本發明屬于生物醫藥(yao)，具體是(shi)重(zhong)組蛋白制(zhi)備(bei)(bei)技術，更具體涉及(ji)一種(zhong)重(zhong)組人ampar1融(rong)合蛋白及(ji)其制(zhi)備(bei)(bei)方法和應用(yong)。

背景技術：

1、腦(nao)炎是由細(xi)菌、病毒或其他病原物感(gan)染(ran)腦(nao)實(shi)質所(suo)導致(zhi)的神經(jing)功能障礙性疾病的統稱，除(chu)病毒和細(xi)菌感(gan)染(ran)所(suo)致(zhi)外(wai)，自(zi)身免疫性腦(nao)炎(ae)也占有相當的比例。

2、自身免(mian)疫(yi)(yi)性腦(nao)炎(yan)(autoimmune?encephalitis，ae)是(shi)近10余年來新進被認識的一(yi)類中樞神(shen)(shen)經(jing)系統自身免(mian)疫(yi)(yi)性疾病(bing)，ae患(huan)者常表現(xian)出精神(shen)(shen)行為異(yi)(yi)常、癲癇發作、記憶障礙、認知異(yi)(yi)常、運動異(yi)(yi)常、自主神(shen)(shen)經(jing)功能紊亂(luan)、意識下降(jiang)等嚴重的臨床癥狀。

3、ae的(de)特點(dian)是患(huan)者體(ti)(ti)內存在抗(kang)(kang)神經(jing)元表面蛋白(bai)、離子(zi)通道和受體(ti)(ti)的(de)自(zi)身抗(kang)(kang)體(ti)(ti)，這些自(zi)身抗(kang)(kang)體(ti)(ti)被認為具(ju)有(you)致(zhi)病性，可(ke)以成為疾病診斷(duan)的(de)標志物。目前，常見的(de)介導(dao)ae的(de)特異(yi)(yi)(yi)性自(zi)身抗(kang)(kang)體(ti)(ti)分別有(you)抗(kang)(kang)nmdar抗(kang)(kang)體(ti)(ti)、抗(kang)(kang)ampar抗(kang)(kang)體(ti)(ti)等(deng)，不(bu)同(tong)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)介導(dao)的(de)ae患(huan)者與伴發腫瘤(liu)及預后(hou)均有(you)較(jiao)大(da)差異(yi)(yi)(yi)。因此，及時準確檢(jian)測相(xiang)關自(zi)身抗(kang)(kang)體(ti)(ti)對ae早(zao)期診治(zhi)具(ju)有(you)極其重要的(de)意義，而本(ben)領(ling)域(yu)尚缺乏(fa)敏(min)感性和特異(yi)(yi)(yi)性均高的(de)ae自(zi)身抗(kang)(kang)體(ti)(ti)的(de)檢(jian)測方法(fa)。

4、抗α-氨基(ji)-3-羥基(ji)-5-甲基(ji)-4-異惡唑丙酸受體(ti)(ti)(ampar)腦(nao)(nao)炎是一種罕見的自身免(mian)疫(yi)性腦(nao)(nao)炎亞型，由賴等人首(shou)次報道。在診斷方面，需(xu)對(dui)疑似患(huan)者血液或(huo)腦(nao)(nao)脊液樣本進行大量篩查，常用的檢(jian)測手段有免(mian)疫(yi)熒(ying)光、elisa、免(mian)疫(yi)印跡、免(mian)疫(yi)組(zu)化等方法，這些方法普遍存在檢(jian)測過程耗時較長，步驟繁瑣，抗體(ti)(ti)需(xu)求量大，成本高，靈敏度不高等缺點。

5、ampar屬離(li)子(zi)型(xing)谷氨酸受體蛋(dan)(dan)白家族，分(fen)為glur1和glur2亞型(xing)，稱為ampar1和ampar2，本發明提供(gong)一(yi)種重組人ampar1融合蛋(dan)(dan)白，所(suo)述重組蛋(dan)(dan)白可用于(yu)檢測抗ampar1型(xing)腦炎。

技術實現思路

1、本發(fa)明的(de)一(yi)(yi)個目的(de)是提(ti)(ti)供一(yi)(yi)種重組人ampar1融(rong)合(he)蛋白的(de)制(zhi)備方法；本發(fa)明的(de)另一(yi)(yi)個目的(de)是提(ti)(ti)供一(yi)(yi)種根據所述(shu)方法制(zhi)備得到的(de)重組人ampar1融(rong)合(he)蛋白及(ji)其在檢測抗(kang)ampar1型腦炎中(zhong)的(de)用途。

2、本發明的目的通過如(ru)下(xia)技術方(fang)案實(shi)現：

3、第一方面，本(ben)發明提供(gong)一種(zhong)重(zhong)組人ampar1融(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)白(bai)，所(suo)述重(zhong)組人ampar1融(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)白(bai)是由融(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)白(bai)1與融(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)白(bai)2形成(cheng)的二聚體結(jie)構，其中，融(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)白(bai)1由ampar1胞(bao)外區(qu)1、ampar1胞(bao)外區(qu)3和兔疫球蛋(dan)(dan)白(bai)fc段依次連(lian)(lian)接(jie)組成(cheng)；融(rong)合(he)(he)(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)白(bai)2由ampar2胞(bao)外區(qu)1、ampar2胞(bao)外區(qu)3和兔疫球蛋(dan)(dan)白(bai)fc段依次連(lian)(lian)接(jie)組成(cheng)。

4、優選的，上述(shu)各區段通過(guo)連接肽(tai)連接，所述(shu)連接肽(tai)選自(zi)本領域常規使用的連接肽(tai)，包括但不限(xian)于(yu)ggggs連接肽(tai)。

5、在本發明的優選(xuan)實施(shi)方式中，所述融合蛋白(bai)1的氨基(ji)(ji)酸(suan)序列(lie)如seq?id?no:1所示(shi)，融合蛋白(bai)2的氨基(ji)(ji)酸(suan)序列(lie)如seq?id?no:2所示(shi)。

6、第二方面，本發明提供一(yi)種(zhong)編(bian)碼重組人ampar1融(rong)合蛋白(bai)的(de)核苷(gan)酸序(xu)列(lie)(lie)，其特征在于(yu)，所述核苷(gan)酸序(xu)列(lie)(lie)包(bao)括(kuo)編(bian)碼融(rong)合蛋白(bai)1的(de)序(xu)列(lie)(lie)和(he)編(bian)碼融(rong)合蛋白(bai)2的(de)序(xu)列(lie)(lie)，所述序(xu)列(lie)(lie)選自下列(lie)(lie)方式中(zhong)的(de)一(yi)種(zhong)：

7、1)編碼融合蛋(dan)白(bai)1和融合蛋(dan)白(bai)2的核苷酸序列分別為seq?id?no:3和seq?id?no:4序列的全部；

8、2)編碼融合(he)蛋白(bai)1和融合(he)蛋白(bai)2的核苷酸序列分別(bie)與(yu)seq?id?no:3和seq?id?no:4序列具(ju)有(you)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或(huo)99％的同一性程度的序列；

9、3)編(bian)碼融(rong)合(he)蛋白1和(he)融(rong)合(he)蛋白2的(de)核苷酸序列分別與seq?id?no:3和(he)seq?id?no:4序列的(de)差(cha)異(yi)不超(chao)過5、4、3、2或1個核苷酸。

10、優(you)選的，編碼融合(he)(he)蛋(dan)白1和融合(he)(he)蛋(dan)白2的核苷酸序列分別為seq?id?no:3和seq?idno:4序列的全(quan)部。

11、第(di)三(san)方面(mian)，本(ben)發明提供(gong)一種表(biao)達載體(ti)，其(qi)特征在于，所述表(biao)達載體(ti)中分別含有編碼(ma)融合(he)蛋(dan)(dan)白1和(he)編碼(ma)融合(he)蛋(dan)(dan)白2的核苷酸序(xu)列。

12、第四(si)方面，本發明提(ti)供一種由所述表達載體轉化的(de)轉化細胞(bao)。

13、優選(xuan)的，所(suo)述轉化細胞的宿(su)主細胞選(xuan)自hek293細胞、中(zhong)國倉鼠卵巢細胞或bhk細胞。

14、第五方面，本發明(ming)提供一(yi)種重組人ampar1融合蛋白的(de)制備方法，所述(shu)方法為培養(yang)上述(shu)轉化(hua)細胞，誘導表達，獲(huo)得重組人ampar1融合蛋白。

15、優選的(de)，所(suo)述(shu)重(zhong)(zhong)組人ampar1融合蛋白(bai)的(de)制備方(fang)法(fa)包括：將(jiang)(jiang)seq?id?no:3所(suo)示的(de)基因(yin)(yin)整(zheng)合到(dao)(dao)(dao)質(zhi)粒中(zhong)，構建(jian)得(de)到(dao)(dao)(dao)重(zhong)(zhong)組質(zhi)粒1；將(jiang)(jiang)seq?id?no:4所(suo)示的(de)基因(yin)(yin)整(zheng)合到(dao)(dao)(dao)質(zhi)粒中(zhong)，構建(jian)得(de)到(dao)(dao)(dao)重(zhong)(zhong)組質(zhi)粒2；將(jiang)(jiang)所(suo)述(shu)質(zhi)粒經轉(zhuan)化(hua)(hua)、提取、酶切鑒定后轉(zhuan)染至宿(su)主(zhu)細胞得(de)到(dao)(dao)(dao)轉(zhuan)化(hua)(hua)細胞，培養轉(zhuan)化(hua)(hua)細胞，誘導表(biao)達，分(fen)離(li)純化(hua)(hua)，獲得(de)重(zhong)(zhong)組人ampar1融合蛋白(bai)。

16、更優選的，所述重組人ampar1融(rong)合蛋白的制備方法包括(kuo)如下步驟：

17、(1)將經密(mi)碼子優(you)(you)化(hua)后(hou)(hou)的(de)(de)ampar1胞(bao)(bao)外(wai)區(qu)(qu)(qu)1基(ji)(ji)因序列(lie)、ampar1胞(bao)(bao)外(wai)區(qu)(qu)(qu)3基(ji)(ji)因序列(lie)整(zheng)(zheng)合在(zai)(zai)puc57質(zhi)(zhi)粒中，再通過亞克隆構(gou)建至含(han)有(you)兔疫(yi)球蛋白fc段基(ji)(ji)因的(de)(de)載體pcdna3.4上(shang)，得到重(zhong)組質(zhi)(zhi)粒1；同樣的(de)(de)，將經由密(mi)碼子優(you)(you)化(hua)后(hou)(hou)的(de)(de)ampar2胞(bao)(bao)外(wai)區(qu)(qu)(qu)1基(ji)(ji)因序列(lie)、ampar2胞(bao)(bao)外(wai)區(qu)(qu)(qu)3基(ji)(ji)因序列(lie)整(zheng)(zheng)合在(zai)(zai)puc57質(zhi)(zhi)粒中，再通過亞克隆構(gou)建至含(han)有(you)兔疫(yi)球蛋白fc段基(ji)(ji)因的(de)(de)載體pcdna3.4上(shang)，得到重(zhong)組質(zhi)(zhi)粒2；

18、(2)將重組質粒1和重組質粒2轉染至宿主細胞(bao)，誘導(dao)表(biao)達，分離純化得到(dao)重組人ampar1融合蛋白。

19、在(zai)本發明的具(ju)體實施方式中(zhong)，所述重組人(ren)ampar1融合蛋白(bai)通(tong)過如下步驟制備得(de)到：

20、s1：將(jiang)經密碼(ma)子(zi)優化后的ampar1胞(bao)外區1基(ji)因(yin)序(xu)列(lie)、ampar1胞(bao)外區3基(ji)因(yin)序(xu)列(lie)整合(he)在(zai)puc57質(zhi)粒(li)中，轉(zhuan)(zhuan)化，篩選得(de)到陽性轉(zhuan)(zhuan)化子(zi)1；同時，將(jiang)經密碼(ma)子(zi)優化后的ampar2胞(bao)外區1基(ji)因(yin)序(xu)列(lie)、ampar2胞(bao)外區3基(ji)因(yin)序(xu)列(lie)整合(he)在(zai)puc57質(zhi)粒(li)中，轉(zhuan)(zhuan)化，篩選得(de)到陽性轉(zhuan)(zhuan)化子(zi)2；

21、s2：使用質粒小提(ti)試劑盒(he)分別提(ti)取上述(shu)質粒；

22、s3：使用限(xian)制酶ecorⅰ和(he)ecorⅴ對載(zai)體(含有(you)兔fc的載(zai)體pcdna3.4)和(he)上述質(zhi)粒分別進行雙酶切，通過瓊脂糖電泳、膠回收(shou)試劑盒(he)切膠回收(shou)提取的基因片段和(he)載(zai)體片段；

23、s4：用t4連接酶分別將兩種(zhong)基因(yin)片(pian)段與(yu)載體片(pian)段連接，將連接產物(wu)轉(zhuan)化，篩選得(de)到陽性(xing)(xing)轉(zhuan)化子1和陽性(xing)(xing)轉(zhuan)化子2；

24、s5：pcr擴增，通過瓊脂糖(tang)電泳進(jin)行鑒定正確后大(da)提質粒，獲(huo)得(de)重(zhong)組質粒1和重(zhong)組質粒2；

25、s6：將重組(zu)質粒1和(he)2轉染至宿主細胞，誘導(dao)表達，分(fen)離純(chun)化得到(dao)重組(zu)人ampar1融合(he)蛋(dan)白。

26、第六方面(mian)，本發明提供一種(zhong)所述(shu)重(zhong)組人ampar1融合蛋(dan)白在制備自身免疫性腦炎診斷(duan)試劑和/或試劑盒中的(de)應用。

27、優選的，所(suo)述自身免疫性腦(nao)炎(yan)為抗(kang)ampar1型腦(nao)炎(yan)。

28、在一些(xie)實(shi)施(shi)例(li)中(zhong)，所述診斷試(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)(he)選自(zi)流式細胞分析(xi)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)(he)、免(mian)疫印(yin)跡檢(jian)測(ce)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)(he)、免(mian)疫層析(xi)檢(jian)測(ce)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)(he)、免(mian)疫組化檢(jian)測(ce)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)(he)、elisa試(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)(he)、蛋(dan)白沉淀試(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)(he)、免(mian)疫熒光(guang)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)(he)或電(dian)化學發光(guang)檢(jian)測(ce)試(shi)(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)(he)。

29、優(you)選的，所述試(shi)劑盒(he)(he)為流式(shi)細胞(bao)分(fen)析試(shi)劑盒(he)(he)。

30、第(di)七方面，本(ben)發明提供一(yi)種用于診(zhen)斷抗ampar1型(xing)腦炎的流式(shi)細胞分(fen)析試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下(xia)組分(fen)：

31、(1)微(wei)球混懸(xuan)液(ye)：將(jiang)加入保(bao)存液(ye)的微(wei)球按照50μl/管分裝(zhuang)，加入950μl保(bao)存液(ye)；

32、(2)檢測抗體溶液：將生物素標(biao)記的重組人ampar1融合蛋白按(an)照10μl/管分裝，加入4990μl純化水；

33、(3)熒光素溶液：含有親和素和藻(zao)紅蛋白1μg/ml，5ml/管；

34、(4)樣本稀釋液：含0.5％bsa的pb溶液；

35、(5)清洗液：20×pbst緩沖(chong)液。

36、本發明(ming)提供的重組人ampar1融合蛋白具有如下技術優勢：

37、1、天然的(de)ampar1蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)是一種三(san)次(ci)跨膜的(de)膜蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)，其胞外結構可溶(rong)，胞內結構不(bu)可溶(rong)，這就導致按照常規方法(fa)制(zhi)備(bei)(bei)得到(dao)的(de)ampar1全長蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)由于溶(rong)解性問(wen)題(ti)無法(fa)純化，收率和純度(du)均較(jiao)低。本發(fa)明通過對ampar1蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)結構特征和抗原(yuan)表位分析(xi)驗(yan)證，選擇具(ju)有明顯抗原(yuan)性結構區(qu)域，選擇具(ju)備(bei)(bei)ampar1蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)特異性功能(neng)表位的(de)部分制(zhi)備(bei)(bei)融(rong)合蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)，同時兼顧選擇片段的(de)溶(rong)解性問(wen)題(ti)，使制(zhi)備(bei)(bei)得到(dao)的(de)融(rong)合蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)不(bu)僅可以顯著(zhu)提高檢測的(de)敏感(gan)度(du)，而且溶(rong)解度(du)較(jiao)好，易于后期大規模生(sheng)產純化；

38、2、本發明(ming)篩選(xuan)的(de)不同分子片段以融(rong)合(he)(he)形式(shi)組合(he)(he)，并(bing)且選(xuan)擇有(you)利的(de)融(rong)合(he)(he)骨(gu)架(jia)，即含(han)有(you)兔fc的(de)載體pcdna3.4作為融(rong)合(he)(he)骨(gu)架(jia)，不僅(jin)使表(biao)達的(de)重組蛋(dan)白(bai)易于純化(hua)，而(er)且加入(ru)fc片段后融(rong)合(he)(he)蛋(dan)白(bai)形成異源二聚體結構(gou)，保持了ampar1關鍵結構(gou)域的(de)正確構(gou)象，形式(shi)上更(geng)接(jie)近(jin)天然蛋(dan)白(bai)，提(ti)高檢測敏感度(du)；

39、3、根(gen)據(ju)本發明(ming)提供的方(fang)法(fa)制(zhi)備(bei)得到(dao)的重(zhong)組(zu)人ampar1融(rong)合蛋白溶解性好，易(yi)于純化，便(bian)于定量(liang)和(he)質量(liang)控制(zhi)，也方(fang)便(bian)其與自(zi)身免(mian)疫性腦炎(yan)的其他(ta)重(zhong)組(zu)抗原組(zu)合使用，提高檢(jian)測和(he)診斷效(xiao)能。