專利名稱：：一種防治煙草赤星病的球孢鏈霉菌菌劑及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及生物農藥，更具體地說，本發明涉及一種防治煙草赤星病的菌劑及其制備方法。'
背景技術：
：煙草是我國重要的葉用經濟作物，是病害危害最嚴重的作物之一，從播種到收獲，整個過程都可受到病原物的侵染。煙草赤星病(TobaccoBrownSpotDisease)是煙葉成熟后期重要的葉部病害，在各煙區普遍發生，是我國煙草的主要病害。近年來，我國的湖南、安徽、貴州、云南、陜西、遼寧、浙江、廣東、福建、黑龍江、吉林等省的赤星病也有所發展，成為為害最大的一種葉斑病，一般年份發病率為20%30%，嚴重的發病率達90%、減少產值達50%以上，對產量、.質量影響較大。煙草赤星病是一種典型的氣傳病害，目前國內在防治時主要以保健栽培等農業措施和大劑量的化學農藥等防治措施，缺乏可供區域栽培的抗性品種；多年使用菌核凈進行防治，導致用藥成本在逐年攀升，防治效果在逐步減弱，一些病原真菌已;^i:抗藥性，防治難度也隨之加大。由于化學藥劑極易形成藥害，施藥時也易受雨水的沖刷而失效，而且缺乏高效低毒化學防治藥劑，連續用藥易造成農藥殘留，對環境造成的惡劣影響，污染水源，造成人畜中毒、死亡，同時也使病原菌產生抗藥性，致使其使用受到一定限制。另一方面，煙草赤星病是煙草成熟期病害，由于對煙草安全性的要求越來越高，對煙草栽培本身來說，就提出了更高的要求，特別是對于煙草赤星病這種成熟期病害的防治不大適宜采用有殘留的化學藥劑。這是本領域一個急待解決的技術難題。
發明內容本發明的目的是針對現有技術的不足之處，提供一種有效、無毒、安全、無殘留、使用簡便的防^煙草赤星病的菌劑。同時，本發明還提供一種所述菌劑的制備方法。本發明的目的通過下述技術方案予以實現。A.本發明提供了一種防治煙草赤星病的菌劑，該菌劑采用的放線菌是分類命名為球孢鏈霉菌(5^e/tom;;c"g/o6&/on)AM6,保藏編號為CGMCCNo.1701。本發明的生產菌株球孢鏈霉菌(S加/to附ycesg/oZ^pon)AM6，分離自云南蒙自典型的煙草赤星病病斑上，室內離體葉片懸滴法測定發現100倍帶菌培養液對赤星病的防效均達100%,平皿測定發現AM6100倍帶菌培養液對強致病力病菌的抑制作用為100%,其滅菌濾液的抑制效果為81.8%，其抑菌機理主要是產生拮抗物質，顯微鏡觀察表明AM6能使病菌孢子和菌絲畸變，細胞壁破裂，原生質泄露。該菌株具有以下特征①在高氏一號瓊脂和天門冬素瓊脂上28r培養710天后，菌株AM6基內菌絲無橫隔，不斷裂，無孢囊；氣生菌絲分枝較多；孢子絲直或彎曲，偶叢生；孢子球形或卵圓形，表面光滑。在8種培養基上生長的結果見表1。表l.菌株AM6在8種培養基上的培養特征培養基基內菌絲氣生菌絲可溶色素②全細胞水解液含有LL-二氨基庚二酸(LL-DAP，LL-Diaminopimelicacid),甘氨酸，糖無特征性(糖型C);含有磷脂酰乙醇胺(PE)，磷酸類脂為II型。③具有以下生理生化特性氨酸酶陰性，可在纖維素上生長，產生類黑色素，不產生H2S,液化明膠，胨化牛奶，不凝固牛奶，水解淀粉，還原硝酸鹽，利用L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、半乳糖，不利用甘露糖、棉籽糖、肌醇。葡萄糖天門冬素瓊月！酵母精麥芽精瓊脂高氏合成一號瓊脂蔗糖硝酸鹽瓊脂無機鹽淀粉瓊脂淀粉銨鹽瓊脂土豆浸出瓊脂燕麥粉瓊脂無無無無無無無無黃黃灰灰淺淺白灰綠黃黃米色秸黃黃米米微褐褐棕色色褐黃褐色淺淺無無淺微棕褐B.本發明提供了球孢鏈霉菌(Sfre/tow;;cesg/o6&;oms)AM6生物制劑的制備方法，該法采用以下步驟l.試管種培養試管斜面培養基配方為新鮮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂17-20g，蒸餾水1000ml，pH自然。將球孢鏈霉菌(Sfr印tomycesg/o&s;on^)AM6劃線接種到試管斜面培養基上，在28。C士1。C恒溫培養45天，獲得試管種。2.液體發酵培養液體發酵培養基配方為黃豆粉10.0g,蔗糖20.0g，磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.02g、碳酸錦0.5g、硫酸鎂0.05g、自來水1000ml、pH自然。將每支試管斜面加無菌水5-10ml，用接種環刮下分生孢子，搖勾，形成孢子懸液，以0.2%的體積比接入裝培養液量為40%60%(裝培養液的容積與容器的容積比)的三角瓶中，于28。C士rC恒溫150~200轉/分鐘轉速振蕩培養78天，涂片，鏡檢，產生大量孢子，平板計數測定含孢量，當每毫升含孢量達100億以上時，停止發酵，室溫靜置12小時。3.制劑化球孢鏈霉菌(&w/tom_yc"g/o6Z^orus)AM6的菌劑為液體發酵制劑，制備方法如下發酵靜置后的菌液加入0.5%羧甲基纖維素鈉、0.2%的苯甲酸納、5%的菌核凈，50轉/分鐘轉速漸漸加速攪拌至250轉/分鐘時，恒速連續攪拌15分鐘，膠體磨破碎，過200目流體篩，裝入塑料旋蓋瓶中。該液體發酵制劑保質期1年，施用時需要充分搖勻。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果1.本發明利用生物防治技術，研制成功了一種高效、無毒、安全、無殘留、使用簡便的防治煙草赤星病的菌劑。這對減輕病害危害、減少化學農藥的使用量、減少環境污染、降低農藥殘留都具有良好效果；2.本發明對克服病原真菌的抗藥性，提高煙葉品質，增強煙草農田生態系統穩定性，保障煙草產業的可持續發展具有重要的現實意義和廣闊的應用前景，將會在未來的進出口貿易竟爭中占有有利的地位。保藏生物材料的說明本發明所釆用菌株，已于2006年4月24曰在位于中囯北京中關村的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，分類命名為球孢鏈霉菌(Sfreptow;^"g/06&;70ms)AM6,保藏編號為CGMCCNo.1701。具體實施例方式通過下面給出的具體實施例和應用實施例，可以進一步清楚地了解本發明。但它們不是對本發明保護范圍的限定。實施例l一一液體發酵菌劑制備方法1(1)菌種制備將球孢鏈霉菌(S伊e/tow;;cesg/o6/j/7oms)AM6菌株劃線接種到試管斜面培養基(新鮮馬鈴薯200g,葡萄糖20g，瓊脂17-20g，蒸餾水1000ml，pH自然。)上，在28。C恒溫培養45天，獲得試管種。(2)液體發酵培養將每支試管斜面加無菌水10ml，用接種環刮下分生孢子，搖勻，形成孢子懸液，以0.2%的體積比接入裝有3001111培養液(黃豆粉10.0g,蔗糖20.0g，磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.02g、碳酸鈣0.5g、硫酸鎂0.05g、自來水1000ml、pH自然。)的500ml三角瓶中，于28。C恒溫150~200轉/分鐘轉速振蕩培養7~8天，涂片，鏡檢，產生大量孢子，平板計數測定含孢量，當每毫升含孢量達100億以上時，停止發酵，室溫靜置12小時。(3)制劑化本發明生防菌株球孢鏈霉菌(Sfrepto/^cMg/o6z'57on^)AM6的菌劑為液體發酵制劑，制備方法如下發酵靜置后的菌液加入0.5%羧甲基纖維素鈉、0.2%的苯甲酸納、5%的菌核凈，50轉/分鐘轉速漸漸加速攪拌至250轉/分鐘時，恒速連續攪拌15分鐘，膠體磨破碎，過200目流體篩，裝入250ml塑料旋蓋瓶中。即得本發明的液體菌劑。實施例2一一液體發酵制劑制備方法2(1)菌種制備同實施例1。(2)液體發酵培養分為搖瓶發酵培養和發酵罐發酵培養。搖瓶發酵培養除培養發酵時間縮短至45天外，其余同上例中的液體發酵培養，觀察菌絲較豐、菌絲上新生大量孢子，平板計數測定含孢量，當每亳升含孢量達60億以上，獲得發酵罐母種。再以此為母種按0.2%的體積比接入裝有培養液(黃豆粉10.0g,蔗糖20.0g,磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.02g、碳酸鈣0.5g、硫酸鎂0.05g、自來水1000ml、pH自然。)的發酵罐中，于28。C恒溫150-200轉/分鐘轉速培養6~7天，平板計數測定含孢量，當每亳升含孢量達100億以上時，停止發酵，室溫靜置12小時。(3)制劑化同實施例1。應用實施例1一一菌劑的同田對比試驗1.1材料與方法試驗田塊及管理選取地勢較平整、肥力較一致，往年赤星病高發區田塊。栽培的品種為當地主栽品種，株行距1.0-1.1x0.55-0.60米。除在煙苗移栽成活后，不施用葉面殺真菌劑以外，無特珠要求。其它按當地常規措施進行栽培管理。處理設置本發明菌劑(200倍)、多抗霉素(600倍)、菌核凈(斯佩斯牌，40%可濕性粉劑500倍)、赤斑特(500倍)，l個清水空白對照，共5個處理，每處理面積0.5畝。施藥方法各藥劑在煙草赤星病發病初期(或大田生產發現輕微癥狀出現時)即開始噴藥，用工農16型背負式噴霧器，按試驗設計濃度要求兌水混合均勻，在煙株葉正反面均勻噴霧，隔710天噴1次，共施2次。觀察與記錄分別調查各處理的赤星病病情，在第l次噴霧用藥前l天或當天進行調查，最后一次用藥后的第7天調查1次。調查按(YC/T39-1996)煙草行業標準執行。調查取樣時，按五點取樣，即每個小區五點定株取樣10株作定點調查，以葉片為單位，分別分級調查記載指定葉位葉片的發病情況。計算病情指數和防效。1.2結果與分析不同藥劑的同田對比試驗表明，供試的4種藥劑對煙草赤星病的防治效果有較大的差異。施藥2次后，以菌核凈和本發明菌劑對赤星病的防治效果較好，分別為74.6%和73.6%,以多抗霉素的防效較差，為66.2%。從供試2種生物制劑對赤星病防效的比較表明，本發明菌劑具有較好的開發應用前景見表2。表2.菌劑的的同田對比試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>采用多點小規模推廣方式進行，在紅塔區、蒙自縣、賓川縣、彌勒縣等4地的烤煙種植區生產推廣部門為依托，采用多抗霉素、本發明菌劑統一部署了200畝的試驗示范，并以菌核凈作對照，以同片面積約0.5畝的田塊作空白對照。結果表明，在病害發生不嚴重的前提下，多抗霉素、鏈霉菌制劑與對照藥劑菌核凈差異不顯著，見表3。在認真做好測報的條件下，病情不嚴重時，本發明的菌劑可大面積推廣使用。表3防治煙草赤星病試驗示范效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權利要求1.一種防治煙草赤星病的菌劑，其特征在于該菌劑的生產菌株為球孢鏈霉菌(Streptomycesglobisporus)AM6，保藏號為CGMCCNo.1701。2.根據權利要求1所述的菌劑，所述菌株的液體和固體培養基配方如下①試管斜面培養基配方為新鮮馬鈴薯200g,葡萄糖20g，瓊脂17-20g，蒸餾水1000ml，pH自然；②液體發酵培養基配方為黃豆粉10.0g，蔗糖20.0g，磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.02g、碳酸轉0.5g、硫酸鎂0.05g、自來水1000ml、pH自然。3.—種防治煙草赤星病的菌劑的制備方法，其特征在于釆用以下步驟(1)試管種培養試管.斜面培養基配方為新鮮馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂17-20g,蒸餾水1000ml，pH自然；將球孢鏈霉菌(5^/7tow^^g/oZ^/)AM6劃線接種到試管斜面培養基上，在28°C±rC恒溫培養45天，獲得試管種;-'(2)液體發酵培養液體發酵培養基配方為黃豆粉10.0g,蔗糖20.0g,磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.02g、碳酸鈣0.5g、硫酸鎂0.05g、自來水1000ml、pH自然；將每支試管斜面加無菌水5-10ml，用接種環刮下分生孢子，搖勾，形成孢子懸液，以0.2%的體積比接入裝培養液量為40%~60%(裝培養液的容積與容器的容積比)的三角瓶中，于28。C土1。C恒溫150~200轉/分鐘轉速振蕩培養78天，涂片，鏡檢，產生大量孢子，平板計數測定含孢量，當每毫升含孢量達IOO億以上時，停止發酵，室溫靜置12小時；(3)制劑化球孢鏈霉菌(S^e/tow，yceyg/oZ^/on^)AM6的菌劑為液體發酵制劑，制備方法如下發酵靜置后的菌液加入0.5%羧甲基纖維素鈉、0.2%的苯甲酸納、5%的菌核凈，50轉/分鐘轉速漸漸加速攪拌至250轉/分鐘時，恒速連續攪拌15分鐘，膠體磨破碎，過200目流體篩，裝入塑料旋蓋瓶中；即制得所需的防治煙草赤星病的菌劑。全文摘要本發明公開了一種防治煙草赤星病病害的生物制劑。該生物制劑的生產菌株分類命名為球孢鏈霉菌(Streptomycesglobisporus)AM6，保藏號為CGMCCNo.1701。所述菌株的液體和固體培養基配方如下①試管斜面培養基配方為新鮮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂17-20g，蒸餾水1000ml，pH自然；②液體發酵培養基配方為黃豆粉10.0g，蔗糖20.0g，磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.02g、碳酸鈣0.5g、硫酸鎂0.05g、自來水1000ml、pH自然。本發明經菌株的試管培養，搖床發酵培養，制備為生物制劑。試驗結果表明，本發明提供的生物制劑對煙草赤星病具有良好的防治效果。文檔編號C12R1/465GK101422170SQ20081023350公開日2009年5月6日申請日期2008年10月28日優先權日2008年10月28日發明者宋春滿,方敦煌,鄧云龍,鄧建華申請人:云南省煙草科學研究所