慢性心力衰竭相關的血清miRNA及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及多種內源性的非編碼小RNA的新醫藥用途，更具體地說設及8種 microRNAs在慢性屯、力衰竭疾病的診斷和預后評估中的用途，屬于屯、血管疾病的診斷、預防 和治療領域。
【背景技術】
[0002] 慢性屯、力衰竭是不同的屯、血管疾病發展到終末階段的臨床綜合征，主要病理生理 特點為屯、室充盈和射血能力受損，最后導致屯、室累血功能低下，其預后不良，死亡率高，是 威脅人類健康和導致醫療負擔增加的最主要病因之一，對于人口老齡化日益加重的中國來 說尤為重要。到目前為止，W利尿劑、ACEI和0受體阻滯劑為基礎的治療藥物組合對部分 患者無效或效果不理想，新的治療措施亟待發掘；另一方面，慢性屯、力衰竭的危險因素并未 完全闡明，因此需要尋找新的危險因素和采用更加有效的風險評估方法。
[0003] 微小RNA(microRNA，miRNA)是一類新發現的在多種生物進程中具有重要調控作 用的非編碼RNA，是來源于內源性發夾結構轉錄本的長度大約為22個核巧酸的單鏈RNAs。 通常miRNA作為引導分子，與祀mRNA的3'UTR堿基互補結合，介導基因轉錄后調控。大多 數情況下，miRNA與祀mRNA結合后將抑制蛋白質翻譯并激活核酸外切酶降解mRNA，若miRNA 與祀mRNA高度互補結合則可激活核酸內切酶活性。在復雜的病理生理過程中，miRNA或 miRNAs簇協同參與多級調控是miRNA重要的生物學特征之一；也是針對miRNA的應用治療 的理論基礎之一。與傳統的單祀點藥物治療相比，miRNA治療可W在單個核巧酸分子祀點 治療的情況下，從多個水平調控疾病病理生理狀態，達到更有效的治療效果。
[0004] 已有研究表明miRNAs可被細胞分泌至外周血循環，并穩定存在，可作為各類疾病 的新的診斷標志物。且RNA干擾技術作為具有突破性臨床應用前景的生物技術，從出現開 始的短短數年間就有多個產品進入臨床試驗，獲得了巨大的成功。但是否存在一類miRNAs 在慢性屯、力衰竭診斷和預后評估中具有生物標志物作用，通過檢測該類miRNA能為慢性屯、 力衰竭診斷和預后提供新的策略仍是對該領域科研人員的挑戰。有研究者對慢性屯、力衰 竭患者外周血miRNAs表達譜進行過篩查（Circulation. 2014 ; 129巧）：1009-21 ;Proc化tl AcadSciUSA. 2014:111(30): 11151-6)，也有研究者對慢性屯、力衰竭患者治療前后外周 血miRNAs表達譜進行過檢測巧urJHeart化il. 2013:15(11): 1277-88)，但沒有對相同 患者屯、肌組織和外周血的miRNAs同時進行檢測和比較，且缺乏相應的流行病學隨訪研究。 本發明中，申請人原創性的對相同患者屯、肌組織和外周血的miRNAs同時進行檢測和比較， 并對部分患者的病情發展進行了流行病學隨訪研究。確定了外周血miRNAs表達譜作為慢 性屯、力衰竭疾病診斷和預后生物標志物中的作用。

【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是克服現有理論和技術的不足，確定在慢性屯、力衰竭 中起診斷和預后生物標志物作用的外周血miRNAs。
[0006] 本發明人通過大量的實驗發現，不僅獲得了可w作為生物標志物用于診斷慢性屯、 力衰竭患者外周血miRNAs表達譜，還獲得了慢性屯、力衰竭患者屯、肌miRNAs表達譜。同時， 本發明人發現同一慢性屯、力衰竭患者外周血miRNAs表達譜與其屯、肌中的miRNAs表達譜并 不完全一致，提示單純比較正常人和患者外周血miRNAs將得到非特異性生物標志物。另一 方面，本發明人發現部分外周血miRNAs，例如hsa-miR-665或hsa-miR-660-化，與慢性屯、力 衰竭患者屯、功能呈顯著相關性，不僅可用于診斷，還可作為生物標志物用于提示預后。
[0007] 具體的，本發明提供一種可用于診斷慢性屯、力衰竭患者的miRNAs生物標志物。 [000引優選的，所述外周血miRNAs生物標志物為hsa-miR-4491、hsa-miR-1285-3p、 hsa-miR-665、hsa-miR-660-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-1268b、hsa-miR-130a_3p和 / 或 hsa-miR-330-化，其序列結構分別如SEQ ID No. 1-8所示。
[0009] 本發明還提供一種可用于評估慢性屯、力衰竭預后的外周血miRNAs生物標志物。
[0010] 優選的，所述miRNAs生物標志物為miR-1285-3p、hsa-miR-665和/或 hsa-miR-660-化，其序列結構如SEQ ID No. 2、3和4所示。
[0011] 本發明還提供一種上述miRNAs生物標志物用于評估慢性屯、力衰竭預后的用途。
[0012] 本發明還提供一種用于檢測上述miRNAs序列的試劑，其中，所述序列包括SEQID No. 1，2,3,4,5,6,7 和 / 或8。
[0013] 優選的，所述miRNAs序列為SEQIDNo. 2、3和/或4。
[0014] 優選的，所述的試劑為所述miRNAs序列的逆轉錄引物和擴增引物。
[0015] 更優選的，所述引物根據下列引物設計原則獲得；1)基于莖凸環結構設計的的特 異性逆轉錄引物與miRNA3'端序列結合，在逆轉錄酶作用下進行針對特定miRNA的特異性 逆轉錄反應；2)基于逆轉錄引物序列設計的特異性正向PCR引物、通用反向引物。
[0016] 本發明還提供一種上述試劑在制備診斷或者評估慢性屯、力衰竭患者預后的試劑 盒中的用途。
[0017] 優選的，所述的慢性屯、力衰竭包括先天性屯、臟病、冠屯、病、急性屯、肌梗死、風屯、病、 高血壓、屯、律失常、各種病因導致的屯、肌炎、屯、肌病等病因導致的慢性屯、力衰竭。
[001引本發明還提供一種診斷或者評估慢性屯、力衰竭患者預后的試劑盒，其特征在于， 其中，所述試劑盒包括上述任一所述的試劑。
[0019] 優選的，所述的慢性屯、力衰竭包括先天性屯、臟病、冠屯、病、急性屯、肌梗死、風屯、病、 高血壓、屯、律失常、各種病因導致的屯、肌炎、屯、肌病等病因導致的慢性屯、力衰竭。
【附圖說明】
[0020] 圖1.慢性屯、力衰竭患者外周血miRNAs巧片表達譜及屯、肌miRNAs巧片表達譜分 析；圖1A為屯、肌組織miRNAs巧片表達譜散點圖；圖1B為外周血miRNAs巧片表達譜散點 圖；圖1C為屯、肌組織miRNAs巧片表達譜火山圖；圖1D為外周血miRNAs巧片表達譜火山 圖。
[0021] 圖2.外周血miRNAs巧片表達譜與屯、肌組織miRNAs巧片表達譜比較結果；圖2A 為屯、力衰竭時屯、肌組織巧片中均表達升高的miRNAs的變化值，及其在外周血巧片中的表 達改變情況；圖2B為屯、力衰竭時屯、肌組織巧片中均表達下降的miRNAs的變化值，及其在外 周血巧片中的表達改變情況。
[002引圖3.采用Real-time PCR法驗證巧片篩查結果，其中為八種微小RNA(microRNA，miRNA)在慢性屯、力衰竭和正常對照人群血漿中的相對水平（*表示與對照 組相比，p<0. 05 ;**表示與對照組相比，p<0. 01)。
[002引圖4.8種miRNAs診斷慢性屯、力衰竭的靈敏度。圖4A為ROC值，血漿miRNAs診 斷慢性屯、力衰竭的靈敏度；圖4B為與超聲檢測屯、功能比較的結果，血漿miRNAs含量與屯、臟 超聲射血分數相關性。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但該些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可W對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但該些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0025] 實施例1.慢性屯、力衰竭患者外周血及屯、肌組織miRNAs篩查結果
[0026] 1.收集10例慢性屯、力衰竭（取自2007-2014年在屯、血管內科住院患者，每個 病例均由兩個或W上臨床醫師確診分類）及10例正常對照者外周血樣本。取材后，室 溫3, 50化pm離屯、6min，取上層血漿，保存于-80 °C冰箱。每0. 25ml外周血血漿中加入 1mlTRIZOLLS(Invitrogen公司），提取RNA，RNaseyMiniKit(Qiagen)處理樣品。使用 Nanodrop?ND-1000 檢測RNA質量。miRCURY?ArrayPower1 油elingkit巧xqion)標 記后，在雜交工作站進行雜交實驗。AxonGenePix4000Bmicroarrayscanner掃描獲得 巧片圖像。GenePixproV6.0軟件分析獲得數據，利用microarray技術高通量篩選出在 中差異性表達的miRNA譜。該巧片檢測miRNAs共3100種，篩選出差異性表達miRNAs599 個，其中347個miRNAs在屯、力衰竭患者外周血中表達升高，252個miRNAs在屯、力衰竭患者 外周血中表達下降。
[0027] 2.收集1中慢性屯、力衰竭患者（取自2007-2014年在屯、血管內科住院患者，每個 病例均由兩個或W上臨床醫師確診分類）的屯、肌組織，及10例正常對照者外周血樣本。取 材后，室溫3, 50化pm離屯、6min，取上層血漿，保存于-80 °C冰箱。每0. 25ml外周血血漿中 加入 1mlTRIZOL(Invitrogen公司），提取RNA，RNaseyMiniKit(Qiagen)處理樣品。使 用Nanodrop?ND-1000 檢測RNA質量。miRCURY?ArrayPower1 油elingkit(Exqion) 標記后，在雜交工作站進行雜交實驗。AxonGenePix4000Bmicroarrayscanner掃描獲得 巧片圖像。GenePixproV6.0軟件分析獲得數據，利用microarray技術高通量篩選出在中 差異性表達的miRNA譜。該巧片檢測miRNAs共3100種，篩選出差異性表達miRNAs74個， 其中51個miRNAs在屯、力衰竭患者屯、肌組織中表達升高，23個miRNAs在屯、力衰竭患者屯、肌 組織中表達下降。
[002引結果表明慢性屯、力衰竭時屯、肌組織中miRNAs表達發生改變。
[0029] 實施例2.慢性屯、力衰竭患者外周血miRNAs巧片表達譜及屯、肌miRNAs巧片表達 譜分析
[0030] 采用生物信息學分析方法對獲得的巧片數據進行分析和處理。
[0031] 1.散點圖反應了巧片間或者組間的重復性，重復性越好越靠近對角線。另外使用 化arson相關系數衡量重復性，相關系數越接近1重復性越好。圖1A和1B結果表明；巧片 完成質量可靠，重復性好。
[0032] 2.組間比較的情況見圖1C和1D。W-log(Pvalue)為縱坐標，1〇肖2(化1(1change) 為橫坐標對每一個miRNA作圖，可W直觀地看到顯著性差異的miRNAs(灰色點代表通過 Foldchange和P-value篩選的miRNAs)。圖1C和1D結果表明；miRNAs可作為一類慢性 屯、力衰竭診斷的候選生物標志物。
[0033] 實施例3.外周血miRNAs表達譜與屯、肌組織miRNAs表達譜比較結果
[0034] 將外周血巧片和屯、肌組織巧片篩查獲得的差異性表達的作為慢性屯、力衰竭診 斷的候選生物標志物的所有miRNAs的變化趨勢進行分類。結果表明