一種防止雜菌污染的蛹蟲草子實體培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種提高蛹蟲草子實體生產效率減少雜菌污染的方法，該方法包括菌種活化、液體菌種制作、蛹蟲草培養3個步驟，其特征在于該方法中改變了培養容器的封口膜為封口袋，在于將目前半開放式發酵工藝徹底改變成密封式發酵，在于將培養室發菌改成在接種室原地發菌來實現的。本發明提高了蛹蟲草子實體生產效率，減少雜菌尤其是“吃草菌”污染的方法，對大幅度提高產率和經濟效益具有重要意義；本發明具有方便快捷的優點，適用于蛹蟲草固體發酵大規模生產子實體。
【專利說明】
一種防止雜菌污染的蛹蟲草子實體培養方法
技術領域
[0001]本發明涉及真菌發酵工程，具體而言涉及蛹蟲草固體培養高產子實體落。
【背景技術】
[0002]蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L.) Link)，又稱北冬蟲夏草，是一種能寄生于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲蛹及幼蟲上的蟲生真菌，菌性屬中溫型，生長在低海拔的平原地域，主要分布在東北、華北、西北等省區，但據報道，云南、貴州、四川、重慶等南方省區也有分布O
[0003]據估算我國每年僅蛹蟲草干子實體產量就達3000噸以上(Wen et al.，2014)，冬蟲夏草產量在100噸左右，產值上百億;另外以蟲草及相關無性型發酵產品為原料生產的國藥準字的藥品有45種，其中金水寶和白令膠囊年銷售總和超過20億元；以蟲草為原料生產的國食健字或衛食健字保健品有99種，有33家企業獲得蟲草類食品生產許可(www.sfda.gov.cn, 2014)，國內外以蟲草為原料生產的化妝品有好幾種(Hydeet al.,2010);從蟲草及其相關真菌中發現了上百種新活性化合物(胡豐林和李增智，2007);
蛹蟲草子實體及其菌粉在我國作為一類新藥(中藥國藥準字Z20030034/35)已獲得國家藥品監督管理局批準進入臨床，產品標識其具有補肺益腎、止咳化痰之功效，能夠調節機體免疫功能，提高機體綜合抗病能力，主要用于慢性支氣管炎、各種腫瘤及其它免疫系統疾病的治療。經大量的研究證明，蛹蟲草固體發酵生產的子實體(衛生部2009年批準的新資源食品)與天然冬蟲夏草的成份極相似，并證明了它與天然冬蟲夏草有相似的藥理作用與臨床效果，甚至在某些方面優于天然的冬蟲夏草(如毒性比天然的小)，可以代替冬蟲夏草在臨床廣泛應用。
[0004]蟲草多糖由于其顯著的免疫活性和抗腫瘤作用，已被國家食品藥品監督局受理進入臨床審評階段(CXZL0700014/15)。蟲草菌素的抗菌、降血脂、減肥、抗腫瘤和抗癌作用愈來愈受到人們的重視。降血脂方面的效果尤為明顯，與法國力博福尼制藥公司生產的非諾貝特效果相當或優于非諾貝特；它還可作為核酸和染色體復制的終止劑，在生理生化研究方面有重要用途。在治療白血病方面蟲草菌素也由FDA批準進入了臨床研究(1997年11月美國癌癥研究所和OXiGENE (嫩50厶0:0父6幻-叱1'00003005，2008年7月011(30￥18七&(嫩50八0:0￥11')-從:1'00709215)。據美國011(30￥丨8丨&公司報道，蟲草菌素的市場價值已達到3.5億美圓。
[0005]蟲草素來源主要是蛹蟲草子實體，目前蛹蟲草已實現了大規模固體培養，但子實體生產技術還不完善，發酵過程雜菌污染環節較難控制，尤其是“吃草菌”是一大天敵，處理不好不但嚴重污染當季生產，而且還污染整個廠房的空氣和設備，導致后續生產陷入困境，技術和管控風險相當大。
[0006]近年來，人們關注提高蟲草菌素含量的技術，涉及蟲草菌素的專利申請有01124109.8號“發酵培養生產蟲草素的方法(液體培養)”、200810068734.8號“紅曲協同發酵提高蛹蟲草子實體和蟲草素產量的方法”等。然而，目前關于蛹蟲草固體發酵的專利主要集中在子實體生產工藝研究方面，很少涉及大規模生產過程中污染的防控和“吃草菌”的預防。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種提高蛹蟲草子實體生產效率，減少雜菌污染的方法，從而大幅度提高產率和經濟效益，可以克服現有技術的不足。
[0008]本發明的技術方案是:提高蛹蟲草子實體生產效率減少雜菌污染的方法，該方法包括菌種活化、液體菌種制作和蛹蟲草培養三個步驟，其中
1.菌種活化
(1)配PDA培養基:馬鈴薯200g，水煮30min，用4層紗布過濾，取濾液，葡萄糖20g，瓊脂15?20g,加水至100mL;
(2)將配好的PDA培養基分裝到試管，包扎，121°C滅菌30mim;
(3)滅好菌的試管培養基凝固前擺斜面，冷卻；
(4)將原始菌種從4°C冰箱中取出，室溫下在超凈操作臺上無菌接種；
(5)接種蛹蟲草的斜面置26°C下黑暗恒溫培養；
(6)4?6天后，等菌種長滿斜面，用無菌水洗斜面制成孢子懸液(在超凈操作臺上無菌操作)。
[0009]2.液體菌種制作
將蛹蟲草孢子懸液稀釋到合適濃度，然后將孢子懸液接入液體母種培養基中，于18°C?25°C下搖床以180r/min的轉速培養4d。
[0010]上述液體母種培養基的配方為蛋白胨2%，蔗糖2% ,MgSO4.7H20 0.05%, KH2PO4
0.1%,水100mL，pH自然；裝液量為200mL/500mL三角瓶。
[0011]蛹蟲草培養
是用無色玻璃瓶中裝入20份大米、小麥或大米和小麥的混合物，按I: 1.6-1.8的料水比加入營養液;用耐高溫塑料袋封口后在118-121°C，30min高壓滅菌，冷卻后立即打開耐高溫塑料袋進行接種蛹蟲草液體母種，接種后繼續用耐高溫塑料袋封口密封，在接種區原地置18-20°C下黑暗恒溫培養5天;第6天將長滿菌絲的培養瓶轉移至培養室，從第6天起每天散射光光照不少于15h，溫度保持20-22°C，相對濕度提高至78-82%左右；蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照強度至1500LX，溫度保持20-25°C，空氣濕度83-87% ;待蛹蟲草培養50天后，蛹蟲草培養50天后收獲橙黃色的子實體。
[0012]所述的耐高溫塑料袋為耐高溫透明聚丙烯塑料袋。
[0013]所述的耐高溫透明聚丙烯塑料袋的深度為40-45cm。
[0014]4耐高溫透明聚丙烯塑料袋通過皮筋密封連接在無色玻璃瓶瓶口。
[0015]所使用的菌株為:蛹蟲草菌株(Cordycepsmilitaris)的無性型蛹草擬青霉(paeci lomycesmi Ii tar is)菌株。
[0016]與現有技術比較，本發明將目前培養容器的封口膜戳孔接種的半開放式發酵工藝徹底改變成不破壞封口袋的基礎上打開封口皮筋接種后的密封式發酵，這樣徹底杜絕發菌和生長過程中任何雜菌的污染。改變發菌地點，將目前接種后在培養室發菌改成在接種室原地發菌，這樣減少了從接種室到培養室的運輸過程，待3-5天后蟲草菌完全覆蓋配以后轉移至培養室，這樣進一步防止了污染。耐高溫透明聚丙烯塑料袋的深度為40-45cm，這樣可以確保子實體的伸展長度，不至于受壓彎曲；不采用玻璃罐頭瓶而采用直口瓶，這樣方便將子實體取出。
[0017]同時本發明的能提高蛹蟲草子實體生產效率，減少雜菌污染，經大量實驗，采用本方法雜菌污染率為3%，相對現有的培養方法(雜菌污染了達10%)具有大幅度提高，其對提高整個蛹蟲草子實體的產率和經濟效益具有重要意義。
[0018]
【具體實施方式】
[0019]實施例1:在10個容積為350ml、內徑為6.2cm、高度為15cm的圓柱形無色玻璃瓶中分別裝入20g大米，按1: 1.6的料水比加入32mL營養液(采用葡萄糖I %，蛋白胨1.5%，K2HPO4 0.05%, MgSO4.7H20 0.05%, VBi (2mg/L)，水 1000mL，pH 自然的配方配制而成的營養液)，用耐高溫透明聚丙烯塑料袋(長40cm)封口后118°C，30min高壓滅菌，冷卻后立即打開耐高溫透明聚丙烯塑料袋袋口接種蛹蟲草液體母種，接種后繼續用皮筋扎帶封口，在接種區原地置18_20°C下黑暗恒溫培養5天。第6天將長滿菌絲的培養瓶轉移至培養室，從第6天起每天散射光光照不少于15h，溫度保持20-22°C，相對濕度提高至78% ;蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照強度至1500LX，溫度保持20°C左右，空氣濕度83%;待蛹蟲草培養50天后，每瓶收獲橙黃色的新鮮子實體30g。
[0020]實施例2:在10個容積為350ml、內徑為6.2cm、高度為15cm的圓柱形無色玻璃瓶中分別裝入20g小麥，按1: 1.7的料水比加入34mL營養液(采用葡萄糖I %，蛋白胨1.5%，K2HPO4 0.05%, MgSO4.7H20 0.05%, VBi (2mg/L)，水 1000mL，pH 自然的配方配制而成的營養液)，用耐高溫透明聚丙烯塑料袋(長43cm)封口后120°C，30min高壓滅菌，冷卻后立即打開耐高溫透明聚丙烯塑料袋袋口接種蛹蟲草液體母種，接種后繼續用皮筋扎帶封口，在接種區原地置18_20°C下黑暗恒溫培養5天。第6天將長滿菌絲的培養瓶轉移至培養室，從第6天起每天散射光光照不少于15h，溫度保持20-22°C，相對濕度提高至80% ;蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照強度至1500LX，溫度保持22°C左右，空氣濕度85%;待蛹蟲草培養50天后，每瓶收獲橙黃色的新鮮子實體31g。
[0021]
實施例2:在10個長20cm、寬12cm、高為15cm的白色透明聚丙烯培養盆中分別裝入225g大米和225g小麥組合，按1:1.8的料水比加入810mL營養液(采用葡萄糖1%，蛋白胨1.5%，K2HPO4 0.05%, MgSO4.7H20 0.05%, VBi (2mg/L)，水 1000mL，pH 自然的配方配制而成的營養液)，用耐高溫透明聚丙烯塑料袋(長45cm)封口后12rC，30min高壓滅菌，冷卻后立即接種蛹蟲草液體母種，在接種區原地置18-20°C下黑暗恒溫培養5天。第6天將長滿菌絲的培養瓶轉移至培養室，從第6天起每天散射光光照不少于15h，溫度保持20-22°C，相對濕度提高至82%;蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照強度至1500LX，溫度保持25°C左右，空氣濕度87%;待蛹蟲草培養50天后，每盆收獲橙黃色的新鮮子實體450g。
【主權項】
1.一種提高蛹蟲草子實體生產效率減少雜菌污染的方法，該方法包括菌種活化、液體菌種制作和蛹蟲草培養三個步驟，其特征在于:蛹蟲草培養是用無色玻璃瓶中裝入20份大米、小麥或兩者的混合物，按1:1.6-1.8的料水比加入營養液；用耐高溫塑料袋封口后在118-12rC，30min高壓滅菌，冷卻后立即打開耐高溫塑料袋進行接種蛹蟲草液體母種，接種后繼續用耐高溫塑料袋封口密封，在接種區原地置18-20°C下黑暗恒溫培養5天;第6天將長滿菌絲的培養瓶轉移至培養室，從第6天起每天散射光光照不少于15h，溫度保持20-22°C，相對濕度提高至78-82%左右;蛹蟲草子座長出后，每天散射光光照不少于10h，且增加光照強度至1500LX，溫度保持20-25°C，空氣濕度83-87 待蛹蟲草培養50天后，蛹蟲草培養50天后收獲橙黃色的子實體。2.根據權利要求1所述的提高蛹蟲草子實體生產效率減少雜菌污染的方法，其特征在于:所述的耐高溫塑料袋為耐高溫透明聚丙烯塑料袋。3.根據權利要求1或2所述的提高蛹蟲草子實體生產效率減少雜菌污染的方法，其特征在于:所述的耐高溫透明聚丙烯塑料袋的深度為40-45cm。4.根據權利要求3所述的提高蛹蟲草子實體生產效率減少雜菌污染的方法，其特征在于:耐高溫透明聚丙烯塑料袋通過皮筋密封連接在無色玻璃瓶瓶口。
【文檔編號】A01G1/04GK105838624SQ201610262936
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月26日
【發明人】刁朝強, 文庭池, 廖勇, 康冀川, 周建云
【申請人】貴州省煙草公司貴陽市公司, 貴州大學