一種黃曲霉致病基因AfsumO及應用
【專利摘要】本發明公開了一種黃曲霉致病基因AfsumO及在篩選防治黃曲霉污染藥物的應用。本發明還公開了一種篩選抑制黃曲霉致病性或篩選防治黃曲霉污染的藥物的方法。更加具體地，該方法包含，在黃曲霉的培養體系中添加待篩選的候選物，并用針對AfSumO蛋白或蛋白片段的抗體檢測黃曲霉體內的AfSumO蛋白的表達水平和SUMO化修飾水平，并與不添加候選物的對照組進行比較，如果測試組中AfSumO蛋白的表達水平和SUMO化修飾水平在統計學上低于對照組，就表明該候選物是抑制黃曲霉的致病性的潛在藥物。
【專利說明】
一種黃曲霉致病基因AfsumO及應用
技術領域
[0001]本發明屬于微生物學領域，具體涉及一種黃曲霉致病基因及在篩選防治黃曲霉污染藥物的應用。
【背景技術】
[0002]黃曲霉(JsjOergiDt/s/7aras)是廣泛分布于自然界的腐生真菌，生長和擴散能力極強。黃曲霉可以寄生于糧食、食品及飼料中進行生長繁殖，并產生黃曲霉毒素，其中以黃曲霉毒素BUAflatoxin BI，AFB1)的危害最大，具有強肝臟毒性和致癌效應。目前全球每年有25%農作物被霉菌毒素污染，其中最為嚴重的就是黃曲霉毒素的污染。我國花生和玉米被黃曲霉污染的情況比較普遍，畜禽飼料和水產飼料的黃曲霉污染則更為嚴重，結果導致黃曲霉毒素通過食物鏈危害人類健康。由于黃曲霉毒素的理化性質穩定，大規模工業加工、日常烹飪條件或者巴氏滅菌等都無法清除污染。因此黃曲霉污染危害巨大，研究預防和控制黃曲霉污染具有重大的意義。
[0003]黃曲霉產孢、產毒的能力與其生長、擴散、繁殖和毒性密切相關，影響黃曲霉的致病性，一直以來科學家圍繞黃曲霉致病性調控機理展開了大量研究。隨著黃曲霉全基因組測序的完成，對其致病性相關的遺傳因素篩查和研究日漸增多，然而目前發現即使完全相同遺傳背景下，黃曲霉的產毒量也可能差異極大。這就提示黃曲霉對非遺傳因素的影響非常敏感。這其中有關外界環境因子如營養、溫度、水活度、PH值、氧化狀態以及群體感性等影響黃曲霉形態和產毒的研究已開展多年，而關于體內非遺傳因素調控黃曲霉致病性研究則仍處在起步階段。
[0004]研究發現真菌的次級代謝相關基因的轉錄和表達極有可能受到組蛋白乙酰化、DNA甲基化等表觀遺傳因素調控。黃曲霉毒素合成相關基因族內的基因是按順序激活的，而這種順序則由組蛋白H4的乙酰化來介導，黃曲霉毒素的產量與組蛋白H4的乙酰化水平是正相關的。除了表觀遺傳因素，許多生命進程還由可逆翻譯后修飾控制的，如磷酸化、糖基化、泛素化、SUM0(small ubiquitin-related modifier)化等。這些翻譯后修飾也被認為可能是聯接遺傳背景、環境因子兩大因素的重要橋梁之一，介導兩者的復雜交互作用，最終影響生物的性狀。在構巢曲霉中的研究發現蛋白激酶A( PKA)可能對Al f R進行磷酸化修飾，影響AlfR的核定位，進而抑制產孢和雜色曲霉素的合成，提示重要信號分子的磷酸化修飾可能也是AFBl生物合成的調控因素之一。敲除構巢曲霉的基因后，菌株的孢子產量和次級代謝產物都明顯降低了。黃曲霉中還未見關于SUMO化修飾的研究報道，SUMO化修飾對黃曲霉的致病性是否有影響也是未知的。
[0005]本發明人經過廣泛研究，首次在黃曲霉中分離出一種黃曲霉致病相關基因，本發明人將之命名為因。因此，本發明公開了一種黃曲霉致病基因該基因缺失的黃曲霉菌株致病力下降，本發明還公開了一種通過檢測黃曲霉體內AfSumO蛋白的表達水平和SUMO化水平來篩選抑制黃曲霉致病性或篩選防治黃曲霉污染的藥物的方法。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供一種黃曲霉致病基因及應用。
[0007]本發明的另一目的在于提供一種篩選抑制黃曲霉致病性的潛在物質的方法。
[0008]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
通過生物信息學同源比對分析方法，在黃曲霉基因組中尋找基因；
構建黃曲霉因缺失株，確定因缺失是否影響黃曲霉致病性:
檢測黃曲霉致病性相關檢測指標包括:
(I)相對于野生型黃曲霉，產生的孢子數量；
(3)相對于野生型黃曲霉，黃曲霉毒素的產量；
(4)相對于野生型黃曲霉，產毒相關基因的表達；
(5)所述的產毒相關基因包括:aflim因、a/75基因、afJA基因，aflB基因，a/7 C基因、afllM 因、aflE基因、afl庵因、a/7Gg 因、afl睡因、afl謹因、aflM 因、a/7A基因、aflL基因、a/7感因、af施因、af_因、aflP基因或a/7 6基因。
[0009](6)相對于野生型黃曲霉，侵染宿主的能力；
(7)所述的宿主包括:糧食及其制品、豆類及其制品、堅果及其制品、植物油及其制品、調味香辛料及其制品和飼料；
(8)所述的侵染宿主的能力包括:在宿主上定殖生成菌絲、產生孢子、產生黃曲霉毒素AFBlSAFB20
[0010]ZU/suMT菌株通過同源重組的方法從黃曲霉菌株(Zhuang, Z.et al.Toxins,2016，Jan 20，8(1)，pi1: E29.)的染色體中敲除fst/M?因或基因片段獲得，所述的」/5_0§因:
(1)具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列；或
(2)截短的SEQID NO:1所示的核苷酸序列，且該基因不編碼AfSumO蛋白或編碼降低活性(優選活性降低50%，更優選降低80%，更優選無活性)的AfsumO蛋白或蛋白片段。
[0011]在本發明的第二方面，提供一種抑制黃曲霉的致病性的潛在藥物的篩選方法，所述方法包括:
(a)在測試組中，在黃曲霉培養體系中添加待篩選的候選物，用相應抗體檢測黃曲霉體內的Af SumO蛋白的表達水平和SUMO化修飾水平，并且，在對照組中，在不添加所述候選物的、所述菌株的培養體系中，檢測AfSumO的表達水平和SUMO化修飾水平；
在一具體的實施方式中，所述用于分析檢測AfSumO表達水平和SUMO化修飾水平的相應抗體包括:
(1)直接針對AfSumO蛋白或蛋白片段的抗體;或
(2)將AfSumO蛋白的N端與小分子多肽標簽進行融合表達，針對小分子多肽標簽的抗體；
(b)將步驟(a)測試組中AfSumO的表達水平和SUMO化修飾水平與對照組中AfSumO的表達水平和SUMO化修飾水平進行比較，
如果測試組中AfSumO的表達水平和SUMO化修飾水平在統計學上低于(優選顯著低于，較佳的低20%或更低;更佳的低40%或更低;進一步更佳的低60%或更低)對照組，就表明該候選物是抑制黃曲霉的致病性的潛在物質。
[0012]本發明的優點在于:只需要在蛋白水平上檢測鑒定藥物對黃曲霉毒性的抑制效果，而不需要提取黃曲霉毒素，減少各種有機揮發性化學試劑的使用，減少對環境的污染，同時也大大減少可能對實驗操作人員產生的毒害。
【附圖說明】
[0013]圖1.黃曲霉AfSumO蛋白與其同源蛋白的序列比對分析，Af_SumO表示黃曲霉的SumO蛋白，An—SumO表不構巢曲霉中的SumO同源蛋白，Sc—Smt3代表釀酒酵母(Saccharomyces的SumO同源蛋白，Ca—Smt3代表白念珠菌(Candida 中的SumO同源蛋白，Sp—p傭代表裂殖酵母中的SumO同源蛋白，Dm—Smt3代表果繩中的SumO同源蛋白，X1—SUMOl代表非洲爪蟾中的SumO同源蛋白，Hs—SUMOl代表人類(^%雇9SajDiaoS)中的SumO同源蛋白。
[0014]圖2.在黃曲霉中敲除基因的策略及其染色體上的酶切圖譜(圖2A)、Southern雜交圖譜(圖2B)和半定量RT-PCR檢測敲除株基因的表達水平(圖2C) ο圖中wi Id type表示野生型菌株，ZU/仰加康示基因敲除株，0E::AfsumO^示Af因過表達株，P代表限制性內切酶Α?ΛΙ的酶切位點，Probe表示用于Southern雜交分析的探針。
[0015]圖3.黃曲霉菌株和對照菌株在Η)Α培養基上的菌落形態(圖3A)和產孢數量統計(圖3BX圖中wi Id type表示野生型菌株，示因敲除株，;Afs 示Afs _0^因過表達株D
[0016]圖4.黃曲霉菌株和對照菌株在YESSB培養基中產生AFBl的HPLC定量分析(圖4A、4B)和產毒相關基因轉錄水平分析(圖4C)。圖中wi Id type表示野生型菌株，Zl
示堪因敲除株，示因過表達株，AFBl表示黃曲霉毒素BI，AFB2代表黃曲霉毒素B2。
[0017]圖5.黃曲霉菌株和對照菌株侵染花生種子5天后的形態(圖5A)、產生孢子數量的統計分析(圖5B)以及花生子葉中黃曲霉毒素含量的TLC分析(圖5C)。圖中wildtype表示野生型菌株，ZU/^咖康示堪因敲除株，康示^/*5咖堪因過表達株，Mock為空白對照，Standard為黃曲霉毒素BI標準品，AFBl表示黃曲霉毒素BI。
[0018]圖6.黃曲霉菌株的構建策略(圖6A)和ant i_mCherry抗體Western雜交檢測黃曲霉體內融合蛋白mCheay-Af SumO表達水平及SUMO化修飾水平(圖6B)D圖中wild type表示野生型菌株，沿表示過表達mCherry的菌株，沿70?
加康不過表達 mCherry-Af sumO 的菌株 D
【具體實施方式】
[0019]如本文所用，黃曲霉f仰M?因(SEQ ID NO:1)用斜體W觀?;轅示，黃曲霉的減毒株用示，或用失株表示，黃曲霉的回復菌株用示，黃曲霉的野生型菌株用WT表示。黃曲霉AfSumO蛋白(SEQ ID NO: 2)用正體AfSumO表示。
[0020]如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
[0021]如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構成”、“基本上由……構成”、和“由……構成”；“主要由……構成”、“基本上由……構成”和“由……構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0022]因基本上不表達的菌株可以通過各種基因抑制、基因沉默、基因敲除等技術來構建。例如，可以通過基于同源重組的基因敲除技術來將基因從染色體上敲除，從而使得d /s Um O基因缺失；可以針對d /s O基因設計干擾性R N A或反義核苷酸來使Afsumm因表達抑制或沉默。
[0023]作為本發明的一【具體實施方式】，一種使得因缺失的方法是基因敲除技術，所述的的基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，也包括截短形式的的基因(或稱為因片段)，AfSumO蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，也包括截短形式的AfSumO蛋白。只要因片段在被敲除后可導致Af SumO蛋白不表達或表達異常，或其表達的AfSumO蛋白片段活性降低或沒有活性。
[0024]在本發明的一【具體實施方式】中，本發明人通過搜索Aspergillus ComparativeDatabase數據庫，利用生物信息學比較分析，在黃曲霉的基因組序列中發現一個功能未知的新基因，該基因編碼的產物與構巢曲霉的SumO蛋白具有較高的同源性，因此命名為黃曲霉」辦_0基因(圖1)。本發明人體外構建因敲除片段，通過同源重組的方法，把黃曲霉染色體因中的0.9kb DNA同源片段用煙曲霉Arri堪因片段替換，從而敲除染色體上的」/5應0§因。
[0025]AfsumO的缺失使黃曲霉產生的孢子數量減少，黃曲霉毒素AFBI的產量降低，而高表達因則能夠提高產孢數量和AFBl的產量。在種子侵染實驗中，菌株定殖在花生子葉上的長出白色菌絲的時間比WT菌株要晚，產生的孢子和AFBl都明顯減少，而高表達因則能夠使得黃曲霉定殖時間提早，孢子數量和AFBl產量也增加。這些結果表明AfsumO正向調控黃曲霉的產孢、產毒，同時也影響該菌的致病性表現。
[0026]所述的」/5_0基因可以作為一種黃曲霉致病性鑒定的標志物。例如可通過檢測待測黃曲霉中的表達情況來確定黃曲霉的致病性;若相對于野生型黃曲霉，待測黃曲霉基因正常表達或超表達(即相對于野生型黃曲霉，待測黃曲霉中基因的表達高20%或更高，更佳的高50%或更高)，則該黃曲霉具有一般致病性性或高致病性;若相對于野生型黃曲霉，待測黃曲霉因低表達或不表達，則該黃曲霉具有低致病性或無致病性。
[0027]基因還可以作為黃曲霉減毒的靶標。本發明人提供了一種篩選抑制黃曲霉致病性的潛在藥物的方法，即可以在黃曲霉培養體系中添加候選藥物，利用相應抗體檢測黃曲霉體內的Af SumO的表達水平和SUMO化水平的變化，篩選抑制黃曲霉致病性的潛在藥物。
[0028]所述用于分析檢測的相應抗體可以是直接針對AfSumO蛋白或蛋白片段的抗體，也可以是將AfSumO蛋白的N端與小分子多肽標簽進行融合表達后針對小分子多肽標簽的抗體。所述小分子多肽標簽包括:Hi s標簽、HA標簽、F lag標簽、My c標簽、GST標簽、GFP標簽、RFP標簽、mCherry標簽等。
[0029]所述用于分析檢測黃曲霉體內的AfSumO的表達水平和SUMO化水平的變化的方法可以是酶聯免疫吸附法(ELISAfe)，點雜交法和Western blot免疫印跡雜交分析等。
[0030]如果測試組中AfSumO的表達水平和SUMO化修飾水平在統計學上低于(優選顯著低于，較佳的低20%或更低;更佳的低40%或更低;進一步更佳的低60%或更低)對照組，就表明該候選物是抑制黃曲霉的致病性的潛在物質。
[0031]在一具體的實施方式中，所述的方法還包括:對獲得的潛在物質進行進一步的黃曲霉產孢、產毒抑制或種子侵染抑制試驗，以進一步選擇和確定對于抑制黃曲霉致病性有用的物質。
[0032]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆:實驗室指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPreSS，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0033]1.材料和方法
1.總蛋白提取與Western雜交
黃曲霉菌絲加入液氮冷凍后迅速研磨成粉末，按每10mg菌絲粉末加入500 μ?的RIPA裂解液(Beyotime)，加入PMSF至終濃度ImM，混勻后冰上裂解30min，4°C高速離心10 min，收集上清并測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳，用濕法將蛋白條帶轉移到尼龍膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液RT封閉I小時，一抗4°C雜交過夜，用TBST室溫洗膜3次，每次5分鐘，用相應的二抗于室溫結合I小時，再用TBST洗膜3次，每次5分鐘，用ECL試劑顯色。
[0034]2.黃曲霉毒素提取及分析
在YES液體培養基中接種黃曲霉孢子至濃度16個/ml，28 V持續黑暗靜置培養5天，吸取500 μ I液體培養基加入等體積氯仿，振蕩混勻，高速離心5 min，吸取有機相液體，干燥后用200 μ?氯仿重新溶解并取10 μ?點樣，進行薄層層析(TLC)分析。
[0035]3.種子侵染實驗
花生去皮，小心去掉胚芽，將完好的花生子葉置于0.05%次氯酸鈉中浸泡3 min，轉至無菌水中漂洗30 s，70%乙醇浸泡5 S，再用無菌水中漂洗I min，瀝干水后用20 ml孢子溶液(終濃度15個/ml)浸泡花生子葉，空白對照用無菌水浸泡，50 rpm，30 min，每個培養皿放置重量相近的20片子葉，培養皿中鋪三層潤濕的濾紙，28 °C培養3-5天;將侵染后的花生子葉放入裝有10 mL 0.01%吐溫20的孢子洗脫液中，渦旋振蕩I min，取I ml用于孢子計數，其余液加入5 ml丙酮150 rpm, 10 min，室溫靜置5 min，加入5 ml氯仿，150 rpm, 10min，室溫靜置1 min，禍旋混勾，2000 rpm離心15 min，收集下層有機相液體，干燥后用5ml 0.1 M NaCl甲醇:水(55:45)和2.5 mL己烷渦旋混勻I min,2000 rpm離心15 min，收集己烷層，去掉油脂層(中間)，剩余的水相按上述方法再抽提一次，合并收集樣，干燥，用500μ?氯仿重溶，取10 yL點TLC板。
[0036]I1.實施例
實施例1、黃曲霉中因的敲除
為了研究黃曲霉因在黃曲霉形態發生和毒性表現中的功能，首先在黃曲霉中敲除」/5應0§因。
[0037]圖2A顯示了基因敲除的策略。體外構建因敲除片段，通過同源重組的方法，把染色體」/仰《0§因中的0.9 kb DNA片段用jO/Ti?替換，從而敲除染色體上的d/suMiS因。
[0038]具體方法如下:
利用5’ 弓丨物 CCTCTCTGCGTGCTCAAG(SEQ ID NO: 3);和3’ 弓丨物GGGTGAAGAGCATTGTTTGAGGCTAGATATCAACGGGCTGGCSEQ ID NO: 4);從黃曲霉CA14菌株基因組DNA中用PCR的方法擴增約I kb的上游片段；
利用5 ’ 弓丨物 GCCTCAAACAATGCTCTTCACCC( SEQ ID NO: 5);和3’ 弓丨物GTCTGAGAGGAGGCACTGATGCCSEQ ID NO: 6);從煙曲霉基因組DNA中用PCR的方法擴增約1.9kb的基因片段；
利用5’ 引物GCATCAGTGCCTCCTCTCAGACGTCGCCGTACCTAAGTCC(SEQ ID NO: 7);和3’ 引物GAACTCTCCCTCAGTAACCSEQ ID NO: 8);從黃曲霉CA14菌株基因組DNA中用PCR的方法擴增約I kb的下游片段；
將上述三個片段用融合PCR法連接到一起構建敲除片段，導入黃曲霉CA14菌株，在不含尿嘧啶和尿苷的培養基上篩選陽性轉化子。通過敲除片段上、下游各I kb的兩個同源片段與染色體上仰/^基因的上、下游同源片段的同源重組，把染色體上的仰仿堪因給替換掉，從而敲除染色體上的JZ1SUffiC基因。正確插入的轉化子的基因型用Southern雜交技術檢測確定。這些菌株的基因組DNA用PvuII酶切，與探針雜交。雜交結果表明，野生型菌株顯示一條3.2 kb雜交條帶，」^/5聊6^:失株顯示7.4 kb的雜交條帶，Q/?...表達菌株顯示的條帶大小為5.5 kb。圖2B顯示了基因敲除過程中各個菌株Southern雜交分析的圖譜。同時，本發明人還利用半定量qRT-PCR進一步驗證了這些菌株中狀st/M?因的轉錄水平(圖2C)。
[0039 ]實施例2 d/s應O基因的敲除對黃曲霉菌產孢的影響
通過同源重組的方法在黃曲霉中敲除AfsuffiC基因，Southern雜交分析證明敲除是成功的。為了檢測因的缺失是否會影響黃曲霉產孢，本發明人在HM培養基上29 0C的持續光照或黑暗條件下培養6天，觀察以下各個菌株的產孢情況。野生型菌株WT產生了大量綠色的孢子，而」成夬失株產生的綠色孢子數量比WT少很多，數據統計分析也說明了這一點(圖 3A、3B)。
[0040]該結果說明基因的缺失會影響黃曲霉產孢。
[0041 ]實施例基因的敲除對黃曲霉菌產毒的影響
為了檢測因的缺失是否會影響黃曲霉產毒，本發明人在YESSB液體培養基(2%酵母提取物，15%蔗糖，1%大豆蛋白胨，pH 5.5)內接種孢子至終濃度15個/ml，29 V的持續黑暗條件下靜置培養5天，提取毒素，通過HPLC分析各菌株的產毒情況情況。結果表明WT菌株產生了大量的黃曲霉毒素AFBI和AFB2，而AFBI和AFB2的產量明顯下降了，數據統計分析也說明了這一點(圖4A、4B)。
[0042]本發明人同時利用qRT-PCR檢測了黃曲霉毒素生物合成通路調控基因a/77?和aflS,以及部分酶系基因a/U、a/7 C、aflD、a/7併Pa/7/柏轉錄水平，并以18s rDNA作為轉錄分析的內參對照。與WT菌株相比，」失株以上各基因的轉錄水平都下調了，數據趨勢與TLC的結果一致(圖4C)。
[0043]以上結果說明基因的缺失會影響黃曲霉產毒。
[0044]實施例4、」/5—0基因的敲除對黃曲霉致病力的影響
產孢、產毒能力與黃曲霉的致病性密切相關，不能產孢或產毒的菌株其致病性會喪失或大幅下降。
[0045]本發明人構建的夬失株產孢和產毒的能力都有缺陷，于是本發明人通過花生種子侵染試驗來檢測致病性。以野生型菌株WT為陽性對照，以無菌水為空白對照，檢測致病性。
[0046]將去胚后完好的花生子葉用次氯酸鈉和酒精消毒，用20 ml孢子溶液(終濃度15個/ml)浸泡28 °C后黑暗培養5天;將侵染后的花生洗脫孢子計數，并提取黃曲霉毒素進行TLC檢測。WT菌株在侵染花生子葉I天后就定殖產生白色菌絲，侵染5天后能夠產生密集的綠色孢子，相比之下，菌株在侵染花生子葉2天后才定殖產生白色菌絲，侵染5天后產生的大部分仍然為白色菌絲，只有非常少的綠色孢子，孢子個數統計也表明其產孢數量明顯下降(圖5A、5B)。同樣的，WT菌株能夠正常產毒，而的產毒量也明顯減少(圖5C)。這些結果都說明菌株的致病性明顯低于野生型WT菌株。
[0047]因此，AfSumO調控黃曲霉的致病性表現，是一個重要的致病相關因子。
[0048]實施例5、黃曲霉AfSumO表達水平和SUMO化水平檢測系統的建立
為了檢測黃曲霉中Af SumO表達水平和SUMO化水平，本發明人構建了 Af SumO蛋白N端與小分子多肽標簽mCherry融合的菌株《CAeriy-yi/st/ΜΛ用ant1-mCherry的抗體進行Western雜交，檢測Af SumO的表達水平和SUMO化修飾水平。(建議結合附圖對結果進行文字說明)
圖6A顯示了 mCherry-AfSumO融合蛋白表達菌株的構建策略。體外構建包含同源重組片段，替換掉染色體上基因及其啟動子共1.8 kb的片段。
[0049]具體方法如下:
利用5’ 弓I 物 CTGCCAGGTGTTCGCTTC(SEQ ID NO: 9);和3’ 弓I 物GGGTGAAGAGCATTGTTTGAGGCGGTTCTTGACTAGTTGTAAGCSEQ ID NO: 10);從黃曲霉CA14菌株基因組DNA中用PCR的方法擴增約I kb的上游片段；
利用5 ’ 弓丨物 GCCTCAAACAATGCTCTTCACCC( SEQ ID NO: 5);和3’ 弓丨物GTCTGAGAGGAGGCACTGATGCCSEQ ID NO: 6);從煙曲霉基因組DNA中用PCR的方法擴增約1.9kb的基因片段；
利用 5 ’ 引物 GCATCAGTGCCTCCTCTCAGACCATCCGGATGTCGAAGGCTTG(SEQ ID NO: 11);和3 ’引物CTCGCCCTTGCTCACCATGTGATGTCTGCTCAAGCGGGGTAG(SEQ ID NO: 12);從構巢曲霉基因組DNA中用PCR的方法擴增約1.5 kb的砂說啟動子片段；
利用5’ 引物ATGGTGAGCAAGGGCGAG(SEQ ID NO: 13);和3’ 弓I 物GGCACCGGCTCCAGCGCCTGCACCAGCTCCCTTGTACAGCTCGTCCATCSEQ ID NO: 14);從質粒pmCherry-Cl上用PCR的方法擴增約0.7 kb的《CAe_rr/基因片段；
利用5’ 引物GGAGCTGGTGCAGGCGCTGGAGCCGGTGCCATGGCCGATGCAGGACTC(SEQ ID NO:15);和3’引物AATAGCCTATCCACAGCC(SEQ ID NO: 16);從黃曲霉CA14菌株cDNA中用PCR的方法擴增約0.5 kb的d/s應O CftS及下游片段； 將上述五個片段用融合PCR法連接到一起構建《CAeriy-AfsuM?同源重組片段，導入黃曲霉CA14菌株，在不含尿嘧啶和尿苷的培養基上篩選陽性轉化子。通過敲除片段上、下游同源片段與染色體上仰/^基因的上、下游同源片段的同源重組，把染色體上的仰仿堪因給替換掉，從而使黃曲霉表達mCherry-Af SumO融合蛋白。
[0050]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種黃曲霉致病基因，其特征在于:所述基因為AfSimOM因: (1)具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列；或 (2)截短的SEQID NO:1所示的核苷酸序列，且該基因不編碼AfSumO蛋白或編碼降低活性的Af SumO蛋白或蛋白片段。2.如權利要求1所述的種黃曲霉致病基因在篩選抑制黃曲霉的致病性的潛在藥物中的應用。3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，篩選抑制黃曲霉的致病性的潛在藥物的方法包括: (a)在測試組中，在黃曲霉培養體系中添加待篩選的候選物，用相應抗體檢測黃曲霉體內的Af SumO的表達水平和SUMO化修飾水平，并且，在對照組中，在不添加所述候選物的、所述菌株的培養體系中，檢測AfSumO的表達水平和SUMO化修飾水平； (b)將步驟(a)測試組中AfSumO的表達水平和SUMO化修飾水平與對照組中AfSumO的表達水平和SUMO化修飾水平進行比較，如果測試組中Af SumO的表達水平和SUMO化修飾水平在統計學上低于對照組，就表明該候選物是抑制黃曲霉致病性的潛在藥物。
【文檔編號】C12N15/31GK105907771SQ201610467379
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月24日
【發明人】聶鑫怡, 汪世華
【申請人】福建農林大學