專利名稱：TaqMan-COLD-PCR方法檢測外周血中JAK2V617F突變率的制作方法
技術領域：
本發明專利涉及一種新型JAK2V617F突變率的檢測方法，具體是采用TaqMan/MGB 探針技術，結合COLD-PCR基因擴增原理，通過Real-Time PCR分析系統定量測定外周血基因組DNA中JAK2V617F突變率的方法。
背景技術：
2005年多個研究組同時發現JAK2 (Janus Kinase2)基因第1849 (G> Τ)位點突變與骨髓增殖性疾病(MPDs)有關，該突變可明顯導致真性紅細胞增多癥(PV)、特發性血小板增多癥(ET)和骨髓纖維化(IMF)的發生和發展。JAK2屬于Janus激酶家族，基因定位于9 號染色體短臂2區4帶(9p23-24)。JAK2基因突變位于JAK2基因第1849位，由原來的鳥嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)所取代，使得JAK2的JH2結構域的617位的纈氨酸(V)錯義編碼為苯丙氨酸(F)。JAK2突變(JAK2 V617F)為獲得性體細胞突變，起源于造血干細胞并可在其子代細胞中克隆性傳遞。JAK2 V617F突變發生空間構象改變，導致激酶活性增強，使得突變的造血干細胞對血細胞生長因子如血小板生成素(IPO)、紅細胞生成素(EPO)、胰島素樣生長因子(IGFl)、干細胞生長因子(SCF)和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)超敏感，導致三系骨髓細胞增殖。研究顯示，JAK2 V617F突變在PV患者中接近100%，ET和IMF患者接近50%，小于10%的ET和IMF患者以及1/3的PV患者中可表現為純合型突變。由于JAK2 V617F是獲得性造血干細胞突變，造血干細胞的混合性克隆生長或雜合性突變，導致骨髓和外周血中含有野生型和突變型JAK2基因組DNA。Xu X等報道在37例非MDI3S診斷的JAK2 V617F 患者中，有25例JAK2 V617F突變率小于5%，因此，對于JAK2 V617F檢測方法的敏感性，特別是少量突變克隆株的檢測，顯得尤為重要。2006年對超過700人的健康對照和繼發性骨髓增殖疾病的研究中未發現JAK2 V617F突變，顯示JAK2V617F突變對于MPDs具有100%的特異性。然而，2007年文獻研究報道顯示，在3935例缺乏MDI3S診斷的患者中有37例(1% ) JAK2 V617F突變，涉及的疾病包括腎功能衰竭、胃癌、血栓、冠心病、糖尿病、動脈粥樣便化和腦血管病等；近期文獻報道， 具有JAK2 V617F突變的腹腔血栓(包括肝、門靜脈、腸系膜靜脈血栓)患者為16-27%，腦血拴患者為20.0%，其中17-37%腹腔血栓患者和4. 8%腦血栓患者缺乏MDI3S的診斷，而 RemachaAF等報道在血栓患者中JAK2V617F突變陽性率非常少見(1/295例)。Colaizzo D 等對99例門脈和腸系膜靜脈血栓患者的JAK2V617F研究顯示，其中17例(17. 2% )具有 JAK2V617F雜合突變，經平均41個月的隨訪后，10例攜帶JAK2V617F突變患者中的3例被診斷為具有自發性骨髓纖維化(n = 2)和真性紅細胞增多癥(n = 1)。以上研究提示JAK2 V617F作為MDI^s的診斷是否具有100%的陰性預測值，JAK2V61F突變率為多少可以表現為 MPDs的臨床癥狀，是否在其它血栓性疾病如急性冠脈綜合癥，腦血管病以及出血性疾病的患者中單獨存在，其臨床應用價值有待于進一步研究。
2008年世界衛生組織(WHO)以將JAK2V617F突變納入到上述疾病的診斷標準中。 由于JAK2 V617F是獲得性造血干細胞突變，造血干細胞的混合性克隆生長，導致骨髓和外周血中JAK2V617F呈不同程度的突變率。有研究等報道在37例非MDI3S診斷的JAK2 V617F 患者中，有25例JAK2 V617F突變率小于5%。因此，對于JAK2 V617F檢測方法的敏感性， 特別是少量突變克隆株的檢測，對疾病的診斷和治療監測顯得尤為重要。文獻報道，DNA直接測序方法檢測突變率的下限為20%左右；等位基因特異PCR方法敏感性為1-3% ；熒光定量PCR-ARMS原理和溶解曲線方法的敏感性為和-10%, 限制性片段長度多態性(RFLP)的敏感性為20%左右。目前未見JAK2V617F突變率檢測下限達到0.1%的文獻報道。

發明內容
本發明專利需要解決的技術問題是，克服背景技術的不足，提供一種高敏感性的在外周血基因組DNA中檢測JAK2V617F的突變率的方法。本發明專利主要采用了 TaqMan/ MGB探針技術，結合COLD-PCR基因擴增原理，通過Real-Time PCR分析系統定量測定外周血基因組DNA中JAK2V617F突變率的方法(TaqMan-COLD-PCR方法)。
具體實施例方式1.設計探針及引物。2.構建野生、突變質粒標準品。3.確定TaqMan-COLD-PCR最佳變性溫度。4. PCR反應體系中各種試劑的濃度配制。5.基因組DNA濃度定量，野生及突變標準品的配制。6.建立TaqMan-COLD-PCR檢測突變率的標準曲線，確定檢測線性范圍。7.患者外周血中JAK2V617F突變率檢測，評價突變率檢測下限和變異率。
權利要求
1.本發明是一種高敏感性的在外周血基因組DNA中檢測JAK2V617F突變率的方法， 以TaqMan/MGB探針技術結合熒光定量cold-PCR技術的雙探針單反應體系的新檢測方法， 包括JAK2V617F野生型、突變型質粒標準品的構建、校準，PCR測定體系中引物和探針的設計，PCR擴增變性溫度的選擇，突變率標準曲線的建立，其特征在于可對JAK2V617F突變百分率進行定量檢測，突變率檢測下限0. 1 %，標本易留取，具有操作簡單、重復性好、高通量檢測標本、檢測報告時間短等特點。
2.根據權利要求1所述本發明是檢測JAK2V617F突變率的新方法，其特征在于引物及探針的自主設計，并以TaqMan/MGB作為突變堿基的檢測信號。
3.根據權利要求2所述，其特征在于該方法中變性溫度的設定，引物和探針的合理設計，PCR反應體系中各種試劑的濃度配比。
4.根據權利要求1所述的方法，對JAK2V617F突變百分率進行定量檢測，突變率檢測下限0. 1%，其特征在于結合熒光定量cold-PCR的技術原理提高突變率的檢測下線。
5.根據權利要求1所述的方法，具有簡便、易操作的特點，其特征在于采用外周血基因組DNA進行檢測，標本易留取，且在一個反應體系內完成檢測。
全文摘要
TaqMan-COLD-PCR方法檢測外周血中JAK2V617F突變率以外周血基因組DNA作為檢測標本，在一個反應體系內完成檢測，對JAK2V617F突變百分率進行定量檢測，檢測下限為0.1％，具有操作簡單、重復性好、高通量檢測標本、報告時間短等特點，尤其適用于少量突變克隆株的檢測。本發明解決的技術問題是，克服背景技術的不足，提供一種高敏感性的外周血基因組DNA中檢測JAK2V617F的突變率的方法。由于JAK2V617F突變作為骨髓增殖性疾病唯一分子診斷標志物，已納入骨髓增殖性疾病診斷標準中，該發明將明顯提高上述疾病的診斷率。同時也可用于上述疾病治療過程中療效監測。
文檔編號C12Q1/68GK102321741SQ20111022164
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月4日 優先權日2011年8月4日
發明者梁國威 申請人:航天中心醫院