本發(fa)明(ming)屬于生物工程技術與(yu)應用領域，具體地涉(she)及產5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿菌工程菌及構建方(fang)法。

背景技術：

1、5-氨(an)基乙酰丙(bing)酸(suan)(5-aminolevulinic?acid,5-ala)是一(yi)種(zhong)非(fei)蛋白類氨(an)基酸(suan)，是生(sheng)(sheng)物(wu)合成(cheng)卟啉、葉綠素、血紅素和維(wei)生(sheng)(sheng)素b12等(deng)四吡(bi)咯類化合物(wu)的關鍵前(qian)(qian)體，在(zai)醫(yi)藥、農業、畜牧業等(deng)領域具有廣(guang)(guang)泛應(ying)用[1]。已(yi)經證實(shi)自然(ran)界中(zhong)天然(ran)存在(zai)兩(liang)種(zhong)5-ala的生(sheng)(sheng)物(wu)合成(cheng)途(tu)徑，c4途(tu)徑和c5途(tu)徑，均以三羧酸(suan)循環(tricarboxylic?acid?cycle,tca?cycle)的中(zhong)間物(wu)質為前(qian)(qian)體合成(cheng)5-ala[2]。c4途(tu)徑主要天然(ran)存在(zai)于某些紫色非(fei)硫(liu)光(guang)合細(xi)菌以及(ji)高(gao)等(deng)動(dong)物(wu)中(zhong)，c5途(tu)徑則廣(guang)(guang)泛存在(zai)于植物(wu)、藻(zao)類及(ji)若干細(xi)菌類別(bie)中(zhong)[3]。目前(qian)(qian)5-ala的大規(gui)模(mo)生(sheng)(sheng)產(chan)(chan)主要以化學法為主，但是合成(cheng)過程(cheng)中(zhong)存在(zai)的高(gao)成(cheng)本、高(gao)污染和低得率(lv)等(deng)問題(ti)大大限(xian)制了其大規(gui)模(mo)生(sheng)(sheng)產(chan)(chan)與(yu)應(ying)用。采用生(sheng)(sheng)物(wu)合成(cheng)策(ce)略代替化學合成(cheng)路(lu)徑，降低生(sheng)(sheng)產(chan)(chan)成(cheng)本，是推動(dong)5-ala在(zai)醫(yi)藥、農業及(ji)畜牧養殖等(deng)領域廣(guang)(guang)泛應(ying)用的主流趨勢(shi)。

2、谷氨(an)酸(suan)棒桿(gan)菌被美國藥監局認為是安全的微生(sheng)物(wu)，且(qie)遺(yi)傳(chuan)背景(jing)較(jiao)為清晰，擁有較(jiao)為成(cheng)熟的基因(yin)操作工具，已應用(yong)于多種(zhong)氨(an)基酸(suan)的工業化生(sheng)產[2]。此外，谷氨(an)酸(suan)棒桿(gan)菌是革蘭氏(shi)陽性(xing)菌，對酸(suan)的耐受性(xing)優(you)于大腸桿(gan)菌，另外其缺少甘(gan)氨(an)酸(suan)裂解系統[4]，基于以(yi)上多種(zhong)優(you)勢，谷氨(an)酸(suan)棒桿(gan)菌已成(cheng)為生(sheng)物(wu)合成(cheng)5-ala的重要底盤。

3、目前c4途徑(jing)合(he)成(cheng)(cheng)5-ala的(de)(de)(de)(de)工程(cheng)菌(jun)株(zhu)(zhu)主要(yao)是(shi)大腸(chang)桿菌(jun)escherichia?coli和(he)(he)谷(gu)氨(an)(an)(an)酸(suan)棒(bang)桿菌(jun)，主要(yao)的(de)(de)(de)(de)代謝工程(cheng)策略包括引(yin)(yin)入并(bing)優化(hua)外(wai)源(yuan)(yuan)(yuan)alas，提高(gao)(gao)前體物(wu)質(zhi)琥(hu)珀酰輔(fu)(fu)酶a供給，抑(yi)制下游基(ji)因hemb表達，提高(gao)(gao)5-ala體外(wai)運輸能(neng)力，調控(kong)輔(fu)(fu)因子(zi)plp供給等(deng)。1996年，van?derwerf等(deng)人在(zai)(zai)e.coli?dh1中(zhong)(zhong)引(yin)(yin)入類(lei)球紅(hong)(hong)細(xi)菌(jun)的(de)(de)(de)(de)alas編(bian)碼(ma)基(ji)因，在(zai)(zai)外(wai)源(yuan)(yuan)(yuan)添加(jia)2g/l甘(gan)氨(an)(an)(an)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)條(tiao)件(jian)下，合(he)成(cheng)(cheng)了(le)(le)2.25mm?5-ala，首(shou)次(ci)實現了(le)(le)5-ala的(de)(de)(de)(de)異源(yuan)(yuan)(yuan)生物(wu)轉化(hua)[5]。pu等(deng)人通(tong)(tong)(tong)過在(zai)(zai)e.coli中(zhong)(zhong)分別(bie)單獨敲(qiao)除succd和(he)(he)sdhab，阻斷琥(hu)珀酰coa下游代謝途徑(jing)，succd和(he)(he)sdhab缺失菌(jun)株(zhu)(zhu)的(de)(de)(de)(de)5-ala產量(liang)分別(bie)提高(gao)(gao)了(le)(le)25.59％和(he)(he)12.40％[6]。本課題(ti)組首(shou)次(ci)報道(dao)了(le)(le)將c4途徑(jing)應用于谷(gu)氨(an)(an)(an)酸(suan)棒(bang)桿菌(jun)的(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)，以谷(gu)氨(an)(an)(an)酸(suan)棒(bang)桿菌(jun)atcc?13032為(wei)出發菌(jun)株(zhu)(zhu)，引(yin)(yin)入密碼(ma)子(zi)優化(hua)的(de)(de)(de)(de)類(lei)球紅(hong)(hong)細(xi)菌(jun)rhodobacter?sphaeroides來源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)hema，探(tan)究(jiu)(jiu)(jiu)外(wai)源(yuan)(yuan)(yuan)添加(jia)前體物(wu)質(zhi)甘(gan)氨(an)(an)(an)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)最(zui)適(shi)濃度，敲(qiao)除乙酸(suan)和(he)(he)乳(ru)酸(suan)合(he)成(cheng)(cheng)途徑(jing)的(de)(de)(de)(de)相關基(ji)因(ldha、pqo、pta、acka和(he)(he)cat)集中(zhong)(zhong)碳通(tong)(tong)(tong)量(liang)，敲(qiao)除4個編(bian)碼(ma)高(gao)(gao)分子(zi)量(liang)青霉(mei)素結合(he)蛋白(bai)(hmwpbps，分別(bie)由(you)(you)pbp1a、pbp1b、pbp2a和(he)(he)pbp2b編(bian)碼(ma))的(de)(de)(de)(de)基(ji)因，增強細(xi)胞壁(bi)通(tong)(tong)(tong)透性，進一步(bu)增加(jia)細(xi)胞外(wai)5-ala的(de)(de)(de)(de)積累，最(zui)終(zhong)菌(jun)株(zhu)(zhu)ala7的(de)(de)(de)(de)5-ala產量(liang)達到7.53g/l[7]。由(you)(you)于甘(gan)氨(an)(an)(an)酸(suan)是(shi)c4途徑(jing)合(he)成(cheng)(cheng)5-ala的(de)(de)(de)(de)重要(yao)前體，本課題(ti)組的(de)(de)(de)(de)后續研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)中(zhong)(zhong)，以上述報道(dao)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)菌(jun)株(zhu)(zhu)ap2出發，通(tong)(tong)(tong)過過表達seraδ197、serb和(he)(he)serc重塑(su)了(le)(le)絲氨(an)(an)(an)酸(suan)和(he)(he)甘(gan)氨(an)(an)(an)酸(suan)生物(wu)合(he)成(cheng)(cheng)途徑(jing)，在(zai)(zai)外(wai)源(yuan)(yuan)(yuan)添加(jia)7.5g/l甘(gan)氨(an)(an)(an)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)條(tiao)件(jian)下，5-ala產量(liang)由(you)(you)2.7g/l提高(gao)(gao)至3.4g/l[8]。另外(wai)，在(zai)(zai)一項(xiang)以大腸(chang)桿菌(jun)為(wei)底盤合(he)成(cheng)(cheng)5-ala的(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)中(zhong)(zhong)，通(tong)(tong)(tong)過過表達其自身來源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)coaa，5-ala的(de)(de)(de)(de)產量(liang)由(you)(you)1.83g/l提高(gao)(gao)到2.44g/l，提高(gao)(gao)了(le)(le)33.3％[9]。

4、c4途徑(jing)合成(cheng)5-ala依賴于5-氨基(ji)乙(yi)酰丙酸合成(cheng)酶(5-ala?synthase,alas)的催化活性，以琥珀酰coa和甘氨酸為底物，經一步酶促反應合成(cheng)5-ala[10]。在本(ben)課題組的前期研究中，經半胱氨酸靶向突(tu)變(bian)篩選得(de)到一個alas突(tu)變(bian)體rp-c132a(alas最初來(lai)源于rhodopseudomonas?palustris，由基(ji)因hema編碼)，解除了血紅素(su)的反饋抑制，且酶的穩定性和活性得(de)到增強[11]。

5、谷(gu)(gu)氨酸棒桿菌已(yi)成(cheng)(cheng)為生(sheng)物合成(cheng)(cheng)5-ala的(de)重要底盤。而目前谷(gu)(gu)氨酸棒桿菌以(yi)c4途(tu)徑合成(cheng)(cheng)5-ala的(de)研(yan)究中，關鍵基因大多以(yi)質粒(li)的(de)形式(shi)過表達，存在質粒(li)丟失影響5-ala合成(cheng)(cheng)能力的(de)風險。

技術實現思路

1、本發明的目的是(shi)克(ke)服(fu)現有技術(shu)的不足，提供(gong)一種產(chan)5-氨(an)基乙酰丙酸(suan)的谷氨(an)酸(suan)棒桿菌(jun)工程菌(jun)的構建方法。

2、本(ben)發明的(de)第二個目(mu)的(de)是提供第二種產5-氨基乙酰丙(bing)酸的(de)谷(gu)氨酸棒(bang)桿菌工程(cheng)菌的(de)構建方(fang)法。

3、本發明的第(di)三(san)個目(mu)的是(shi)提(ti)供(gong)第(di)三(san)種產5-氨基乙酰丙酸(suan)的谷氨酸(suan)棒(bang)桿菌工程(cheng)菌的構(gou)建方(fang)法。

4、本發明的第四個(ge)目的是提供第四種產(chan)5-氨基乙酰丙酸(suan)的谷氨酸(suan)棒桿菌(jun)工(gong)程菌(jun)的構(gou)建方法(fa)。

5、本發(fa)明的(de)第(di)五個目(mu)的(de)是(shi)提供第(di)五種產(chan)5-氨基(ji)乙酰丙酸(suan)的(de)谷(gu)氨酸(suan)棒桿(gan)菌(jun)工程菌(jun)的(de)構建方(fang)法。

6、本發明的(de)第六個目的(de)是提供(gong)上述構(gou)建方法構(gou)建的(de)產5-氨(an)基乙酰丙酸(suan)的(de)谷氨(an)酸(suan)棒桿菌(jun)工程菌(jun)。

7、本發明的(de)第七(qi)個(ge)目(mu)的(de)是(shi)提供上述產(chan)5-氨基乙酰丙酸(suan)的(de)谷氨酸(suan)棒桿菌工程菌在產(chan)5-氨基乙酰丙酸(suan)中的(de)應用。

8、本(ben)發明的技術方案概(gai)述如下：

9、第(di)一種(zhong)產5-氨基乙酰丙酸的谷(gu)氨酸棒桿菌工(gong)程菌的構建方法(fa)，包(bao)括如下步驟(zou)：

10、在谷氨酸棒桿菌(jun)(jun)重組菌(jun)(jun)株cgl11-rm-bei染色體上acea、cata、pqo、succd位點整合4拷貝沼澤紅假單胞菌(jun)(jun)rhodopseudomonas?palustris來(lai)源的hema基因突變(bian)體hemac132a，得到(dao)菌(jun)(jun)株a4；

11、所述hema基因突變(bian)體hemac132a的(de)核(he)苷(gan)酸序列如seq?id?no.1所示。

12、第二種(zhong)產5-氨基乙(yi)酰丙酸的(de)谷氨酸棒桿菌工程菌的(de)構建方法，包括如下(xia)步驟：在(zai)菌株(zhu)a4染(ran)色體上ldha位(wei)點整合icd-lpd操縱子，得到(dao)菌株(zhu)a23；

13、所述(shu)icd-lpd操縱子如psod*(del17bp)-rbs3-icd-rbs3-lpd所示(shi)；

14、所(suo)(suo)述(shu)psod*(del17bp)為刪(shan)除psod*末尾17bp的(de)核(he)苷酸序列，所(suo)(suo)述(shu)核(he)苷酸序列如seq?idno.2所(suo)(suo)示；

15、所述rbs3的核苷(gan)酸序列為；aagaggag；

16、所述(shu)icd基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

17、所(suo)述(shu)lpd基(ji)因的核苷酸序列如(ru)seq?id?no.5所(suo)示。

18、第(di)三種產5-氨(an)基乙酰(xian)丙酸的谷氨(an)酸棒桿菌(jun)工(gong)程菌(jun)的構(gou)建方法，包括如下步驟：

19、在(zai)菌(jun)株a23染色(se)體上buta位點增(zeng)加(jia)一個谷氨酸(suan)棒桿菌(jun)的(de)coaa基因(yin)拷貝(bei)，得到菌(jun)株a26；

20、所(suo)述(shu)coaa基因的核苷酸序(xu)列如seq?id?no.6所(suo)示。

21、第四種產5-氨(an)基乙酰丙酸的谷氨(an)酸棒桿菌工(gong)程菌的構(gou)建方法，包括如下步驟：

22、用ptuf啟(qi)(qi)動子(zi)替換(huan)權利要求3的(de)菌株a26的(de)panb-panc操縱子(zi)的(de)啟(qi)(qi)動子(zi)，得到菌株a40；

23、所述ptuf啟動(dong)子的核苷酸序(xu)列如seq?id?no.7所示；

24、所述(shu)panb-panc操(cao)縱子的啟動子的核苷(gan)酸序(xu)列(lie)如seq?id?no.8所示。

25、第五種產5-氨(an)基(ji)乙(yi)酰(xian)丙酸的(de)谷氨(an)酸棒桿菌(jun)(jun)工程菌(jun)(jun)的(de)構(gou)建方法，包括如(ru)下步驟：

26、用ptuf啟(qi)(qi)動子(zi)替(ti)換權(quan)利要求4的(de)(de)菌(jun)株a40的(de)(de)pand基(ji)因的(de)(de)啟(qi)(qi)動子(zi)；得到菌(jun)株a42；

27、所述pand基(ji)因的(de)啟動子的(de)核苷酸序列如seq?id?no.9所示。

28、上述(shu)任一(yi)方法構建的產(chan)5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒桿(gan)菌工程菌。

29、上述工程(cheng)菌在(zai)產5-氨基乙酰丙酸中的(de)應用(yong)。

30、有益效果

31、本發(fa)明中構建的(de)產(chan)5-氨(an)基(ji)(ji)乙酰(xian)丙酸(suan)的(de)谷氨(an)酸(suan)棒桿菌工程菌均不攜(xie)帶質粒，在(zai)有氧條(tiao)件下以葡萄(tao)糖為(wei)底物通過簡單(dan)的(de)發(fa)酵工藝生(sheng)產(chan)5-氨(an)基(ji)(ji)乙酰(xian)丙酸(suan)，a4、a23、a26、a40和a42的(de)5-氨(an)基(ji)(ji)乙酰(xian)丙酸(suan)產(chan)量分別為(wei)3.41±0.21g/l、5.68±0.11g/l、6.13±0.11g/l、6.39±0.20g/l、6.30±0.15g/l，具有很(hen)好的(de)應(ying)用前景。