高效表達海腎熒光素酶基因的重組HCoV-OC43病毒及其應用
【專利說明】
[0001]技術領域本發明涉及人冠狀病毒0C43重組病毒,尤其涉及一株高效表達海腎熒光素酶基因的人冠狀病毒0C43重組病毒,本發明還涉及該0C43重組病毒在抗冠狀病毒藥物篩選實驗中的應用,屬于表達海腎熒光素酶基因的人冠狀病毒0C43重組病毒的拯救和應用領域。
[0002]【背景技術】人冠狀病毒0C43(Human coronavirus 0C43,HCoV_0C43)是目前已知的6種人冠狀病毒中的一種,該病毒最早發現于1967年美國馬里蘭州貝塞斯達市,從一名上呼吸道感染患者中分離獲得。據報道約有5%?20%的人呼吸道感染是由HCoV-0C43引起的,人感染HCoV-0C43后一般會出現上呼吸道感染的臨床特征,如鼻炎、咽炎和喉痛等,但是越來越多的實驗證明,HCoV-0C43會使免疫功能低下的人群,如嬰幼兒和老年人表現出支氣管炎、肺炎等嚴重的下呼吸道癥狀。最近,隨著研究的深入,病毒學者們還發現HCoV-0C43具有嗜神經性,在患有急性弛緩性麻痹病例患者的鼻咽拭子中檢測到了 HCoV-0C43和HCoV-229E病毒的共感染。HCoV-0C43屬于β群,同屬于該群人冠狀病毒的還有HCoV-HKUl、SARS-CoV和MERS-CoV,其中2003年爆發的SARS-CoV和2012年9月在沙特地區爆發的MERS-CoV都能夠引起嚴重的呼吸道疾病。針對這6種人冠狀病毒,特別是2種新型冠狀病毒,目前尚無特效藥和疫苗,因此構建一株能夠用于高通量篩選抗人冠狀病毒藥物的重組病毒迫在眉睫。
[0003]HCoV-0C43與其它冠狀病毒相似,是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒,基因組大小約31kb。冠狀病毒基因組RNA具有和真核生物mRNA—樣的5'端甲基化帽子結構和3'端的多聚賴氨酸尾巴。基因組RNA的5'端是一段由65至98個堿基組成的“前導序列”,緊接著“前導序列”的是一段由200-400個堿基組成的“非翻譯區” (untranslated reg1n,UTR),在基因組的3'端也有一段由300至500堿基組成的“非翻譯區”,這兩個“非翻譯區”的功能目前還不是很清楚,可能與冠狀病毒基因組包裝信號有關。冠狀病毒基因組5'端到2/3處的兩個開放閱讀框ORFla和ORFlb負責編碼16個非結構蛋白,這些非結構蛋白在病毒復制和轉錄過程中發揮了重要作用。其中nsP5是主要的蛋白酶,在眾多冠狀病毒中nsp5蛋白的單體結構均顯示出較高程度的結構保守性,這也使得設計或篩選光譜抗冠狀病毒藥物成為可能,該蛋白也是第一個用于設計針對冠狀病毒廣譜抑制劑的蛋白。此外,HCoV-0C43基因組與同屬于β群的SARS-CoV和MERS-CoV具有極高的基因組相似性,特別是在ORFlb的復制酶(nspl2)和解旋酶(nspl3)區域,這兩個蛋白同樣也成為了研究抗冠狀病毒藥物的靶點。因此,以HCoV-0C43作為冠狀病毒模型可以不依賴于BSL3實驗室,并用來研究冠狀病毒復制,病毒編碼蛋白的功能和篩選新型抗冠狀病毒藥物等。
[0004]反向遺傳操作技術的建立為研究冠狀病毒基因功能和抗病毒藥物篩選開辟了新的途徑。利用反向遺傳操作技術將外源報告基因插入病毒基因組中可以用來研究病毒的復制、病毒編碼蛋白的功能及抗病毒藥物的篩選等。例如,攜帶綠色熒光蛋白的SARS-CoV可用于影響病毒復制的宿主的篩選(de Wilde AH.et al.A Kinome-ffide Small InterferingRNA Screen Identifies Proviral and Antiviral Host Factors in Severe AcuteRespiratory Syndrome Coronavirus Replicat1n,Including Double-Stranded RNA-Activated Protein Kinase and Early Secretory Pathway Proteins.J Virol.2015,89,8318-8333.)。但是,利用綠色熒光蛋白標記的SARS-CoV篩選抗冠狀病毒因子需要在生物安全防護三級實驗室(BSL3)中進行,而且綠色熒光蛋白的檢測需要通過借助熒光顯微鏡進行判斷,而且誤差相對較大,因此在高通量篩選方面受到了限制。
【發明內容】
[0005]利用反向遺傳學技術拯救出4株表達海腎焚光素酶(Renilla luciferase,Rluc)基因的HCoVs-0C43重組病毒,其中一株重組病毒r0C43-ns2DelRluc能夠穩定和高效表達Rluc基因,并且該重組病毒能夠快速檢測冠狀病毒的復制并且適用于高通量篩選抗冠狀病毒藥物,解決了現有熒光定量技術測定病毒拷貝數操作繁瑣以至在高通量篩選方面受到限制等問題。
【附圖說明】
[0006]圖1為pBAC-0C43FL(A)、pBAC-0C43-ns2DelRluc(B)、pBAC-0C43-ns2Fus1nRluc(C)、pBAC-0C43-nsl2.9StopRluc(D)和 pBAC-0C43-nsl2.9Fus1nRluc(E)的構建示意圖;
[0007]圖2為4株重組病毒r0C43-ns2DelRluc、r0C43-ns2Fus1nRluc、r0C43-nsl2.9StopRluc 和 r0C43-nsl2.9Fus1nRluc 與親本病毒 HCoV-0C43_WT 免疫熒光鑒定結果,可見4株重組病毒均拯救成功;
[0008]圖3為4株重組病毒與親本病毒HCoV-0C43-WT的生長曲線,可見r0C43-ns2DelRluc與未本病毒生長動力學較為相似,在不同時間點病毒滴度約降低了 3倍;
[0009]圖4為4株重組病毒Rluc基因表達的動力學,可見r0C43-ns2DelRluc表達海腎熒光素酶活性最強,峰值為108( 144h);
[0010]圖5 為We stern blot檢測重組病毒 r0C43_ns2De IRluc和r0C43_ns2Fus1nRluc (A)r0C43-nsl2.9StopRluc和r0C43_nsl2.9Fus1nRluc(B)的N蛋白和Rluc蛋白的表達;
[0011]圖6為IFA測定4株重組病毒在連續傳代過程中的病毒滴度,可見4株重組病毒滴度在傳代過程中略有升高并最終趨于穩定;
[0012]圖7為測定4株重組病毒在連續傳代過程中表達的Rluc活性,可見在傳代過程中,r0C43_ns2DelRlu(^Pr0C43-nsl2.9StopRluc的Rluc基因表達活性基本沒變,而r0C43_ns2Fus1nRluc和r0C43_nsl2.9Fus1nRluc的Rluc基因表達活性在傳代過程中均有所下降。
[0013]圖8為4株重組病毒在傳代過程中插入Rluc基因穩定性測序實驗,可見重組病毒r0C43-nsl2.9StopRluc 穩定性最強,其次是 r0C43_ns2DelRluc,而 r0C43_ns2Fus1nRluc 和r0C43-nsl2.9Fus1nRluc插入外源基因穩定性最差,分別在P4代和P6代即可檢測到堿基突變;
[0014]圖9為已報道HCoVs_0C43抗病毒藥物氯喹(Chloroquine)對重組病毒r0C43_nS2DelRluc和其親本病毒HCoV-0C43-WT復制的影響,可見隨著氯喹濃度的增加,能顯著抑制兩種病毒的復制;
[0015]圖10為Western blot檢測不同濃度氯喹對親本病毒HCoV-0C43_WT蛋白表達量的影響,可見隨著氯喹濃度的增加,親本病毒N蛋白合成量顯著下降;
[0016]圖11為氯喹對重組病毒抑?111(3報告基因表達量的影響,可見隨著氯喹濃度的增加,rOC43-ns2DelRluc報告基因的表達量顯著下降。
[0017]圖12為抗病毒藥物病毒唑(Ribavirin)對重組病毒r0C43-ns2DelRluc和其親本病毒HCo V-0C43-WT復制的影響;可見隨著病毒唑濃度的增加,雖然能抑制兩種病毒的復制,但是需要較高的藥物濃度;
[0018]圖13為Western blot檢測不同濃度病毒唑對親本病毒HCoV-0C43_WT蛋白表達量的影響,可見隨著病毒唑濃度的增加(>10μΜ),親本病毒N蛋白合成量隨之下降;
[0019]圖14為病毒唑對重組病毒r0C43-nS2DelRluc報告基因表達量的影響,可見隨著病毒唑濃度的增加,r0C43-ns2