色(se)譜柱；

9.根據權(quan)利要求1-8任一所(suo)述(shu)方法制備的(de)聚(ju)酮類化合(he)物(wu)的(de)應用(yong)，所(suo)述(shu)聚(ju)酮類化合(he)物(wu)用(yong)于(yu)制備抗菌藥物(wu)。

10.根據(ju)權(quan)利要求9所(suo)述(shu)(shu)的(de)應用，其特征在于(yu)，所(suo)述(shu)(shu)抗菌藥物(wu)為(wei)抗耐(nai)藥致病菌藥物(wu)。

技術總結
本發明涉及一株內生真菌中聚酮類化合物的制備方法及其應用，包括如下制備步驟：S1、將內生真菌Stemphylium?globuliferum?17035接種于大米培養基中發酵培養，發酵產物用有機溶劑萃取，得提取物；S2、將S1步驟得到的提取物經分離、純化，得到如下所示的聚酮類化合物。與現有技術相比，本發明提取方法成熟，工藝簡便，所得產物產率高，制得的三個聚酮類化合物均為新結構化合物，分別測定其對多種耐藥致病菌的抗菌活性，其中化合物I、II均對牙齦卟啉單胞菌有抗菌活性，化合物III對多種耐藥致病菌有較好的抗菌活性，適宜于抗菌先導化合物研究或用于制備抗菌藥物。

技術研發人員：張敬宇,凌思琦,李瑩瑩,張立新,朱國良,劉雪婷
受保護的技術使用者：華東理工大學
技術研發日：
技術公布日：2024/9/19