一種催化甲醇制備異戊二烯的大腸桿菌基因工程菌及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種催化甲醇制備異戊二締的大腸桿菌基因工程菌及其制備方法與 應用，屬于基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 中國是世界甲醇大國，產能超過世界的50%,2014年國內產能超過6000萬噸， 2015年預計會超過6500萬噸。根據國際經驗，產能利用率保持在81 %~82%之間是衡量 工業產能是否過剩的臨界點。從近年來國內甲醇行業平均開工率數據來看，我國甲醇開工 率一直在60%W下，2013年甲醇平均開工率為57. 13%，處于嚴重過剩的狀態。國內甲醇 產能過剩，加上進口甲醇價格較低，致使國內甲醇的價格持續下降，2014年維持在1500~ 2000元/噸左右。
[0003] 甲醇精細化工產品的生產，能夠有效應對甲醇生產過剩的局面，對于我國甲醇工 業行業的發展和市場的深化拓展有著重要意義。下游產品比之甲醇有更多的發展空間，能 夠生產出更多的分支產品，而且下游產品在環保和節能方面與甲醇相比更具優勢，更符合 世界工業的新理念。基于W上優點，大力研發甲醇下游產品，生產高附加值的精細化工產品 是甲醇類產品發展的大趨勢。
[0004] 甲醇的下游產品開發可W通過化學轉化和生物轉化另種方法實現。化學轉化途 徑，研究較多的是W甲醇為原料制取締控、二甲酸、乙酸和甲醒等附加值較低的物質。化學 轉化離不開貴金屬催化劑，提高了生產升本。同時，催化劑的選擇性和原料的轉化率較低、 副產物較多、污染嚴重等問題的存在嚴重制約了產業的發展。相比較而言，生物方法污染 小、成本較低、可W實現原料的高效轉化。 陽〇化]甲醇的生物轉化利用處于探索階段。W甲醇為碳源，通過微生物轉化可W獲得一 些附加值較高的發酵產物。Eugenio實現了W甲醇為碳源，利用工程Pichiapastoris合 成乙肝病毒表面抗原。Pichiapastoris在Pichiapastoris體內過表達編碼婢蟲蛋白的 基因后，可W利用甲醇合成婢蟲疫苗。S化art等在Pichiapastoris細胞內過表達水賠素 合成基因，發酵4天得到1.5g/L水賠素。張元興等采用甲醇甘油混合流加的方法使重組畢 赤酵母細胞干重達到162g/l，最終得到1. 7g/L的水賠素；還對發酵液的脫色和水賠素的分 離進行了探討。一些科研工作者開展了甲醇單細胞蛋白的研究，發現利用甲醇作原料，通過 微生物發酵法生產的單細胞蛋白含有豐富的氨基酸，可W作為安全的飼料添加劑。已有的 關于甲醇生物利用的研究，主要通過甲基營養型菌株的簡單培養來驗證少數幾種產品的生 產。總的來說，研究基礎比較薄弱，存在諸多亟待解決的問題。
[0006] 異戊二締是戰略資源性化工原料，供需不平衡。異戊二締產量的95%用于合成橡 膠，此外，也可應用于高品質航空燃料等領域。目前制作輪胎的主要原料是天然橡膠和合成 橡膠（聚異戊橡膠）。聚異戊橡膠因其分子結構及物化性質與天然橡膠相近，是替代天然 橡膠制造橡膠輪胎的理想原料。隨著我國汽車行業的快速發展，W及我國天然橡膠原料日 益短缺，對異戊二締的需求量不斷增加，預計2010年國內異戊二締需求量將達10. 54萬噸， 2013年增長到31. 04萬噸，年增速46%左右，然而，我國異戊二締產量不足，需要大量進口， 價格不斷攀升，成為制約我國相關產業發展和戰略安全的重要原料。
[0007] 目前，工業上主要是通過化學法從石油基原料中制備異戊二締。全球異戊二締主 要生產國家或地區主要分布在歐美地區。俄羅斯是異戊二締生產大國，產量約占全球29 %， 美國約占18%、日本約占15%。其次為己西、西歐、加拿大等。俄羅斯等國從戰略上考慮， 限制異戊二締生產技術對我國的出口，而我國異戊二締天然資源匿乏，化學法規模化異戊 二締生產技術在產品成本、純度等方面尚不成熟，制約著相關產業的發展，自主研發異戊二 締合成技術迫在眉睫。隨著化石資源的日益枯竭和價格的不斷攀升，拓寬原料來源，利用生 物技術制備異戊二締已成為國際上戰略高技術的必爭之地。已經報道利用葡萄糖為碳源合 成異戊二締，其產量和產率較低，同時葡萄糖市場價格高于甲醇且波動較大。

【發明內容】

[0008] 為解決W上問題，本發明提供了一種催化甲醇制備異戊二締的大腸桿菌基因工程 菌的制備方法，所采取的技術方案如下：
[0009] 本發明的目的在于提供一種催化甲醇制備異戊二締的大腸桿菌基因工程菌，該大 腸桿菌基因工程菌是過表達甲醇脫氨酶基因MDH，6-憐酸己酬糖合成酶基因RmpA，6-憐 酸-3-己酬糖異構酶基因Rm地和甲醇脫氨酶激活蛋白基因ACT。
[0010] 優選地，所述甲醇脫氨酶基因MDH，來源于甲基營養型芽抱桿菌度acillus methanoli州S)，基因登錄號GI:662720579 ;所述6-憐酸己酬糖合成酶基因RmpA，來源于 甲基營養型芽抱桿菌，基因登錄號GI:40074227 ;所述6-憐酸-3-己酬糖異構酶基因Rm地， 來源于甲基營養型芽抱桿菌，基因登錄號GI:40074228 ;所述甲醇脫氨酶激活蛋白基因 ACT,來源于甲基營養型芽抱桿菌，基因登錄號GI:22654851。
[0011] 優選地，還過表達合成異戊二締的相關基因，具體為脫氧木酬糖5-憐酸合成酶基 因dxr，脫氧木酬糖5-憐酸還原酶dxr，異戊締基焦憐酸異構酶idi和異戊二締合成酶基因 Ispso
[0012] 本發明的另一目的是提供一種所述大腸桿菌基因工程菌的構建方法，該方法的步 驟如下：
[0013] 1)克隆或合成獲得甲醇脫氨酶基因MDH，6-憐酸己酬糖合成酶基因RmpA，6-憐 酸-3-己酬糖異構酶基因Rm地和甲醇脫氨酶激活蛋白基因ACT,并將所得基因與質粒 PBAD18酶切回收，目的片段和載體；
[0014] 2)將步驟1)所得的載體和目的片段按照等摩爾比混合后利用連接酶連接，并轉 入感受態細胞中，篩選陽性克隆；
[0015] 3)培養步驟2)所得的陽性克隆，并提取質粒將步驟1)所述的四個基因連接在質 粒地AD18上，獲得重組質粒地AD18-MDH-RmpA-Rm地-ACT;
[0016] 4)構建具有異戊二締合成途徑的重組質粒，并將所得的重組質粒與步驟3)所得 的重組質粒地AD18-MDH-RmpA-Rm地-ACT,-同轉化到大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)中，獲得 大腸桿菌基因工程菌。
[0017] 優選地，步驟1)所述甲醇脫氨酶基因MDH，來源于甲基營養型芽抱桿菌度acillus methanoli州s)，基因登錄號GI:662720579 ;所述6-憐酸己酬糖合成酶基因RmpA，來源于 甲基營養型芽抱桿菌，基因登錄號GI:40074227 ;所述6-憐酸-3-己酬糖異構酶基因Rm地， 來源于甲基營養型芽抱桿菌，基因登錄號GI:40074228 ;所述甲醇脫氨酶激活蛋白基因 ACT,來源于甲基營養型芽抱桿菌，基因登錄號GI:22654851。 陽0化]優選地，步驟。所述連接酶為T4DNA連接酶，連接時間為6~12小時；所述感受 態細胞，為經過熱激轉化的E.coliD冊α感受態細胞；所述篩選，是利用涂布氯霉素或卡那 霉素抗性平板過夜培養，PCR篩選。
[0019] 優選地，步驟4)所述具有異戊二締合成途徑的重組質粒，包含脫氧木酬糖5-憐酸 合成酶基因dxr，脫氧木酬糖5-憐酸還原酶dxr，異戊締基焦憐酸異構酶idi和異戊二締合 成酶基因Isps。
[0020] 所述任一大腸桿菌基因工程菌在生產異戊二締中的應用也在本發明的保護范圍 之內。
[0021] 所述應用的步驟如下：
[0022] 1)活化大腸桿菌基因工程菌，獲得種子液；
[002引。將步驟1)所得的種子液，與含有卡那霉素和氯霉素的培養基，按照種子液：培 養基=1~2:100~130的比例接種后培養至ODe。。在1. 8~2,離屯、獲得菌體；
[0024] 3)向步驟2)所得的菌體重懸后加入新鮮培養基中，并加入誘導劑IPTG和阿拉伯 糖至終濃度分別為