構建的鯉凋亡基因、載體及其應用
【專利摘要】本發明涉及一種鯉凋亡基因、載體及其應用。所構建的鯉凋亡基因，從5’至3’依次由鯉MT?1啟動子、鯉Caspase?8小亞基(P10)編碼序列、鯉Caspase?8大亞基(P20)編碼序列、鯉MT?1polyA信號序列組成。本發明的所述鯉DNA疫苗載體，包括真核表達載體及插入在所述真核表達載體中的上述鯉基因的凋亡基因。本發明以鯉的MT啟動子和Caspase?8為基礎，構建誘導型凋亡基因，將其插入pEGFP?N1載體構建“自殺性”DNA疫苗載體，該凋亡基因可以響應金屬離子(例如Zn2+)等條件的誘導，表達Caspase?8誘導轉染細胞的凋亡，可應用于鯉DNA疫苗的制備，以進一步提高DNA疫苗的安全性。
【專利說明】
構建的繩調亡基因、載體及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體是設及構建的經調亡基因、載體及其應用。
【背景技術】
[0002] DNA疫苗自問世W來，就W其制備、運輸、存膽簡單并且能同時誘導體液免疫與細 胞免疫等優點成為新型疫苗研究的重要方向。但是DNA疫苗接種后持續表達，可能誘導宿主 自身免疫反應和免疫耐受，并且增加了疫苗DNA整合到宿主基因組的風險。盡管W甲病毒復 審巧為基礎的"自殺伴'DNA疫苗極大縮短了疫苗DNA在機體內的存在時間，但是此類疫苗載 體也存在一些缺點：（1)甲病毒復制子片段過大(〉化b)，加上質粒復制及篩選、報告基因等 必要元件，疫苗載體超過1化b，影響了載體容量，并且由于插入外源基因后的DNA疫苗過大， 也增加了疫苗的構建難度，并且影響了轉染效率。（2)調亡進程無法控制，在接種"自殺性" DNA疫苗后2~5天后，疫苗即被清除，如果能延遲調亡進程，則有可能獲得更好的免疫效果。
[0003] "自殺性"IHNV DNA疫苗的研究為新型疫苗載體構建提供了有益的啟示。IHNV是一 種嚴重危害虹縛(Oncorhynchus mykiss)等魚類的病毒，該病毒編碼6個蛋白，其中囊膜G蛋 白可W誘導產生中和抗體，也是目前商品化IHNV DNA疫苗的祀分子（IHNV DNA疫苗已于 2005年7月在加拿大獲準上市）；基質蛋白M(mat;rix protein，M)是IHNV的主要結構蛋白之 一，作為主要毒力因子，可W誘導病毒感染后的細胞調亡。Alonso等將M蛋白基因與虹縛金 屬硫蛋白酶基因（metallothionein，MT)的啟動子(pMT)結合，構建pMT-M調亡元件，將其插 入含有IHNV G蛋白基因的DNA疫苗中，構建了"自殺性"DNA疫苗。該疫苗可W在金屬離子 (例如化2+)誘導下表達M蛋白，進而誘導細胞調亡，清除了疫苗DNA。
[0004] 目前，經的DNA疫苗載體采用的是普通真核表達載體，例如pIRES-neo等，運些質粒 一般包含了在大腸桿菌中的的復制起點(ori)，抗性篩選標記(例如，氨節霉素抗性基因、新 霉素抗性基因），W及真核細胞中的啟動子(例如，pCMV啟動子)等結構。接種后外源基因持 續表達，可能誘導宿主自身免疫反應和免疫耐受，并且增加了疫苗DNA整合到宿主基因組的 風險。

【發明內容】

[0005] 基于此，本發明的目的之一是提供一種構建的經的調亡基因。
[0006] 實現上述目的的技術方案如下。
[0007] -種構建的經調亡基因，從5'至3'依次由經金屬硫蛋白酶基因 l(MT-l)啟動子、經 Caspase-8小亞基（P10)編碼序列、經Caspase-8大亞基（P20)編碼序列、經MT-lpolyA信號序 列組成。
[000引在其中一個實施例中，所述經的調亡基因，其堿基序列為如SEQ ID No. 19所示，或 其堿基序列為為SEQ ID No. 19的同義突變序列。
[0009]本發明的另一目的是提供一種DNA疫苗載體，該DNA疫苗載體，在經體內可W響應 Zn2+的誘導，誘導細胞調亡，進而清除疫苗載體。
[0010] 實現上述目的的技術方案如下。
[0011] -種經DNA疫苗載體，包括真核表達載體及插入在所述真核表達載體中的上述構 建的經調亡基因。
[0012] 在其中一個實施例中，所述真核表達載體為祀GFP-N1。
[0013] 本發明的另一目的是提供一種DNA疫苗載體的構建方法。
[0014] 實現上述目的的技術方案如下。
[0015] -種經DNA疫苗載體的構建方法，包括W下步驟：
[0016] (1)W經的組織DNA為模板，WSEQ ID N0.1和SEQ ID ^.2引物，克隆^-1全基因， 并構建MT-1質粒；
[0017] (2)^經的。0魁為模板，^沈9 10顯.3、569 10^.4引物，克隆化3口日36-8〔05， 并構建化spase-8質粒；
[001引 （3)^11'-1質粒、化39日36-8質粒為模板，分別^沈9 10側.1、和沈9 10側.5為引 物，克隆^-1的啟動子序列；^569 10^.6和569 10^.7為引物進行擴增，克隆化39日36- 8小亞基編碼序列；WSEQ ID N0.8、SEQ ID ^.9為引物進行擴增，克隆化39日3日-8大亞基編 碼序列；WSEQIDN0.10、SEQIDN0.2為引物進行擴增，克隆MTpolyA信號序列；上述擴增 產物經PCR純化后，等量加入PCR反應體系中，不加引物進行擴增，得總的擴增產物；
[0019] (4)采用SEQ ID NO. 1USEQ ID NO. 12為引物，步驟(3)中的總的擴增產物為模板， 擴增全長的融合片段；
[0020] (5)通過酶切，將純化的步驟(4)所述的全長的融合片段插入到真核表達載體中， 構建得到經DNA疫苗載體。
[0021] 本發明的另一個目的是提供上述構建的經調亡基因或的經DNA疫苗載體應用。
[0022] 具體技術方案如下。
[0023] 上述構建的經調亡基因在制備經DNA疫苗中的應用。
[0024] 上述經DNA疫苗載體在制備經DNA疫苗中的應用。
[0025] 本發明W經的MT啟動子和化spase-8(含半脫氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8)為基 礎，構建誘導型調亡基因，將其插入祀GFP-N1載體構建"自殺性"DNA疫苗載體，該調亡元件 可W響應金屬離子(例如化2+)等條件的誘導，表達化spase-8誘導轉染細胞的調亡，W進一 步提高DNA疫苗的安全性。
【附圖說明】
[0026] 圖巧"自殺伴' DNA疫苗載體的構建示意圖；
[0027] 圖2為調亡基因構成片段的PCR擴增結果示意圖，其中，M:DNA分子量標準； 啟動子；2 : Caspase-8小亞基編碼序列；3 : Caspase-8大亞基編碼序列。4 : MT-lpolyA signal。
[002引圖3為調亡基因的重疊 PCR擴增結果示意圖，M:DNAmarke;r ; 1 iMT-lpromoter、 化spase-8小亞基編碼序列、化spase-8大亞基編碼序列、MT-lpolyA si即al的融合片段。
[0029] 圖4為調亡基因的核巧酸序列。
[0030] 圖5為"自殺性"載體誘導的NGF-2細胞調亡結果示意圖。
[0031] 圖6為載體免疫后的組織分布結果示意圖，載體拷貝數值為106個宿主細胞中的檢 測值。
[0032] 圖7為Zn2+誘導20天后的載體拷貝數檢測結果示意圖，載體拷貝數值為lO6個宿主 細胞中的檢測值。
[0033] 圖8為化誘導20天后調亡基因的PCR擴增結果示意圖，其中M:DNA分子量標準；1~ 5: Zn2+誘導的錦經;6~10:未誘導的錦經;+:陽性對照(祀GFP-N1-MTCAS8作為模板）；一:陰 性對照(dd出0作為模板）。
【具體實施方式】
[0034] 下面結合【具體實施方式】和附圖對本發明作進一步詳細說明，但本發明的實施方式 不限于此。
[0035] 應理解，運些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例 中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室 手冊（New York:Cold Spring 化rbor Laboratoir Press, 1989)中所述的條件，或按照制 造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產品。
[0036] 本發明在其中一個方面，克隆了經的金屬硫蛋白酶基因1(MT-1)W及化spase-8的 完整編碼序列（complete CDS),構建了誘導型調亡基因，該基因包含：經MT-1啟動子、經 Caspase-8小亞基（P10)編碼序列、經Caspase-8大亞基（P20)編碼序列、經MT-lpolyA信號序 列。將該調亡基因插入祀GFP-N1質粒，構建了"自殺性"DNA疫苗載體。
[0037] 本發明在另一個方面，通過體內外試驗證實，該"自殺性"DNA疫苗載體可W響應 Zn2+的誘導，誘導細胞調亡，進而清除疫苗載體。
[003引實施例1
[0039] 1、材料
[0040] 經基因組DNA、cDNA、細胞株
[0041 ] 經基因組DNA提取自經腦組織；采用Trizol試劑從監419毒株細胞培養物中提取 RNA，提取的RNA作為模板，參照PrimeScHp愧)lst S化and cDNA合成試劑盒說明書反轉錄 第一鏈cDNAdNGF-2細胞由本研究室保存。錦經(20g左右)購自廣州市芳村花鳥魚蟲市場。
[0042]主要試劑
[004；3] PMD18-T 載體試劑盒、PrimeScript?n 1st Strand cDM 合成試劑盒、 巧TARK|GXL DNA聚合酶、Afl n內切酶購自IMaRa公司。hizol試劑購自Invihogen 公司。轉染試劑Instant FECT購自廣州好芝生物科技有限公司。無內毒素質粒提取試劑盒 購自天根公司。
[0044] 主要儀器
[0045] 羅氏Li曲t切cler 96巧光定量PCR儀，巧光倒置顯微鏡（ZEISS，Axio Observer Al)。
[0046] 2、實驗方法
[0047] 2.1"自殺性"DM疫苗載體的構建思路
[004引按照"誘導啟動子+調亡基因"的調亡元件構建策略，本研究W經MT-l、Caspase-8 基因為基礎構建調亡基因，具體包括：經MT-1啟動子+經Caspase-8小亞基編碼序列+經 化spase-8大亞基編碼序列+經MT-lpolyA信號序列。將構建的調亡元件插入祀GFP-N1質粒， 獲得"自殺性"DM疫苗載體，構建流程見圖1。
[0049] 2.2 經 MT-1 基因與 Caspase-8CDS 的克隆
[00加]W經的組織DNA為模板，根據MT-1基因序列（AF001983)設計了MT-1F(SEQ ID N0.1)、MT-1R(SEQ ID騰.2)引物（表6.1)，克隆^-1全基因。^經的。0論為模板，根據 化3口日36-8〔05序列化〔822471)設計了化38。1(569 10^.3)、(：日381?(沈9 10^.4)引物（表 6.1)，克隆 Caspase-8CDS。反應體系見表 6.2，反應程序：941：5111111(預變性）；941：3〇3,551： 303,721：2111111(35個循環）；721：5111111(總延伸）。？〇?產物純化后與91018-1'載體連接，轉化大 腸桿菌ToplO,具體操作參照PMD18-T載體說明書進行。PCR篩選陽性克隆送上海生工測序。
[0051]表r自殺性"疫苗載體構建中的引物
[0054]注:保護性堿基用斜體標出，酶切位點用下劃線標出，[005日]表2 PCR反應體系（50化）
[0化2]
[0化3]
[0056:
[0057]注：引物序列見表1。
[0化引 2.3。自殺性"調亡基因的重疊 PCR擴增
[0化9]首先W2.2中構建的MT-1質粒、Caspase-8質粒為模板，分別擴增經MT-1啟動子、經 Caspase-8小亞基（P10)編碼序列、經Caspase-8大亞基（P20)編碼序列、經MT-lpolyA信號序 列:反應體系參照表2，引物及反應程序：
[0060] MT-1F(沈Q ID N0.1)、MT-lPrR(SEQ ID ^.5)克隆腳'-1的啟動子序列；]\0'?巧1(^ (沈Q ID N0.6)、LinkP10R(沈Q ID顯.7)克隆化3口日36-8小亞基。10)編碼序列；1^1證？2(^ (沈Q ID N0.8)、P20R(沈Q ID顯.9)克隆0曰3口曰36-8大亞基。20)編碼序列；？2011'化。（沈9 IDN0.10)、MT-lR(SEQIDN0.2)克隆MTpolyA信號序列；反應程序為采用94°C2min(預變 性）；941：3〇3,591：9〇3,721：453(35個循環）；721：2111111(總延伸）。
[0061] 上述擴增產物經PCR純化后，等量加入50化的PCR體系中，反應體系參照表2,不加 引物及模板進行擴增，反應程序:94°C5min; 94°C30s，59°C30s，72°C2min(15個循環）。上述 擴增產物1:100稀釋后取1化作為模板，采用MTAFL2F(SEQ ID N0.11)、MTAFL2R(SEQ ID NO. 12)引物（見表1)擴增融合片段全長，反應體系參照表2,反應程序:94°C2min(預變性）； 94°C30s，60°C90s，72°C90s(35 個循環）；72°C2min(總延伸）。
[0062] 2.4"自殺性"DNA疫苗載體的構建
[0063] 將Clontech公司的pEGFP-Nl與上述調亡基因采用Afin內切酶進行酶切，酶切產 物純化后進行連接反應，將調亡基因插入祀GFP-N1構建"自殺性"DNA疫苗載體。該載體命名 為PEGFP-N1-MTCAS8,將載體轉化入大腸桿菌ToplO,通過PCR篩選陽性克隆送上海生工測 序。酶切、連接、轉化等操作按照常規方法。
[0064] 2.5 "自殺伴' DNA疫苗載體體外誘導清除試驗
[0(?日]采用無內毒素質粒提取試劑盒制備pEGFP-Nl-MTCASS質粒，將質粒與Instant 陽CT混合后轉染NGF-2細胞，同時設立祀GFP-N1對照組，具體轉染步驟參照Instant陽CT轉 染試劑說明書。轉染后觀察EGFP的表達情況，轉染1周后采用150iiM ZnCb誘導處理，誘導后 巧光顯微鏡觀察統計細胞調亡情況。
[0066] 2.6 "自殺伴' DM疫苗載體體內誘導清除試驗
[0067] 采用常規堿裂解法(Sambrook，2005)制備祀GFP-N1-MTCAS8質粒，免疫20g左右的 錦經，免疫方式為臀罐后緣基部肌肉注射免疫，免疫劑量為化g/尾，免疫2周后采集5尾錦經 的觸、腦、屯、、肝、腎、腸、脾、肌肉通過文獻報道的Taqman PCR方法，W葡萄糖激酶基因 (glucokinase gene)作為內參(Gilad et al，2004)，根據載體中的EGFP基因的拷貝數，分 析載體的組織分布(Rakus et al，2012);剩余錦經分為2組，一組采用50咖ZnS化誘導，另 一組作為對照組，在誘導后20天采集肌肉，提取組織DNA，通過上述real time PCR分析誘導 組與對照組錦經的祀GFP-N1-MTCAS8質粒拷貝數變化，同時采用MT-1 PrP 1 OF、MT-1R作為上 下游引物(見表1)，擴增"自殺性"載體調亡基因中的重構型化spase-8W及MT polyA信號序 列。
[006引表3化qman PCR引物及探針
[0069]
[0070] 注：引物及探針序列引自文獻報道(Gilad et al，2004;Rakus et al，2012)。
[0071] 3結果與分析
[0072] 3.1調亡基因的構建
[0073] 測序證實，本研究成功克隆了 MT-1全基因與化spase-8CDS。并進一步克隆了 MT-1 的啟動子、polyAf目號序列W及化spase-8的小亞基編碼序列、大亞基編碼序列（圖2)。經中 存在兩種MT基因:MT-UMT-2,其中MT-1在多種組織中對金屬離子、低溫等的誘導更加敏感。 例如水體中lOmg/L的Cu2+或As2+誘導48小時后，經屯、臟MT-lmRNA水平提高了 11~12倍，MT-2 貝1J只提高了 3倍;低溫(5°C )誘導后，經肝臟MT-lmRNA水平可W提高4~6倍，MT-2則只提高了 2~3倍;高溫誘導（26°C或29°C)幾乎不會影響兩者的mRNA水平，低溫誘導MT-lmRNA水平提 高的現象在經腦組織中也存在。經MT-1啟動子全長620bp包含4個金屬調節元件(metal regulato巧element，MRE) W及APl、Spl等轉錄因子位點，對MT-1啟動子功能進行體外研究 證實:2112+細2\加2\化2+刑2+、化 2+、(：〇2+等均可^誘導該啟動子轉錄下游的增強型綠色巧 光蛋白巧GFP)報告基因，例如1.45mM Zn2+誘導48小時后，EGFP表達水平提高了20倍W上;除 金屬離子外，該啟動子還可W響應出化的誘導，1〇〇測的此〇2誘導48小時后，EGFP表達水平提 高7.9倍。
[0074] 3.2 "自殺性"DNA疫苗載體的構建
[0075] 將經MT-1啟動子、經Caspase-8小亞基（P10)編碼序列、經Caspase-8大亞基（P20) 編碼序列、經MT-lpolyA信號序列通過重疊 PCR融合為一條1593bp的片段（圖3)。測序證實， 該調亡基因通過Afl n位點成功插入祀GFP-N1載體（圖4)。圖中，引物結合位點用箭頭標出， 引物重疊序列用陰影顯示。起始密碼子(ATG)，終止密碼子(TAA)用粗體標出。
[0076] 3.3 "自殺伴' DNA疫苗載體的體外清除
[0077] 。自殺伴'DNA疫苗載體(祀GFP-N1-MTCAS8)轉染NGF-2細胞3天后開始觀察至化GFP 蛋白表達，經化誘導后，轉染細胞進入編程性死亡(調亡）。誘導14天后，誘導組細胞極少觀 察到巧光信號，統計誘導組與對照組的綠色巧光細胞數量發現，誘導組細胞調亡率（（1-誘 導組綠色巧光細胞數量/對照組綠色巧光細胞數量）X 100% )為78.6%。
[007引3.4 "自殺伴' DNA疫苗載體的體內清除
[00巧]。自殺性"DNA疫苗載體(PEGFP-N1-MTCAS8)免疫錦經后主要分布于肌肉、屯、臟、脾 臟等組織（圖6)。免疫1周后，免疫部位(尾柄)肌肉中的載體拷貝數(每106個宿主細胞)在 5.6 X105左右，其他組織器官中的拷貝數則低于5 X103,載體主要分布于免疫部位的肌肉 中，并且主要集中在免疫部位，預實驗表明，其他部位肌肉，如背罐前端基部肌肉中的載體 濃度也較低。為確保檢測結果的準確性，本發明在采集尾柄肌肉時，選取了臀罐后緣基部與 尾罐基部之間，測線之上的錦經體側(一側）的全部肌肉，勻漿后選取1 OOmg提取DNA，Taqman PCR顯示，經Zn2+誘導后肌肉中的載體拷貝數顯著降低(P<0.05)(圖7)。由于legman PCR中擴 增的載體目的片段長度為177bp，載體降解的碎片中也可能擴增到該片段，因此本研究采用 MT-1P巧10F、MT-1R擴增祀GFP-N1-MTCAS8中一段較長的片段（996bp)，該片段是Caspase-8 和MT基因的融合片段，避免了PCR中經基因組DNA上述兩個基因的干擾。擴增結果表明，誘導 20天后，載體明顯降解(圖8)。
[0080] W上所述實施例的各技術特征可W進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實 施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要運些技術特征的組合不存 在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。
[0081] W上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來 說，在不脫離本發明構思的前提下，還可W做出若干變形和改進，運些都屬于本發明的保護 范圍。因此，本發明專利的保護范圍應W所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種構建的鯉凋亡基因，其特征在于，從5'至3'依次由鯉金屬硫蛋白酶基因1啟動 子、鯉Caspase-8小亞基編碼序列、鯉Caspase-8大亞基編碼序列、鯉MT-1 polyA信號序列組 成。2. 根據權利要求1所述鯉凋亡基因，其特征在于，其堿基序列為如SEQ ID No. 19所示， 或其堿基序列為為SEQ ID No. 19的同義突變序列。3. -種鯉DNA疫苗載體，其特征在于，包括真核表達載體及插入在所述真核表達載體中 的權利要求1或2所述的鯉凋亡基因。4. 根據權利要求3所述的鯉DNA疫苗載體，其特征在于，所述真核表達載體為pEGFP-Nl。5. 鯉DNA疫苗載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 以鯉的組織DNA為模板，以SEQ ID N0.1和SEQ ID如.2引物，克隆階-1全基因，并構 建MT-1質粒； (2) 以鯉的cDNA為模板，以SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4引物，克隆Caspase-8 CDS，并構 建 Caspase-8 質粒； (3) 以MT-1質粒、Caspase-8質粒為模板，分別以SEQ ID NO. 1、和SEQ ID NO.5為引物， 克隆MT-1的啟動子序列；以SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7為引物進行擴增，克隆Caspase-8小 亞基編碼序列；以SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9為引物進行擴增，克隆Caspase-8大亞基編碼 序列；以SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO.2為引物進行擴增，克隆MT polyA信號序列；上述擴增產 物經PCR純化后，等量加入PCR反應體系中，不加引物進行擴增，得總的擴增產物； (4) 采用SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12為引物，步驟(3)中的總的擴增產物為模板，擴增 全長的融合片段； (5) 通過酶切，將純化的步驟(4)所述的全長的融合片段插入到真核表達載體中，構建 得到鯉DNA疫苗載體。6. 根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述真核表達載體為pEGFP-Nl。7. 權利要求1或2所述的鯉凋亡基因在制備鯉DNA疫苗中的應用。8. 權利要求3或4所述鯉的DNA疫苗載體在制備鯉DNA疫苗中的應用。9. 一種鯉DNA疫苗，其特征在于，其活性成分包括有權利要求1或2所述的鯉凋亡基因， 或其活性成分包括有權利要求3或4所述鯉的DNA疫苗載體。
【文檔編號】C12N15/63GK106047911SQ201610370499
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月27日
【發明人】劉振興, 柯浩, 郝樂, 馬江耀, 馬艷平, 梁志凌
【申請人】廣東省農業科學院動物衛生研究所