專利名稱：電激基因轉移裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種將生物大分子轉移到細胞，尤其是可作DNA分子轉移和細胞融合的高壓系統。
把外源基因導入到植物細胞，是植物生物工程的關鍵技術之一。在短短的十多年中，已發展了多種技術。但電激法是目前最實用和廣泛應用的少數幾種重要技術之一。它的原理是把細胞置于高壓電場中，使細胞膜發生電介質可逆擊穿而形成微孔，讓外源基因通過微孔進入細胞。美國T.K.Wang于1981年首次把電激技術應用于動物細胞，并于1987年研制成功先進的Beakon-2000型電激儀(由美國Beakon公司生產)。由于Beakon-2000采用單管變壓器升壓電路，只能輸出短脈沖。因此它只能用于動物細胞或植物原生質體的轉移。同時，Beakon-2000的參數采用脈沖發放時間，實際使用時，需根據幾個參數用公式計算出脈沖休止時間，不但麻煩，且當改變脈沖數目和脈沖時間時，脈沖休止時間難以在各實驗中保持一致。
本發明的目的是研制一個操作參數可調的、可連續進行非接觸放電的生物大分子轉移和細胞融合系統。
為了實現以上目的，本發明采用以下幾部分組成電激基因轉移裝置開關穩壓電源、采用邏輯電路組成的具有脈沖休止時間控制器的脈沖發生器、推挽式高壓形成電路、電激小室。具體框圖如

圖1所示，其中1為脈沖發生器，采用邏輯電路設計，具有脈沖休止時間控制器;2為推挽式高壓形成電路;3為開關穩壓電源;為已有技術;4為電激小室。
圖2為電激小室的結構示圖，其中5為電極，6為樣品杯，7為接地金屬球。
圖3為脈沖發生器的電路結構圖，具體描述如下由非門11、12組成的雙穩態觸發器構成防抖動電路，其第1、4輸入端分別連接觸發開關K1的兩個固定接頭，并通過電阻R1、R2接電源VDD，觸發開關K1的活動接頭接地，與非門12的輸出端6通過電容C和R3構成的微分電路進入與非門13的第1輸入端，與非門13的輸出端連接與非門17的兩個輸入端，17的輸出端經二極管D1的正極進入與非門18的第1輸入端，18的輸出端連接由與非門19、20構成的雙穩電路中19的第1輸入端，19的輸出端和與非門21的第2輸入端相連，21的第1輸入端與開關K2的活動接頭相連接，21的輸出端A接推挽式高壓形成電路的輸入端B;由與非門14、15組成雙穩態觸發器，與非門15的第1輸入端與18的第2輸入端、與非門29的輸出端相連接，15的第2輸入端和與非門24的第2輸入端相連，15的輸出端與工作指示電路16、與非門13的第2輸入端和周期數計數器28的清零腳1相連接;14的第2輸入端與17的二輸入端相通;晶體振蕩器22產生脈沖寬度為61μs、占空比為1/2的方波脈沖，它的輸出端與24的第1輸入端和開關K2的一個固定接頭相通，24的輸出端和與非門25的第1輸入端相連，25的第2輸入端和與非門19的第2輸入端相連;23為可變頻率振蕩器，輸出脈沖寬度為1μs～200μs、占空比為1/2的方波脈沖，其輸出端接開關K2的固定接頭2;脈沖休止時間計數器26的正脈輸出端1經二極管D2的正極至與非門18的第1輸入端，脈沖休止時間計數器26的計數輸入端2接25的輸出端，清零端3連接與非門19的輸出端;每周期脈沖數計數器27的計數輸入端3接與非門21的輸出端，清零端1接與非門20的輸出端及周期數計數器28的計數輸入端2，負脈沖輸出端2接與非門20的第2輸入端;周期數計數器28的兩負脈沖輸出端3、4分別與29的二個輸入端相連。
圖4為推挽式高壓形成電路的電路結構圖，它采用場效應管作為推挽輸出，輸出變壓器B1的初級二端分別接場效應管T1的D極、T2的S極，B1中間抽頭接電源Vcc，T1的S極、T2的D極共同接地，T1、T2各自的D、S極間分別接有雙向保護器;輸入電路從B點輸入后分兩路，一路接經電容C1、電阻R4后接場效應管T1的G極，另一路先經與非門30進行倒相，再經過電容C2、電阻R5接T2的G極，R4與C1、R5與C2的連接處分別接上二極管D3、D4的負極，正極共同接地;T1、T2的G極分別接一電阻R6、R7后落地;B1的次級分二種接法，一種接橋式整流D5～8，由C、D輸出長脈沖，一種以D9作半波整流，E、F輸出短脈沖。
整個電路的工作原理是1.初始狀態(K1打到1)時，初始化電路(已知技術)使15輸出高電位，使13打開，輸出低電平，同時28清零，工作指示電路16的指示燈熄滅;14輸出低電位，使24關閉;19輸出低電位，使21關閉;20輸出高電位，使27清零，25打開。
2.觸發過程和脈沖發放期按下觸發開關K1(打到2處)后，11、12組成的雙穩態電路發生翻轉，經微分電路輸出一正脈沖至13，因此時15輸出高電位，故此正脈沖經13反相后輸出負脈沖至17和14，14、15組成的雙穩態電路發生翻轉，15輸出低電位，使工作指示電路16的指示燈發亮，同時使13關閉。這樣可防止在工作期間亂按觸發開關對儀器造成的干擾。觸發信號從13至17，反相成為正脈沖輸入18的第1輸入端，18的第2輸入端為高電位，故18的輸出端輸出一負脈沖觸發19、20所組成的雙穩態電路，19、20發生翻轉，19輸出高電位使26清零，同時打開21;此時，從開關K2來的信號(61μs或1～200μs脈沖串)從21輸出至高壓形成電路和27，27開始計數，在達到所予置脈沖數后，分兩處進行說明對于高壓形成電路，它收到控制部分來的方波信號分二路，一路經箝位(低電位箝位)后輸至推挽電路，另一路經反相后輸至推挽電路。調節開關穩壓電源的電壓，可控制輸出電壓高低，輸出電壓經B1升壓后，半波整流后在E、F端為短脈沖，橋式整流后在C、D端為長脈沖輸出;對于每周期脈沖數計數器27來說，此時輸出負脈沖使19、20發生翻轉，19輸出低電位，關閉21，此時無脈沖輸至高壓形成電路，整個電路進入脈沖休止期，20輸出高電位，使27清零，28開始計算周期數，同時25打開，26開始計算脈沖休止時間數。
3.脈沖休止期20輸出高電位，25打開，14在整個電路工作期間內一直處于高電位，所以24是開的，25打開后，從22來的61μs脈沖經24、25后輸入26，26開始計數。在達到所予置的脈沖數(儀器面板上所標時間值)后，26輸出一正脈沖。此脈沖加至18的輸入端，在18輸出一負脈沖，使19、20發生翻轉，19輸出高電位，打開21，此時，第二周期的脈沖發放期開始，21輸出第二周期的脈沖至高壓形成電路和27。周而復始。
4.周期計數在每一周期內脈沖數達到設定值后，19、20組成的雙穩態電路發生翻轉，20呈高電位，此電位使28計數，在達到所予置周期數后，29輸出一負脈沖使14、15翻轉，15輸出高電位，關掉工作指示電路16的指示燈，同時打開13，28清零，儀器又回到初始狀態。
5.周期計數器置數00和99時的特殊狀態周期計數器18置數為00時，29輸出保持低電位，使18關斷，觸發脈沖不能送到19，使輸出脈沖為零。同時，15輸出高電位，使工作指示電路16的指示燈不亮。28置數為99時，28的第三腳輸出一負脈沖，使28的第4腳所輸出的脈沖不能通過29，而使周期數為無窮多次。
具體實施時，一周期脈沖數計數器27可采用集成電路CD4040，周期數計數器28可用集成電路CD4518，脈沖休止時間計數器26可用集成電路CD4040。
本發明采用多周期短脈沖輸出方式或長周期輸出方式，任意選擇，并把脈沖發放時間改為脈沖休止時間，脈沖休止時間足夠長，使細胞膜在兩次電激之間有充分的時間復原。利用本發明的裝置，不但可以把外源基因導入動物細胞和植物原生質體，而且可以把外源基因導入有壁的植物細胞，如懸浮培養植物細胞、愈傷組織、葉片和莖組織、種子胚組織等多種受體中。它可以在動物、植物、微生物的外源基因轉化和細胞融合中，得到廣泛的應用。
權利要求
1.一種電激基因轉移裝置，有開關穩壓電源、電激小室，其特征是采用邏輯電路組成的具有脈休止時間控制器的脈沖發生器和推挽式高壓形成電路。
2.一種如權利要求1所述的電激基因轉移裝置，其特征是脈沖發生器的組成為由與非門11、12組成的雙穩態觸發器構成防抖動電路，其第1、4輸入端分別連接觸發開關K1的兩個固定接頭，并通過電阻R1、R2接電源VDD，觸發開關K1的活動接頭接地，與非門12的輸出端通過電容C和R3構成的微分電路進入與非門13的第1輸入端，與非門13的輸出端連接與非門17的兩個輸入端，17的輸出端經二極管D1的正極進入與非門18的第1輸入端，18的輸出端連接由與非門19、20構成的雙穩電路中19的第1輸入端，19的輸出端和與非門21的第2輸入端相連，21的第1輸入端與開關K2的活動接頭相連接，21的輸出端A接推挽式高壓形成電路的輸入端B;由與門14、15組成雙穩態觸發器，與非門15的第1輸入端與18的第2輸入端、與非門29的輸出端相連接，15的第2輸入端和與非門24的第2輸入端相連，15的輸出端與工作指示電路16、與非門13的第2輸入端和周期數計數器28的清零腳1相連接;14的第2輸入端與17的二輸入端相通;晶體振蕩器22產生脈沖寬度為61μs、占空比為1/2的方波脈沖，它的輸出端與24的第1輸入端和開關K2的一個固定接頭1相通，24的輸出端和與非門25的第1輸入端相連，25的第2輸入端和與非門19的第2輸入端相連;23為可變頻率振蕩器，輸出脈沖寬度為1μs～200μs、占空比為1/2的方波脈沖，其輸出端接開關K2的固定接頭2;脈沖休止時間計數器26的正脈輸出端1經二極管D2的正極至與非門18的第1輸入端，脈沖休止時間計數器26的計數輸入端2接25的輸出端，清零端3連接與非門19的輸出端;每周期脈沖數計數器27的計數輸入端3接與非門21的輸出端，清零端1接與非門20的輸出端及周期數計數器28的計數輸入端2，負脈沖輸出端2接與非門20的第2輸入端;周期數計數器28的兩負脈沖輸出端3、4分別與29的二個輸入端相連。
3.一種如權利要求1、2所述的電激基因轉移裝置，其特征是高壓形成電路的組成為輸出變壓器B1的初級二端分別接場效應管T1的D極、T2的S極，B1中間抽頭接電源Vcc，T1的S極、T2的D極共同接地，T1、T2各自的D、S極間分別接有雙向保護器;輸入電路從B點輸入后分兩路，一路接經電容C1、電阻R4后接場效應管T1的G極，另一路先經與非門30進行倒相，再經過電容C2、電阻R5接T2的G極，R4與C1、R5與C2的連接處分別接二極管D3、D4的負極，正極共同下地;T1、T2的G分別按一電阻R6、R7后落地;B1的次級分二種接法，一種接橋式整流D5～8，由C、D輸出長脈沖，一種以D9作半波整流，E、T輸出短脈沖。
全文摘要
本發明涉及一種將生物大分子轉移到細胞，尤其是可作DNA分子轉移和細胞融合的高壓系統。本發明由開關穩壓電源、采用邏輯電路組成的具有脈沖休止時間控制器的脈沖發生器、推挽式高壓形成電路、電激小室四大部分組成，采用多周期短脈沖輸出方式或長周期輸出方式，操作參數可調，可連續進行非接觸性放電操作，且休止時間足夠長。使細胞在兩次電激之間有充分時間復原。利用本發明的裝置可廣泛應用于動物、植物、微生物的外源基因轉化和細胞融合。
文檔編號C12N15/02GK1058043SQ91105038
公開日1992年1月22日 申請日期1991年7月21日 優先權日1991年7月21日
發明者石和平, 李寶健 申請人:中山大學