一種產雞溶菌酶的基因工程菌及其構建與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種產雞溶菌酶的基因工程菌，屬于基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 溶菌酶是一種無毒、無副作用的蛋白質，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然 的食品防腐劑。現已廣泛應用于水產品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及飲料中的防腐；還可以 添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制腸道中腐敗微生物的生存，同時直接或間接地促進腸道 中雙歧桿菌的增殖。
[0003] 溶菌酶作為一種存在于人體正常體液及組織中的非特異性免疫因素，具有多種藥 理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效，醫用溶菌酶其適應癥為出血、血尿、血痰和鼻 炎等，溶菌酶具有破壞細菌細胞壁結構的功能，以此酶處理G+細菌得到原生質體，因此，溶 菌酶是基因工程、細胞工程中細胞融合操作必不可少的工具酶。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于提供一種產雞溶菌酶的基因工程菌NCY-02,用于雞溶菌酶的生 產。本發明的基因工程菌已于2015年5月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心，保藏地址為中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo. 10780,分類學 命名為畢赤酵母（Pichiapastoris)x_33-pPICZaA-lysozyme。
[0005] 本發明的技術方案如下：一株產雞溶菌酶的酵母基因工程菌NCY-02,保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為中國科學院微生物研究所，保藏 日期為2015年5月5日，保藏號為CGMCCNo. 10780。
[0006] 本發明第二方面公開了前述產雞溶菌酶酵母基因工程菌的構建方法，包括以下步 驟：
[0007] 1)合成SEQIDN0:1所示的雞溶菌酶表達序列；
[0008] 2)將步驟1)所述雞溶菌酶表達序列連接到畢赤酵母載體pPICZa上，得到重組質 粒pPICZaA-lysozyme;
[0009] 3)將步驟2)的重組質粒pPICZaA-lysozyme轉化畢赤酵母x-33,得到產雞溶菌 酶的基因工程菌畢赤酵母x-33-pPICZaA-lysozyme。
[0010] 進一步，步驟2)中，將雞溶菌酶表達序列采用限制性內切酶xhoI和NotI進行 雙酶切，連接到同樣用xhoI和NotI雙酶切回收后的畢赤酵母載體pPICZa上，獲得重組 質粒pPICZaA-lysozyme〇
[0011] 本發明第三方面公開了前述產雞溶菌酶酵母基因工程菌在雞溶菌酶生產中的應 用。
[0012] 進一步，產雞溶菌酶酵母基因工程菌的種子培養基采用YH)培養基；基本發酵培 養基采用BMGY培養基；誘導培養基為BMMY培養基。
[0013] 本發明的有益效果是：本發明的產雞溶菌酶酵母基因工程菌表達的雞溶菌酶在 搖瓶培養后的酶活可以達到5000-7000u/ml左右，10L機械攪拌生物反應器水平上發酵酶 活可以達到20000u/ml以上。該構建菌株發酵生產雞溶菌酶取代目前從蛋清中提取的生 產方法，具有生產周期短、分離純化成本低等一系列優點，而且發酵生產過程中產生的廢 棄物一一酵母細胞有著廣泛的應用價值，這為該菌株大規模生產雞溶菌酶奠定了良好的基 礎。
【附圖說明】
[0014]圖 1:pPICZaA質粒圖譜；
[0015] 圖2:重組質粒的酶切圖譜（其中，M為DL5000DNAmarker，編號1是線性化質粒 pPICZa，編號2-7為雙酶切的重組質粒pPICZaA-lysozyme);
[0016] 圖3:質粒酶切結果（其中，M為DL5000DNAmarker,編號1是線性化質粒 pPICZa，編號 2-5 為Bglll線性化重組質粒pPICZa-lysozyme);
[0017] 圖4:重組畢赤酵母誘導表達后考馬斯亮藍染色電泳圖（其中，Ml和M2為蛋白標 準品，編號1-8為誘導表達后的重組蛋白）。
【具體實施方式】
[0018] 以下結合附圖1-4對本發明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發 明，并非用于限定本發明的范圍。
[0019]實施例1重組菌的構建及鑒定
[0020] 通過NCBI收錄的雞溶菌酶基因GenBank:J00882. 1，設計出雞溶菌酶表達序列（兩 端插入了xhol和xbal酶切位點），如SEQIDN0 :1所示，并交由上海生工生物工程股份有 限公司合成，連接于puc57載體，獲得puc57_lysozyme。
[0021]用限制性內切酶xhoI和NotI分別雙酶切puc57-lysozyme和酵母載體pPICZa， 并回收。用T4DNA連接酶于4°C過夜連接，連接產物轉化進入感受態大腸桿菌，37°C搖菌1 小時，涂布在含有博來霉素（ze〇cin，0. 25ug/ul)的LB平板上，37°C過夜培養，挑選菌落并 提質粒，最終獲得含有雞溶菌酶基因的重組表達質粒pPICZaA-lysozyme，用雙酶切進行驗 證，驗證結果如圖2所示。
[0022] 將驗證正確的重組質粒pPICZaA-lysozyme電擊轉化畢赤酵母x-33(Pichia pastorisx-33)感受態細胞，得到基因工程菌，并經過鑒定命名為畢赤酵母（Pichia pastoris)x-33-pPICZaA-lysozyme〇
[0023] 畢赤酵母的轉化采用電轉化法為：將畢赤酵母x-33于50mLYPD中培養至0D600 =1. 2,1500g離心收集細胞；依次用50mL，25ml冰冷的無菌水洗兩次細胞，再用10mL冰冷 的lmol/L山梨醇洗一次細胞，重懸細胞于100ullmol/L山梨醇液中，獲得感受態細胞。取 80yL酵母感受態細胞，與5-10yg線性化重組質粒DNA(BglII酶切）混合，轉入冰冷的電 轉杯，放置5分鐘；電擊感受態細胞與線性化DNA的混合物（2kv，15ms);加入lmL冰冷的 lmol/L山梨醇，吸入15ml離心管中，在30°C靜止放置lh;然后涂布于固體YPDS培養基，在 30°C培養4~6天后挑取單克隆，獲得產雞溶菌酶的基因工程菌株，用Bglll酶切進行驗 證，驗證結果如圖3所示。
[0024] 實施例2重組菌的誘導表達和蛋白電泳
[0025] 1.培養基的配制
[0026] YPD培養基（1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g;
[0027]YPDS固體培養基（1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g，182. 2g山梨 醇，20g瓊脂粉；
[0028]BMGY培養基（1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB13. 4g，lOOmM磷 酸緩沖液（pH6. 0)，40mg生物素；
[0029] BMMY培養基（1L):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇5mL，YNB13. 4g，lOOmM磷 酸緩沖液（pH6. 0)，40mg生物素。
[0030] 2.雞溶菌酶誘導表達方法
[0031] 以實施例1獲得的產雞溶菌酶酵母基因工程菌為生產菌株，活化后，將30°C， 220rpm下培養過夜的種子（YH)培養基）以10%的接種量轉入基本發酵培養基（BMGY培養 基），于30°C、220rpm條件下培養至0D值為1. 2~1. 5時，將酵母細胞轉入BMMY培養基中 誘導蛋白的產生。
[0032] 通過蛋白電泳（SDS-PAGE)得到一條分子量大小在lOkDa和15kDa之間的蛋白 條帶，如圖4所示（蛋白標準品商品名PageRulerPrest，廠商ThemScientific，范圍 10-110KD)，能看到在15kD之下有一條染色最深的條帶，為目的條帶。
[0033] 3.酶活
[0034] 參考GB/T25879-2010方法檢測發酵液中的酶活力，檢測結果顯示，本實施例搖瓶 培養獲得的雞溶菌酶酶活可以達到5000-7000u/ml。
[0035] 實施例3重組蛋白的發酵培養
[0036] 以實施例1獲得的溶菌酶產生菌CNY-02為生產菌株，接種于YH)培養基中，在 30°C、220rpm下培養18小時后作為種子液，按照10v/v%的接種量轉入容積為10L的機械 攪拌式生物反應器內，發酵培養基采用無機鹽培養基。發酵溫度30°C，攪拌轉速：350r/m， 通風比：0. 2VVM，起始pH值為5. 0。
[0037] 發酵培養基成分如下：
[0038]
[0039]將配置好的發酵培養基滅菌冷卻到30°C，氨水調節pH值為5. 0后接種種子液。
[0040] 發酵24小時后添加甲醇，濃度為10ml/L開始誘導溶菌酶蛋白。以后每24小時添 加一次甲醇，甲醇濃度仍為l〇ml/L。誘導96小時后發酵過程結束。
[0041]
[0042] 經GB/T25879-2010方法檢測雞溶菌酶酶活，發酵液中溶菌酶的酶活力達到 18000-20000u/ml〇
[0043] 以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一株產雞溶菌酶的酵母基因工程菌NCY-02,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，保藏地址為中國科學院微生物研究所，保藏日期為2015年5月5日，保 藏號為 CGMCC No. 10780。2. 權利要求1所述產雞溶菌酶酵母基因工程菌的構建方法，包括以下步驟： 1) 合成SEQ ID NO :1所示的雞溶菌酶表達序列； 2) 將步驟1)所述雞溶菌酶表達序列連接到畢赤酵母載體pPICZ a上，得到重組質粒 pPICZ a A-Iysozyme ； 3) 將步驟2)的重組質粒pPICZ a A-Iysozyme轉化畢赤酵母x-33,得到產雞溶菌酶的 基因工程菌畢赤酵母x-33-pPICZ a A - lysozyme。3. 如權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟2)中，將雞溶菌酶表達序列采用限 制性內切酶xho I和Not I進行雙酶切，連接到同樣用xho I和Not I雙酶切回收后的畢 赤酵母載體pPICZ a上，獲得重組質粒pPICZ a A-Iysozyme。4. 權利要求1所述產雞溶菌酶酵母基因工程菌在雞溶菌酶生產中的應用。5. 如權利要求4所述的應用，其特征在于，產雞溶菌酶酵母基因工程菌的種子培養基 采用YH)培養基；基本發酵培養基采用BMGY培養基；誘導培養基為BMMY培養基。
【專利摘要】本發明公開了一種產雞溶菌酶的基因工程菌及其建方法與應用，公開了一株產雞溶菌酶的基因工程菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2015年5月5日，保藏號為CGMCC？No.10780。本發明采用重組DNA技術將雞(Gallus？gallus)的溶菌酶(lysozyme)cDNA克隆連接到畢赤酵母表達載體pPICZαA，并轉化畢赤酵母X-33，經篩選鑒定得到一株產高活性雞溶菌酶的重組畢赤酵母x-33pPICZαA-α-lysozyme。該菌株表達的雞溶菌酶在搖瓶中的酶活為5000-7000u/ml，為雞溶菌酶的大規模生產奠定了良好的基礎。CGMCC No.05
【IPC分類】C12N9/36, C12R1/84, C12N15/81, C12N1/19
【公開號】CN105039189
【申請號】CN201510350298
【發明人】王向東, 宗臣, 林劍, 單守水
【申請人】山東新概念生物技術有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年6月23日