黑曲霉hc306及在轉化柚皮苷制備柚皮素中的應用
【專利摘要】本發明公開了一種黑曲霉(Aspergillus niger)HC306及在生物轉化柚皮苷制備柚皮素中的應用，所述黑曲霉HC306保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號GDMCC No:60026，保藏日期2016年3月21日，地址：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓；郵編：510075；本發明黑曲霉HC306無毒無害，使用安全，生長迅速，抗雜菌能力強，批次穩定；發酵培養基成分簡單，市場價格低，從而柚苷酶的生產成本較低；將含柚苷酶的粗酶液直接運用于根皮素的制備，免去了酶的分離純化步驟，有助于降低生產成本；柚皮素的轉化得率高，最高可達93.4％，且具有副產物少，產物容易提取等優點。GDMCC No: 6002620160321
【專利說明】黑曲霉HC306及在轉化袖皮昔制備袖皮素中的應用 (-)技術領域
[0001]本發明設及一種抽皮素的制備方法，特別設及一株黑曲霉(AspergiIlus niger) HC306，W及該菌株在轉化抽皮巧制備抽皮素中的應用。 (二)【背景技術】
[0002] 抽皮素(naringenin)，又稱相枯素、抽巧元和抽皮巧原等，化學名4'，5,7-S徑基 二氨黃酬，CAS號為480-41-1，分子式Cl出12〇5，分子量為272.25。抽皮素廣泛存在于蕓香科植 物，如葡萄抽、西紅柿、葡萄W及相橘類水果中。藥理學研究已表明，抽皮素具有廣泛的生理 活性，包括抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、抗衰老和止咳桂疲等，因此可被開發應用于 醫藥和食品保健等領域。
[0003] 抽皮素的生產可W直接從一些天然植物中提取分離，如從桃葉、費奠中提取。但因 抽皮素在天然植物中的含量不高，直接提取分離的收率往往較低，如采用C〇2超臨界萃取技 術從桃葉中提取分離抽皮素，平均得率僅為2.18% (陳雪峰等.有機溶劑提取桃葉中抽皮素 的工藝研究.食品科技，2009，34巧）：209-212)。抽皮素多W其糖巧形式存在于天然植物中， 即抽皮巧(naringin，CAS號10236-47-2，分子量580.53)，如在花橘紅中，抽皮巧的含量一般 可達到10%，所W抽皮素的生產方法多W抽皮巧為底物，采用酸水解或酶水解兩種方法得 到。目前專利報道多W酸水解制備，如專利CN103467428.A、CN102453011.A、CN104829579.A 和CN104829578.A等。酸水解雖然具有工藝簡單、成本低的優勢，但都需要使用有機酸和大 量有機溶劑，不適合現代化生產綠色環保的要求，且產品往往需要經過活性炭脫色處理。專 利CN103740610. B采用了生物轉化法，用鏈球菌（Streptococ州S SP. )AUH-JLD109和大腸埃 希氏菌化SChericMa coli)AUH-D2-l混合培養液轉化抽皮巧獲得抽皮素，雖有工藝環保， 轉化率高的優點，但設及到兩種微生物菌株的培養，工藝不夠簡便，菌體的培養成本較高。 目前，有采用抽巧酶水解抽皮巧制備抽皮素的研究報道(鄧媛等.黑曲霉TC-Ol產抽巧酶對 抽皮巧酶解作用的研究.中國食品添加劑，2012 (3): 108-111 )，抽巧酶是一種由CtA-鼠李糖 巧酶和e-D葡萄糖巧酶組成的復合酶，分別水解抽皮巧上的鼠李糖和葡萄糖殘基。較酸堿水 解法相比，酶解工藝具有條件溫和，產品易純化等優點。
[0004] 許多微生物可W產生抽巧酶，特別是曲霉屬和青霉屬中的一些種，國內外已有不 少利用微生物發酵制備抽巧酶的研究報道和專利申請，如專利CN10 3060 287.B、 CN101487001.B和CN104404016.A等。如果將微生物發酵制備的抽巧酶，經過分離純化后用 于抽皮素的制備，無疑導致生產成本過高而無法工業化應用。如果利用產抽巧酶的微生物 發酵，將濾除菌體的粗酶液直接作為抽巧酶的來源，則可W克服酸水解和純酶水解解法的 不足，具有反應條件溫和、專一性強、生產成本低和環境友好等優點。 (H)
【發明內容】

[0005] 本發明目的是提供一株產生抽巧酶的微生物菌株一黑曲霉(Aspergillus niger) 肥306,及其在轉化抽皮巧制備抽皮素中的應用，較好地克服現有酸水解法制備中專一性差 和轉化得率低的問題，本工藝具有成本低、流程簡單、產物得率高和轉化副產物少等優點。 [0006]本發明采用的技術方案是：
[0007]本發明提供一株新菌株一黑曲霉(Aspergillus niger化C306,保藏于廣東省微生 物菌種保藏中屯、，保藏編號:GDMCC No :60026，保藏日期2016年3月21日，地址:廣東省廣州 市先烈中路100號大院59號樓5樓;郵編:510075。
[0008] 本發明所述黑曲霉HC306,是從W抽子皮為微生物來源的富集培養物中分離和篩 選得到的優良菌株。所述黑曲霉HC306的形態特征如下:在馬鈴馨瓊脂平板培養基上，28°C 條件下培養3天，菌落初期為白色絨毛狀，之后變成灰色，菌絲上層布滿黑色抱子頭，背面略 帶黃褐色。分生抱子頭黑褐色放射狀，頂囊球形，直徑700~800WH，頂囊周圍著生雙層分生 抱子小梗，長短不一，小梗上產生分生抱子，分生抱子褐色球形，直徑2.5~4. Owii。
[0009] 所述黑曲霉HC306的18s rDNA部分核巧酸序列如SEQ ID NO : 1所示： ATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATACCTGTGG TAATTCTAGAGCTAATACATGCTGAAAACCTCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCCCTT CGGGGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGC CCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGA GAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGG TAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAG GAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAG TTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTT CCTTCTGGGGAATCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCA AAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGA CCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAA GACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATC AGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTTCTATTATGACCCGTTCGGCAC CTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGG GCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAATAAGGAT TGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATCTTTTGGATGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTG CTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGCATTTGC。
[0010] 本發明還提供一種所述黑曲霉肥306在生物轉化抽皮巧制備抽皮素中的應用。
[0011] 具體的，所述應用如下：W黑曲霉HC306產酶培養后的發酵液經抽濾獲得的濾液為 生物催化劑，W抽皮巧為底物，WpH 4.0的憐酸緩沖液為反應介質構成轉化體系，于40~50 °C、200~25化/min恒溫振蕩條件下進行轉化反應，轉化反應結束后，轉化液經分離純化獲 得抽皮素。
[001 ^ 進一步，所述催化劑抽巧酶活力300~400U/mL，在轉化體系中體積用量為10 %~ 50% ;所述底物抽皮巧的終濃度為5~lOg/L轉化體系。
[0013] 進一步，所述轉化反應的條件為:在40~50°C、200~25化/min恒溫振蕩條件下轉 化1~化。
[0014] 所述黑曲霉HC306菌株在產酶培養前，通常需要先經斜面培養基活化培養，或再經 過種子培養基擴大培養，然后用抱子或種子液接入發酵培養基進行產酶培養，所述黑曲霉 HC306產酶培養方法為：（I)活化培養:將黑曲霉HC306菌種抱子接種于斜面培養基，于28~ 30°C恒溫培養2~3天，獲得斜面抱子，所述的斜面培養基為馬鈴馨葡萄糖瓊脂培養基 (PDA); PDA培養基組成為：馬鈴馨100~200g/L(馬鈴馨洗凈去皮，切成小塊，加 5倍質量水煮 沸20~30min，4層紗布過濾去渣留汁）、薦糖10~20g/L、瓊脂15~20g/L，pH自然；（2)種子擴 大培養:挑取取步驟（1)活化培養后黑曲霉HC306斜面抱子接種至種子培養基中，于28~30 °C、200~25化/min恒溫振蕩條件下培養2~3天，得種子液;所述種子培養基組成為：薦糖5 ~lOg/L，玉米漿5~10g/L，K出P〇4 2g/L，MgS〇4 0.5g/L，CaCl2 O.lg/L，溶劑為自來水，pH 5 ~6;優選所述種子培養基組成為：薦糖lOg/L，玉米漿lOg/L，K此P〇4 2g/L，MgS〇4 0.5g/L， 化Cl2 0.1 g/L，溶劑為自來水；（3)產酶培養:將種子液W體積濃度5~10%的接種量接種至 發酵培養基中，于28~30°C、200~25化/min恒溫振蕩條件下培養3~4天，獲得發酵液，將發 酵液過濾，濾液中抽巧酶活性為300~400U/mL，濾液即為催化劑;所述發酵培養基組成為： 抽皮巧 1 ~2g/L，薦糖3~5g/L，玉米漿4~6g/L，K出P〇4 2g/L，MgS〇4 0.5g/L，CaCl2 O.lg/L， 溶劑為自來水，pH 5~6。
[0015] 進一步，優選所述發酵培養基組成為:抽皮巧2g/L，薦糖5g/L，玉米漿6g/L，K出P〇4 2g/L，MgS〇4 0.5g/L，CaCl2 O.lg/L，溶劑為自來水，pH為5。
[0016] 所有培養基配制完畢后，立即進行12rC高壓蒸汽滅菌15min。
[0017] 本發明所述分離純化的方法為:在生物轉化反應結束后，轉化體系用等體積的乙 酸乙醋萃取3次，合并萃取液于圓底燒瓶中，45°C下減壓蒸干乙酸乙醋后，再加入原轉化體 系體積1/5的甲醇溶解殘留物；甲醇溶液用濾紙過濾后，濾液在45°C下減壓干燥(優選濾液 轉入另一潔凈圓底燒瓶中，45°C下減壓蒸干甲醇后，加少量甲醇溶解殘留物，甲醇溶液轉入 潔凈燒杯中，減壓干燥后），即得抽皮素。
[0018] 本發明的有益效果主要體現在：（1)本發明提供一株新菌株一黑曲霉HC306,該菌 是一株無毒無害、使用安全的菌種；（2)黑曲霉HC306生長迅速，抗雜菌能力強，批次穩定； (3)發酵培養基成分簡單，市場價格低，從而抽巧酶的生產成本較低；（4)將含抽巧酶的粗酶 液直接運用于抽皮素的制備，免去了酶的分離純化步驟，有助于降低生產成本；（5)抽皮素 的轉化得率高，最高可達93.4%，且具有副產物少，產物容易提取等優點。 (四）
【附圖說明】
[0019] 圖1抽皮巧轉化為抽皮素的化學反應式。
[0020] 圖2 HPLC分析抽皮素濃度的標準曲線。
[0021] 圖3 HPLC法分析對轉化樣品的分析圖譜。曲線A為標準品抽皮巧和抽皮素的HPLC 圖譜；曲線B為抽皮巧轉化化的對照樣品HPLC圖譜；曲線C為抽皮巧經生物轉化化后的HPLC 圖譜(實施例4樣品）。 (五)
【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0023] 實施例1:轉化菌株的富集和分離
[0024] 在250mLS角瓶中加入約20g經粉碎的新鮮抽子皮，于28°C恒溫培養5天。將長滿霉 菌的富集物用無菌水稀釋I X IO6倍后涂布于PDA平板培養基上，于28°C恒溫培養4天，挑取 顏色和形態不同的霉菌菌落轉接PDA斜面培養基，置于28°C恒溫培養3天，得抱子豐富的斜 面菌株9株，分別予W編號化C301~肥309)，保藏于4°C冰箱中備用。
[0025]所述的平板培養基和斜面培養基均為馬鈴馨葡萄糖瓊脂培養基(PDA),按如下組 成和方法配制：馬鈴馨洗凈去皮切成小塊，稱取200g，加自來水1000 mL，煮沸30min，4層紗布 過濾去渣，濾液補足到1000 mL,再加入薦糖20g、瓊脂18g，pH自然(實測6.5)，加熱至瓊脂溶 化后分裝試管或=角瓶中，經高壓蒸汽12rC滅菌15min后擱置斜面或倒入無菌培養皿。 [00%]實施例2:轉化菌株的篩選和分類鑒定
[0027]用棉簽分別薩取實施例1獲得的各個菌株斜面抱子3次，接入50mL發酵培養基中， 于28°C、200r/min恒溫振蕩條件下產酶培養4天后，50mL發酵液用布氏漏斗抽濾，收集的濾 液即為粗酶液，約40血。取25mL粗酶液置于ISOmLS角瓶中，0.25g抽皮巧溶于25血的抑4.0 憐酸緩沖液中，兩者混合后構成轉化體系(總體積50mL)，于40°C、200r/min恒溫振蕩條件下 轉化化;轉化反應結束后，取轉化液5血于SOOOg離屯、IOmin，經0.45皿微孔濾膜過濾后，用高 效液相色譜法化PLC)分析樣品中抽皮素的濃度。
[002引HPLC法分析不同菌株發酵制備的粗酶液作催化劑轉化抽皮巧后，轉化體系中抽皮 素的濃度，由此比較不同菌株產酶活力的大小。經過比較，由編號HC306的菌株發酵制備的 粗酶液轉化抽皮巧，生成抽皮素的得率最高，為58.4%，轉化體系中的抽皮素濃度為1.37g/ L。
[0029] 將菌株肥306接種在PDA平板培養基上，28 °C條件下培養3天，菌落初期為白色絨毛 狀，之后變成灰色，菌絲上層布滿黑色抱子頭，背面略帶黃褐色。分生抱子頭黑褐色放射狀， 頂囊球形，直徑700~800WH，頂囊周圍著生雙層分生抱子小梗，長短不一，小梗上產生分生 抱子，分生抱子褐色球形，直徑2.5~4. Owii。
[0030] 該菌株交由生工生物工程（上海）有限公司進行18S rDNA測序，測得序列大小為 1288bp(SEQ ID NO: 1所示）。將該序列在GenBank上進行化AST比對，與25株黑曲霉菌株的 18S rDNA序列有大于99%的同源性。綜合HC306菌株的形態特征和18S rDNA的序列分析結 果，可W確定HC306菌株為一株黑曲霉(AspergiIlus niger)。該菌株已保藏于廣東省微生 物菌種保藏中屯、，GDMCC No: 60026，保藏日期2016年3月21日。
[0031 ]所述的PDA平板培養基組成和制備方法同實施例1。
[0032] 所述的發酵培養基按如下組成和方法配制：抽皮巧Ig/L，薦糖3g/L，玉米漿4g/L， K此P〇4 2g/L，MgS〇4 0.5g/L，CaCl2 O.lg/L，溶劑為自來水，pH 6e250mLS角瓶裝50mL發酵 培養基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121°C滅菌15min。
[0033] 按上述方法培養黑曲霉HC306,發酵液中的干菌體濃度為4.56g/L，發酵液的抽巧 酶活力為31抓/mL。
[0034] 所述的抽巧酶活力測定方法為：取1.9mL的pH 4.0憐酸緩沖液于試管中，加入 0.1 mL發酵上清液混勻于40°C水浴中預熱5min，再加入2mL用抑4.0憐酸緩沖液配制，濃度 為0.3g/L的抽皮巧標準液，于40°C下反應15min，后于100°C水浴中加熱20min使酶失活，取 出后迅速冷卻至室溫。空白對照為先將發酵上清液失活后再加入抽皮巧標準液，其他操作 與對應的酶反應管相同。經過酶反應后的溶液于室溫下SOOOg離屯、5min后，用高效液相色譜 儀檢測樣品中的抽皮素濃度。
[0035] 抽巧酶活力單位的定義:在40°C、pH 4.0的條件下，每分鐘生成化g抽皮素所需的 酶量定義為一個抽巧酶活力單位化)。
[0036] 所述的PH4.0憐酸緩沖液配制方法為：稱取0.8954g的化油P〇4 ? 12出0定容至 250mL，0.525?的巧樣酸定容至500mL。然后將兩種溶液按照體積比1:2混合，分別利用運兩 種溶液將混合溶液的pH值調節至4.0。
[0037] 所述HPLC分析方法為:LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津儀器有限公司），色譜柱 為F*henomenex Luna C18鍵合硅膠柱（5皿，250mmX4.6mm)，柱溫25°C ;流動相為體積比1:1 的甲醇和水混合物，流速1. OmL/min，檢測波長28化m，進樣量20化。由相同分析條件下的標 準品抽皮素濃度-峰面積標準曲線（圖2)計算出樣品中的抽皮素濃度。
[0038] 實施例3:黑曲霉肥306菌株轉化抽皮巧生成抽皮素的應用1
[0039] W實施例2篩選獲得的黑曲霉HC306為產酶菌種，經種子擴大培養，發酵制備的粗 酶液轉化處理抽皮巧，抽皮素的摩爾轉化得率較實施例2略有提高，重復實驗3批次結果無 顯著性差異，表明該菌種產酶轉化抽皮巧生產抽皮素的性能穩定，具體工藝步驟如下：
[0040] (1)將4°c冰箱中保藏的黑曲霉HC306斜面菌種接種于新鮮PDA斜面培養基，斜面于 28°C恒溫培養3天。所述的PDA斜面培養基組成和制備方法同實施例1;
[0041 ] (2)用棉簽薩取步驟(1)活化培養后黑曲霉HC306抱子2次接至50mL種子培養基中， 于28°C、200r/min恒溫振蕩條件下培養3天，得干菌體濃度為6.23g/L的種子液。所述種子培 養基組成為：薦糖5g/L，玉米漿5g/L，K此P〇4 2g/L，MgS〇4 0.5g/L，CaCl2 O.lg/L，溶劑為自 來水，pH 6,250mLS角瓶裝50mL種子培養基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121°C滅菌15min;
[0042] (3)步驟(2)種子液W體積濃度10% (即5mL)的接種量接種至50mL發酵培養基中， 于28°C、200r/min恒溫振蕩條件下培養4天，得干菌體濃度為4.75g/L的發酵液。所述的發酵 培養基組成如下：抽皮巧Ig/L，薦糖3g/L，玉米漿4g/L，K出P〇4 2g/L，MgS〇4 0.5g/L，CaCl2 0.1 g/L，溶劑為自來水，pH 6，250mLS角瓶裝50mL發酵培養基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121 °C 滅菌ISmin。
[0043] (4)產酶培養結束后，將步驟(3)獲得的發酵液50mL用布氏漏斗抽濾，收集的濾液 40mL即為粗酶液，按實施例2方法測定其抽巧酶活力為337U/mL。取25mL粗酶液置于ISOmLS 角瓶中；0.25g抽皮巧溶于25mL的pH 4.0憐酸緩沖液中，兩者混合后構成轉化體系（總體積 50mL)，于40°C、200;r/min恒溫振蕩條件下轉化化;轉化反應結束后，取轉化液5mL于SOOOg離 屯、IOmin，經0.45皿微孔濾膜過濾后，按實施例2中的HPLC方法分析樣品中抽皮素濃度。
[0044] HPLC分析表明，按本實施例方法，黑曲霉HC306菌株制備的粗酶液轉化處理抽皮 巧，轉化樣品中抽皮素濃度為1.49g/L，摩爾轉化得率為63.5%，較實施例2中轉化得率提高 了 5.12%。實施例3轉化方法重復實驗3批次，3批次實驗結果無顯著性差異，表明黑曲霉 HC306菌株制備的粗酶液轉化抽皮巧為抽皮素的轉化性能穩定。
[0045] 實施例4:黑曲霉肥306菌株轉化抽皮巧生成抽皮素的應用2
[0046] W黑曲霉HC306為產酶菌種，經過種子培養優化、產酶發酵(培養基組成及初始抑） 和轉化條件(粗酶液用量、底物濃度和轉化時間）優化后，發酵制備的粗酶液轉化處理抽皮 巧，抽皮素的轉化得率較實施例3有大幅度提高，具體工藝步驟如下：
[0047] (1)將4°C冰箱中保藏的黑曲霉HC306斜面菌種接種于新鮮斜面培養基，斜面于30 °C恒溫培養3天。所述的斜面培養基組成和制備方法同實施例1。
[0048] (2)用棉簽薩取步驟（I)活化培養后黑曲霉HC306抱子2次接種至種子培養基中，于 30°C、250r/min恒溫振蕩條件下培養2.5天，得干菌體濃度為9.48g/L的種子液。所述種子培 養基組成為：薦糖lOg/L，玉米漿 10g/L，K此P〇4 2g/L，MgS〇4 0.5g/L，CaCb O.lg/L，溶劑為 自來水，pH 6,250mLS角瓶裝50mL種子培養基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121°C滅菌15min;
[0049] (3)步驟(2)種子液W體積濃度10% (即5mL)接種量接種至50mL發酵培養基，于30 °C、250r/min恒溫振蕩條件下培養3天，得干菌體濃度為5.82g/L的發酵液。所述的發酵培養 基組成如下：抽皮巧2g/L，薦糖5g/L，玉米漿6g/L，K此P〇4 2g/L，MgS〇4 0.5g/L，CaCl2 O.lg/ L，溶劑為自來水，抑為5，250mL^角瓶裝50mL發酵培養基，8層紗布扎日，高壓蒸汽121°C滅 菌15min。
[0050] (4)產酶培養結束后，將步驟(3)獲得的發酵液50mL用布氏漏斗抽濾，收集的濾液 40mL即為粗酶液，按實施例2方法測定其抽巧酶活力為372U/mL。取5mL粗酶液置于ISOmLS 角瓶中；〇.5g抽皮巧溶于45mL的pH 4.0憐酸緩沖液中，兩者混合后構成轉化體系（總體積 50mL)，于50°C、250;r/min恒溫振蕩條件下轉化Ih;轉化反應結束后，取轉化液5mL于SOOOg離 屯、IOmin，經0.45皿微孔濾膜過濾后，按實施例2中的HPLC方法分析樣品中抽皮素濃度。
[0051 ] HPLC分析表明，按本實施例方法，黑曲霉HC306菌株發酵制備的粗酶液轉化處理抽 皮巧，轉化液中抽皮素濃度有大幅度提高，為4.33g/L，摩爾轉化得率為92.3%。
[0052]實施例5:黑曲霉肥306菌株轉化抽皮巧生成抽皮素的應用3
[0化3] 在實施例3的基礎上，將產酶培養放大到SOOmL規模，具體工藝步驟如下：
[0054] (1)將4°C冰箱中保藏的黑曲霉HC306斜面菌種接種于新鮮斜面培養基，斜面于30 °C恒溫培養3天。所述的斜面培養基組成和制備方法同實施例1。
[0055] (2)用棉簽薩取步驟（1)活化培養后黑曲霉HC306抱子2次至種子培養基中，于30 °C、250r/min恒溫振蕩條件下培養2.5天，得干菌體濃度為8.84g/L的種子液。所述種子培養 基組成實施例4。
[0056] (3)步驟(2)種子液W體積濃度5% (即40mL)接種量接種至SOOmL發酵培養基，于30 °C、250r/min恒溫振蕩條件下培養3天，得干菌體濃度為5.77g/L的發酵液。所述的發酵培養 基組成如下：抽皮巧2g/L，薦糖5g/L，玉米漿6g/L，化Cl 5g/L，K此P〇4 5g/L，MgS〇4 0.5g/L， 溶劑為自來水，pH為5，化S角瓶裝500mL發酵培養基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121°C滅菌 20min〇
[0057] (4)產酶培養結束后，將步驟(3)獲得的發酵液500mL用布氏漏斗抽濾，收集的濾液 400mL即為粗酶液，按實施例2方法測定其抽巧酶活力為354U/mL。取其中的5mL粗酶液置于 ISOmLS角瓶中；0.5g抽皮巧溶于45mL的pH 4.0憐酸緩沖液中，兩者混合后構成轉化體系 (總體積50mL)，于50°C、250r/min恒溫振蕩條件下轉化化;轉化反應結束后，取轉化液5mL于 SOOOg離屯、IOmin，經0.45皿微孔濾膜過濾后，按實施例2中的HPLC方法分析樣品中抽皮素濃 度。
[005引HPLC分析表明，按本實施例方法，黑曲霉HC306菌株發酵制備的粗酶液轉化處理抽 皮巧，轉化液中抽皮素濃度有大幅度提高，達到4.16g/L，摩爾轉化得率達到88.7 %。
[0059] 實施例6:黑曲霉肥306菌株轉化抽皮巧生成抽皮素的應用4
[0060] 在實施例4的基礎上，將生物轉化體系放大到SOOmL規模，具體工藝步驟如下：
[0061 ] (1)按實施例4方法，制備黑曲霉HC306的發酵得到的粗酶液80血。取50血粗酶液置 于ILS角瓶中；5g抽皮巧溶于450mL的抑4.0憐酸緩沖液中，兩者混合后構成轉化體系（總 體積50〇111〇，于50°(：、25〇1'/1]1；[]1恒溫振蕩條件下轉化化;轉化反應結束后，取轉化液51]^于 SOOOg離屯、IOmin，經0.45皿微孔濾膜過濾后，按實施例2中的HPLC方法分析樣品中抽皮素濃 度。
[0062] (2)上述轉化液495mL，用等體積的乙酸乙醋萃取3次，合并萃取液于圓底燒瓶中， 45°C下減壓蒸干乙酸乙醋后，再加入IOOmL甲醇溶解殘留物；甲醇溶液用濾紙過濾后，轉入 另一潔凈圓底燒瓶中，45°C下減壓蒸干甲醇后，加少量IOmL甲醇溶解殘留物，甲醇溶液轉入 潔凈燒杯中，減壓干燥后得抽皮素。
[0063] HPLC分析表明，按本實施例方法，黑曲霉HC306菌株發酵制備的粗酶液轉化處理抽 皮巧，轉化液中抽皮素濃度為4.38g/L，摩爾轉化得率達到93.4 %。得2.21g抽皮素，純度為 88.6%，轉化收率為85.2%。
【主權項】
1. 黑曲霉(Aspergillus niger)HC306,保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號 GDMCC N〇:60026,保藏日期2016年3月21日，地址:廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓;郵 編：510075。2. -種權利要求1所述黑曲霉HC306在生物轉化柚皮苷制備柚皮素中的應用。3. 如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的應用是以黑曲霉HC306產酶培養后發酵 液經抽濾獲得的濾液為催化劑，以柚皮苷為底物，以pH 4.0的磷酸緩沖液為反應介質構成 轉化體系，于40~50 °C、200~250r/min恒溫振蕩條件下進行轉化反應，轉化反應結束后，轉 化液經分離純化獲得柚皮素。4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述催化劑柚苷酶活力300~400U/mL，催化劑 在轉化體系中體積用量為10%~50%。5. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述底物柚皮苷的終濃度為5~10g/L轉化體 系。6. 如權利要求3所述的應用，其特征在于轉化反應于40~50°C、200~250r/min恒溫振 蕩條件下轉化1~2h。7. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述催化劑制備方法為：（1)活化培養:將黑曲 霉HC306菌種孢子接種于斜面培養基，于28~30°C恒溫培養2~3天，獲得斜面孢子，所述的 斜面培養基組成為：馬鈴薯100~200g/L、蔗糖10~20g/L、瓊脂15~20g/L，pH自然；（2)種子 擴大培養:挑取步驟（1)活化培養后黑曲霉HC306斜面孢子接種至種子培養基中，于28~30 °C、200~250r/min恒溫振蕩條件下培養2~3天，得種子液，所述種子培養基組成為：蔗糖5 ~l〇g/L，玉米漿5~10g/L，KH 2P〇4 2g/L，MgS〇4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶劑為自來水，pH 5 ~6; (3)產酶培養:將種子液以體積濃度5~10%的接種量接種至發酵培養基中，于28~30 °C、200~250r/min恒溫振蕩條件下培養3~4天，獲得發酵液，將發酵液過濾，濾液即為催化 劑;所述發酵培養基組成為：柚皮苷1~2g/L，蔗糖3~5g/L，玉米漿4~6g/L，KH 2P〇4 2g/L， MgS〇4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶劑為自來水，pH 5~6。8. 如權利要求7所述的應用，其特征在于所述發酵培養基組成為:柚皮苷2g/L，蔗糖5g/ L，玉米漿6g/L，KH2P〇4 2g/L，MgS〇4 0.5g/L，CaCl2 0.1g/L，溶劑為自來水，pH為5。9. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述轉化液分離純化的方法為:在生物轉化反 應結束后，轉化液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，45°C下減壓蒸干乙酸乙酯后， 再加入原轉化體系體積1/5的甲醇溶解殘留物，過濾，濾液在45°C下減壓干燥，即得柚皮素。
【文檔編號】C12P17/06GK105838622SQ201610234720
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月14日
【發明人】陳虹, 陳蔚青, 陸胤, 張建芬, 柯薇
【申請人】浙江樹人大學