一種制備固定化芳香化酶的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及制備固定化芳香化酶的方法，具體利用的技術為表面環氧基功能化修 飾的介孔娃球吸附法。
【背景技術】
[0002] 芳香化酶(aromatase)又名〔￥口19，是細胞色素口450酶系中的一種，是體內雌雄激 素轉化的關鍵酶。它在NADPH存在的條件下，能將雄締二酬和睪酬分別轉化為雌酬和雌二 醇，多種對雌激素有依賴的腫瘤如乳腺癌、子宮內膜癌、惡性卵巢腫瘤都有芳香化酶的過度 表達。其中芳香化酶與乳腺癌關系尤為密切，約60%~70%的乳腺癌的生長依賴于雌激素。 芳香化酶抑制劑使芳香化酶失去作用，雄激素無法轉化為雌激素，從而阻斷了雌激素作用 下腫瘤細胞的生長。由于芳香化酶只催化雌激素合成的最后一步反應，抑制芳香化酶并不 會影響到體內其他激素的合成，因此芳香化酶是預防和治療激素依賴型乳腺癌的一個重要 祀點。近年來，芳香化酶抑制劑的問世使得乳腺癌治療邁入了新的階段，并逐漸成為治療絕 經后婦女乳腺癌的一線藥物，如來曲挫，依西美坦等。
[0003] 對芳香化酶抑制劑結構改造和從天然產物中篩選芳香化酶抑制劑的工作是新藥 開發的研究熱點，但由于種種原因，目前已有的篩選模型已不能滿足國內外新藥開發產業 對于高通量的芳香化酶的活性篩選方法的需求。目前篩選芳香化酶抑制劑的模型主要有兩 種:一種是細胞株培養法，另一種是W胎盤的微粒體作為芳香化酶的酶源，檢測手段為放射 性標記法或者利用試劑盒檢測反應中產生的雌酬濃度，W此測定芳香化酶抑制劑的活性。 專利CN 103149186 B發明了一種利用均相時間分辨巧光技術實現對芳香化酶抑制活性進 行高通量篩選。W胎盤的微粒體中存在的游離芳香化酶為篩選模型存在W下明顯缺陷：（1) 酶源來之不易，每次篩選試驗均需要尋找新鮮人體胎盤來制備微粒體作為芳香化酶的酶 源，原材料獲取存在醫學倫理問題；（2)經人體胎盤提取的微粒體是多種激素轉化酶的混合 物，多種酶會相互競爭催化底物轉化為不同產物，而且每次提取得到的混合物種芳香化酶 活力均有差異，無法有效評價待篩選藥物；（5)反應后的酶與產物分離困難，無法回收再利 用。
[0004] 上述游離芳香化酶的缺點成為了芳香化酶抑制劑篩選的瓶頸，而固定化酶技術與 游離酶相比，具有許多優點：（1)極易與底物、產物分離；（2)可W在較長時間內進行反復使 用，成本降低；（3)能夠提高酶的穩定性等。酶的固定化方法有吸附法、共價鍵合法、交聯法 和包埋法。但是由于酶的個體差異，并沒有一種普適的固定化技術適用于所有的酶，截止到 目前還沒有一種芳香化酶的固定化技術公布于世，而芳香化酶作為一個非常重要的乳腺癌 治療祀點，將其固定化后可W構建新型的芳香化酶抑制劑的快速篩選技術平臺，為新藥開 發提供有力的工具。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種非常簡便有效的方法固定化芳香化酶。本發明的方法是 通過環氧基功能化修飾的介孔娃球利用吸附法固定芳香化酶。
[0006] 本發明的固定化芳香化酶的制備方法，包括W下步驟：
[0007] (a)球形介孔娃球用稀鹽酸活化即得固體介質A，其中鹽酸濃度為5%~10%。
[0008] (b)制備環氧基修飾的介孔娃球為固體介質B。
[0009] (C)芳香化酶用憐酸鐘緩沖液稀釋為液體介質C，其中酶濃度為lOpmol/mL~ 40pmol/mL。
[0010] (d)將固體介質B用憐酸鐘緩沖液洗涂S次后，與液體介質C混合，低溫下旋轉震搖 SOminW上，離屯、除去上清液，沉淀經低溫離屯、洗涂后即得固定化酶。
[0011] 所述步驟(d)中，固體介質B的質量:液體介質C的體積優選為lmg:50化，更優選為 Img:IOOuL。
[0012] 所述液體介質C為水溶液，緩沖液離子強度為50mmol/L~150mmol/L。
[0013] 本發明的技術方案中，所述芳香化酶優選來源于桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統。
[0014] 本發明的技術方案中，所述介孔娃球的粒徑為2~40WH，優選為2~lOwn，更優選為 2~如m。孔徑為50A~500A，更優選為IOOA~300A。
[0015] 本發明的技術方案中，步驟(d)中所述的固體介質B與液體介質C的混合方式為滿 旋或者旋轉震搖，若為旋轉震搖，轉速為10巧m~30巧m。
[0016] 本發明的制備方法中，將芳香化酶W分子間作用力的形式固定于載體上，運種分 子間作用力主要為范德華力、親水或疏水作用力W及靜電力。
[0017] 該發明中，所述液體介質的抑為6~8。
[0018] 在本發明的【具體實施方式】中，所述環氧功能化娃球在使用之前需要進行預處理， 預處理方法為用憐酸鹽緩沖液洗涂，所使用緩沖液的抑在6~8之間，離子強度為50mmol/L ~200mmol/L之間，具體洗涂方法不予特別限定。
[0019] 本發明的另一個目的是提供用上述方法制備的固定化芳香化酶，通過該方法所制 備的固定化酶在連續催化時顯示出了比游離酶更好的穩定性，可W重復利用，實驗證明該 固定化酶至少可重復使用5次。
[0020] 本發明的有益效果：
[0021] ①本發明的固定化酶的制備方法為吸附法，簡單有效，采用的載體為環氧基功能 化修飾的介孔娃球，廉價易得，為首次將芳香化酶固定于多孔硅膠載體上，具有很高的潛在 研究價值。
[0022] ②本發明所制備的固定化酶連續催化時穩定性較好，游離的芳香化酶在40min后 催化速率有所降低，而固定化酶在SOmin后催化速率才有所降低。并且固定化酶可W重復利 用，為潛在芳香化酶抑制劑的篩選可提供很好的平臺。
[0023] 附圖l為環氧基功能化介孔娃球化xopy-Si02)與固定化酶（Immobilizeden巧me) 的紅外光譜圖對比。
[0024] 附圖2為固定化酶催化反應完成后上清液中產物(①雌酬)與底物(②雄締二酬)分 離的高效液相色譜圖。
[0025] 附圖3環氧基功能化介孔娃球(A)與固定化酶(B)的掃描電鏡(SEM)對比圖。
[0026] 附圖4為不同濃度的酶溶液參與固定化后固定化酶的酶活力上升曲線。
[0027] 附圖5為游離酶隨反應時間增加時產物雌酬的生成效率。
[0028] 附圖6為固定化酶隨反應時間增加時產物雌酬的生成效率。
【具體實施方式】：
[0029] 下述非限制性實施例可W使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不W 任何方式限制本發明。
[0030] 實施例1
[0031 ] (1)稱取4g介孔娃球（sepax細IP-si 1 ica;扣m，300A )，加入IOOmL 10 %鹽酸，9〇°C 攬拌下回流8小時，隨后用大量去離子水清洗至中性，15(TC真空干燥。得到活化的介孔娃球 載體。
[0032] (2)稱取500mg步驟（1)所得到的活化介孔娃球分散于20mL無水甲苯中，逐滴加入 25化L 丫-縮水甘油酸氧丙基S甲氧基硅烷化H-560)，于90°C攬拌回流12h，隨后依次用甲 苯和丙酬洗涂=次，60°C真空干燥，保存于4°C，得到環氧基修飾的功能化介孔娃球巧xopy-Si〇2)。
[0033] (3) lOOmmol/L憐酸鐘緩沖液(pH7.4)的配制：稱取4.56g K2HPO4溶于200mL去離子 水為A液，稱取2.72g K出K)4溶于200mL去離子水為B液，A與BW (A: B)80.2:19.8混合即得。
[0034] (4)雄締二酬儲備液與工作液的配制:稱取2mg雄締二酬與ImL容量瓶中，用DMSO稀 釋至刻度，-20°C保存，即為2mg/血的儲備液;取扣L儲備液與95化憐酸鐘緩沖液（IOOmmol/ 1，口^.4)混合，即為10化邑/1111的雄締二酬工作液。
[0035] (5)固定化所用酶溶液的配制：將來自桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統的芳香化酶 (corning,美國）用憐酸鐘緩沖鹽（100111111〇1凡，口^.4)分別稀釋至10口1]1〇1/111]^，20口111〇1/1111^， SOpmo1/mL，40pmo1/mL。
[0036] (S)NADPH工作液的配制：稱取8.33mg的NADPH(BI0SHARP公司）加入ImL容量瓶中， 用憐酸鐘緩沖液稀釋至刻度，混勻，保存于4°C冰箱中即得。
[0037] (7)稱取5mg步驟(2)所得到的環氧基修飾的功能化介孔娃球用0.5mL憐酸鐘緩沖 液(lOOmmol/L，抑7.4)洗涂S次后，加入步驟(4)所制得的酶溶液0.5血，4°C旋轉震搖30min W上，低溫高速離屯、后，沉淀用0.5mL憐酸鐘緩沖液(100mmol/L，pH7.4)洗涂3次，測酶活力。
[0038] (8)固定化酶的活力測定方法為:在5mg步驟(6)所制得固定化酶中加入17扣L憐酸 鐘緩沖液（lOOmmol/L，pH7.4)，扣L雄締二酬工作液，滿旋混合均勻后，37°C恒溫震蕩5min 后，加入20化NADPH工作液啟動反應，反應20min，隨后4°C高速離屯、，上清液取50化進入高效 液相色譜分析。沉淀用〇.5mL憐酸鐘緩沖液(100臟〇1八，9^.4)洗