專利名稱：防病增產基因工程菌熒光93及研制方法
技術領域：
本發明是關于防病增產基因工程菌熒光93及其研制方法，特別是關于假單胞菌屬(Pseudomonas)，熒光假單胞菌種(P.fluorescens Migula)，菌株名熒光93及其研制方法。
近年來，我國廣大麥區，尤其是北方冬、春麥區土傳病害發生十分普遍，危害逐年加重，已成為威脅小麥生產的一個重要因素。自山東、寧夏、和甘肅采集引起小麥根病和白穗癥狀的病害標樣5432份，分離得到全蝕病菌、紋枯病菌、根腐病菌和鐮刀菌等3676株，其中全蝕病菌占69.6%。小麥全蝕病是一種典型的毀滅性土傳病害，發生后一般可減產20-30%，嚴重為害減產50%以上以至絕收。據報道，這一病害現已蔓延到我國近20個省(區)，尤以山東、甘肅、寧夏、內蒙等省(區)為害嚴重。1987年寧夏引黃灌區42%的小麥發生全蝕病，損失小麥1億多斤。1988年山東81個縣(市)發病，面積近640萬畝，損失巨大。
由于土傳病害種類多、發病周期長、傳播途徑廣泛，現有化學防治等措施往往難以奏效，加上缺乏抗病品種，更為病害的控制帶來極大的困難。必須積極研究新的防治方法，探索新的防治途徑。
70年代以來，現代生物科學與生物技術的發展促進了生物防治基礎與應用研究的不斷深入。利用有益微生物防治土傳病害已成為一個十分活躍，并開始顯示良好應用前景的研究領域。在各類有益微生物中，熒光假單胞菌(主要是Pseudomonas fluorescens，P.putida等)因其同植物密切的關系、對根圍環境高度的適應性、獨特的防病增產作用、以及便于用現代生物技術進行遺傳操作等引起了研究者極大的興趣。近年國外在病菌與益菌生物學研究的基礎上，致力于試用熒光假單胞菌防治小麥全蝕病、水稻紋枯病、棉苗立枯病等多種土傳病害，同時也十分重視此種益菌的生化和分子遺傳研究。
本發明的目的之一是創建基因工程菌株，為小麥全蝕病等作物土傳病害的防治和增產開辟一條新途徑。
本發明的目的之二是應用轉座子誘變等現代生物技術創造一種微生物育種新方法。
本發明的目的之三是開發新的抗病增產基因資源，為用生物工程技術培育抗病作物品種和防病增產微生物育種提供目的基因。
本發明其它目的和任務將通過以下具體描述進一步說明。
本發明的特征在于創建了一株基因工程細菌，分類上屬于假單胞菌屬(Pse-udomonas)、熒光假單胞菌種(P.fluorescens)，菌株名熒光93。
本發明菌株的主要形態和生理生化特征是桿菌，直或稍彎曲，有多根極鞭，革蘭氏染色陰性，不產生芽孢。在KB培養基上產生熒光色素，在4-30℃均能生長，在37℃或41℃均不能生長。在pH4.5或以下均不能生長，適宜pH為5.5-8.5。氧化酶反應陽性，明膠液化陽性，硝酸鹽還原陽性，脫氮作用陽性，奎尼酸鹽陽性，山梨醇陽性，肌醇陽性，果聚糖陽性，蔗糖陽性，甜菜堿陽性，頡氨酸陽性，β-丙氨酸陽性，L-乳酸鹽陽性，甘露醇陰性，D-酒石酸鹽陰性，L-酒石酸鹽陰性，苯甲酸鹽陰性，鄰氨基苯甲酸陰性，阿東糖醇陰性。
本發明的菌株研制方法如下首先從小麥全蝕病(Gaeumannomyces graminis(Sacc.)Arx & Olivier var.tritici Walker，又稱白穗病，根腐病)發生嚴重的病田中取出生長正常的小麥植株，將小麥根部用流水洗凈，用常規的組織分離方法結合KB或NBY選擇性培養基通過稀釋分離培養得到熒光假單胞菌，培養溫度為26℃，pH為7.0-7.5。在此KB培養基見King，E.O.，Ward，M.K.，and Raney，D.E.1954.Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.J.Lab.Clin.Med.44301-307.NBY培養基見Vidaver，A.K.1967.Synthetic and complex media for the rapid detection of fluorescence of phytopathogenic pseudomonadsEffects of the carbon source.Appl.Microbiol.151523-1524.以上二篇文獻通過參考引入本文。將分離得到的熒光假單胞菌進行轉座子誘變，篩選獲得基因工程菌株熒光93。
本發明的熒光93具有在小麥根部和葉部的定殖和上下轉移能力，即用熒光93處理小麥種子后細菌能在小麥根部定殖并向上轉移到莖和葉部，在葉部施用后能在葉部定殖并向下轉移到根系，因此該菌株在生產中應用時可以采用浸種、拌種等種子處理、土壤處理、地上部噴霧等方法。熒光93同作物關系密切，親和性好，具有刺激和促進作物生長發育、提高作物產量的能力，特別是對小麥全蝕病有顯著防治效果，對水稻紋枯病、小麥紋枯病、棉花立枯病、棉花黑根腐病等多種作物土傳病菌也有顯著拮抗作用。
本發明的菌種根據中國專利法的規定，在申請日之前已經進行了保藏，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號是CGMCC 0169。
在此，申請人聲明，本專業普通技術人員依據本發明所公開的內容可以作出許多變化和改變，但均應理解為在本發明的范圍內。以下通過實施例來進一步說明本發明。請注意，實施例僅用于說明本發明，但并不能限制本發明的權利要求范圍。
例1.防病增產自然菌株的分離和純化從寧夏回族自治區賀蘭縣春小麥全蝕病發生嚴重的病田中取生長正常的小麥植株，將其根部洗凈后晾干。在超凈工作臺內將小麥根用0.1%升汞表面消毒或不經過表面消毒，滅菌水沖洗5次，切取4毫米左右的根段，用滅菌的玻棒將根組織研碎，在研缽中加約1毫升滅菌水或NBY液體培養基，充分混勻后靜置15-30分鐘，使根組織中的細菌流入水中而成懸浮液。懸浮液經系列稀釋后在稀釋倍數為10、102、103的試管中用微量取樣器吸取0.1毫升移入KB或NBY選擇性培養基中。在26-28℃培養2-3天后挑取單菌落。用移植環在KB平板上劃線培養再次獲得單菌落，即為純培養物。純培養物經過形態特征鑒定、對小麥全蝕病菌的離體拮抗作用測定以及溫室防病增產效果試驗后篩選獲得對小麥全蝕病有良好防病增產效果的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens Migula)自然菌株，株號為CN12(見表1)。
例2 防病增產基因工程細菌的構建和應用通過細菌的接合轉移(Conjugation)，將轉座子Tn5轉移并插入到例1中熒光假單胞菌自然菌株CN12的基因組中，篩選獲得防病增產效果顯著提高的基因工程菌株熒光93(見表1-2)。基主要過程如下以含自殺性質粒pSUP2021的大腸桿菌S17-1為轉座Tn5供體，熒光假單胞菌CN12為受體。當供體和受體生長到對數晚期時取等量細胞(1∶1，V/V)在LB培養基上進行平板接合交配，22℃2小時。菌體經系列稀釋后轉移到含Rif和Km的選擇性培養基上篩選接合子，同時分別取等量供體和受體細胞測量自發突變率，重復5次。接合子經單胞分離純化后在NBY培養基上繁殖并進行抗生素耐性測驗，其中兼抗Km和Rif，但對Ap和Cm敏感的接合子視為Tn5突變體。在此請參見附

圖1。在Tn5誘變試驗中，共獲得突變體5100個，以受體細胞計算，Tn5的轉移頻率為1.2×10-7。對Tn5誘變株再次進行單孢分離純化后，在PDA(馬鈴薯250克，葡萄糖10克，瓊脂15克，蒸餾水1000毫升)平板上測驗對小麥全蝕病菌的拮抗作用，在溫室和田間自然條件測驗對小麥全蝕病的防病增產效果，獲得基因工程菌株，菌株名熒光93，株號D93。與親本菌自然菌株CN12相比，熒光93對小麥全蝕病菌的拮抗作用提高1-2倍，對小麥全蝕病的田間防治效果提高72.8%，防病增產率提高1.2倍(見表3)。在無病條件下，熒光93使小麥產量增產26.4%(見表4)。
表1是熒光假單胞菌CN12及其Tn5誘變株對小麥全蝕病的溫室防治效果。
表2是熒光93對小麥全蝕病的防治效果。
表3為基因工程菌熒光93與自然菌株CN12對小麥全蝕病的田間防病增產效果的比較。
表4是熒光93對小麥的防病和增產效果。
圖1為熒光假單胞菌轉座子Tn5誘變程序。
表1 熒光假單胞菌CN12及其Tn5誘變株對小麥全蝕病的溫室防治效果處理 株高(mm) 地下部干重(mg/株) 發病級別(0-5)Ggt對照 193 d D 87.3 e E 3.53 a AGgt+CN12 226 c C 110.9 d D 3.03 b BGgt+2942 260.2 b B 166.5 c C 2.5 c CGgt+727 261 b B 166.8 c BC 2.37 cd CGgt+1533 263 b B 168.5 b B 2.13 d C無Ggt，無 281 a A 206.8 a A 0 e D細菌表2 熒光93對小麥全蝕病的防治效果病菌接種 菌劑處理 死株和白穗率% 病指 產量(mg/盆Ggt - 100 91.67 638.5Ggt 浸種 0 31.67 2439.8- 浸種 0 0 2857.0Ggt 土壤 0 30.00 2733.3- - 0 0 2260.5病土 - 100 88.33 686.2病土 浸種 0 33.33 2576.2- - 0 0 2238.4Ggt為人工接種全蝕病菌，設4次重復;病土為寧夏自然病土，設5次重復。
表3 基因工程菌熒光93與自然菌株CN12對小麥全蝕病防病增產效果的比較處理 白穗率% 防效% 實產(kg/區) 增產%CK 24.94 - 5.655 -CN12 15.32 38.6 6.350 12.3D93 8.31 66.7 7.195 27.2試驗設2塊田6次重復，小區面積10平方米。白穗數每小區逐行調查，產量按小區單收單打。
表4 熒光93對小麥的防病和增產效果人工接種 D93菌株 病指 產量 較發病對 較無病對Ggt 處理 (mg/盆) 照增產% 照增產%- 種子 0 2857.0±52.50 347.5 26.4+ 土壤 30.00 2733.3±76.40 328.1 20.9+ 種子 31.67 2439.8±53.55 282.1 7.9- - 0 2260.5±39.13 254.0+ - 91.67 638.50±99.71 - 71.8
權利要求
1.本發明的特征在于構建了一株基因工程細菌，分類上屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)，熒光假單胞菌種(P.fluorescens Migula)，菌株名熒光93。
2.如權利要求1所述的菌種，其特征在于所述菌種是從小麥上發現的。
3.如權利要求1所述的菌種，其特征在于所述菌種是從小麥根部分離的。
4.如權利要求1所述的菌種，其特征在于所述菌種是經過轉座子誘變改造的。
5.一種生產如權利要求1所述菌種的方法，包括如下步驟a將小麥根部用流水洗凈;b用常規的組織分離法結合KB或NBY選擇性培養基分離獲得熒光假單胞菌;c、對菌株進行轉子Tn5誘變，篩選獲得菌株熒光93。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于該小麥為嚴重發病田中生長正常的小麥植株。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于該分離方法選用KB、NBY等選擇性培養基。
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于該育種方法是以自殺質粒為供體、以熒光假單胞菌為受體進行轉座子誘變育種。
9.如權利要求1所述的菌種，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為CGMCC 0169。
全文摘要
本發明利用轉座子Tn5誘變技術對熒光假單胞菌進行遺傳改良。得到一株純的基因工程細菌，分類上屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)、熒光假單胞菌種(P.fluoresccns Migula)，菌株名熒光93。對小麥有明顯促進生長和增產作用，對小麥全蝕病(Gaeumannomyces graminis var.tritici)具有顯著防病增產效果，對水稻紋枯病、小麥紋枯病、棉花立枯病和棉花黑根腐病等土傳根病也有顯著拮抗作用。
文檔編號C12N1/21GK1058230SQ91105260
公開日1992年1月29日 申請日期1991年8月3日 優先權日1991年8月3日
發明者彭于發, 張中鴿, 黃大昉, 陳彩層, 張 杰, 陳善銘 申請人:中國農業科學院植物保護研究所