本發明屬(shu)于(yu)植物基因工程(cheng)領域，涉及(ji)植物FER基因及(ji)其(qi)編(bian)碼蛋白和應用，特(te)別涉及(ji)大(da)豆bHLH轉錄(lu)因子基因GmFER，其(qi)編(bian)碼蛋白，及(ji)其(qi)在提高酵母及(ji)煙(yan)草(cao)對鎘的耐受性中的應用。

背景技術：

隨著社會的日益發展，非農業建設用地(di)迅速(su)擴張，廢棄物(wu)排放(fang)量以及農業化肥使(shi)用量增加(jia)，土壤重金屬污染逐漸成為(wei)世界(jie)性環境問題(ti)。鎘(Cd)是一(yi)種生(sheng)物(wu)毒性很強的重金屬，半衰期非常長，攝(she)入過量會導致(zhi)腎臟和骨骼的病變(參(can)見Nawrot T.,Plusquin M.,Hogervorst J.,et al.,Environmental exposure to cadmium and risk of cancer:a prospective population-based study[J],Lancet Oncology,2006,7(2):119-126)。

大(da)豆是在農業生(sheng)產上具(ju)有較(jiao)高經(jing)濟價值(zhi)的(de)(de)(de)農作物(wu)(wu)，含有豐富(fu)的(de)(de)(de)蛋白質和油脂，與人類的(de)(de)(de)生(sheng)活息息相關。但(dan)是，大(da)豆極易積累(lei)重金屬(shu)(shu)(參見Wolnik K.A.,Fricke F.L.,Capar S.G.,et al.,Elements in major raw agricultural crops in the United States.1.Cadmium and lead in lettuce,peanuts,potatoes,soybeans,sweet corn,and wheat[J],J.Agric.Food Chem.,1983,31(6):1240-1244)，重金屬(shu)(shu)在植(zhi)物(wu)(wu)體內的(de)(de)(de)大(da)量(liang)積累(lei)，不(bu)僅嚴重影響植(zhi)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)生(sheng)長和發育(yu)，而且會通過食物(wu)(wu)鏈(lian)危及人類的(de)(de)(de)健(jian)康。

bHLH(basic/Helix-Loop-Helix，堿性(xing)/螺旋(xuan)-環-螺旋(xuan))轉錄(lu)因(yin)(yin)子是植(zhi)(zhi)物(wu)轉錄(lu)因(yin)(yin)子中(zhong)最大的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)家族之(zhi)一。同一bHLH轉錄(lu)因(yin)(yin)子中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)兩個(ge)α-螺旋(xuan)之(zhi)間或(huo)者不(bu)同bHLH轉錄(lu)因(yin)(yin)子的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)α-螺旋(xuan)之(zhi)間可(ke)以(yi)相互作用，形成同源(yuan)或(huo)異源(yuan)二(er)聚(ju)體(ti)，與(yu)靶基因(yin)(yin)啟動子結合，調(diao)控(kong)基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉錄(lu)(參(can)(can)見(jian)Ma P.C.M.,Rould M.A.,Weintraub H.,et al.,Crystal structure of MyoDbHLH domain-DNA complex:Perspectives on DNA recognition and implications for transcriptional activation[J],Cell,1994,77(3):451-459)。bHLH廣泛存在于植(zhi)(zhi)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)同組織中(zhong)，在植(zhi)(zhi)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)生長(chang)發育調(diao)控(kong)過程中(zhong)發揮極為重要的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)作用。擬南芥bHLH基因(yin)(yin)(FIT、AtbHLH38和AtbHLH39)參(can)(can)與(yu)了植(zhi)(zhi)物(wu)對Cd脅迫的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)響應(ying)(ying)，組成性(xing)地啟動了一些參(can)(can)與(yu)重金屬區隔化(hua)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基因(yin)(yin)(如HMA3、MTP3、IREG2和IRT2)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表達，從(cong)而(er)將吸收的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)Cd大部分區隔化(hua)在根部，減少了向地上部的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉運(參(can)(can)見(jian)Wu HL,Chen CL,Du J,et al.,Co-Overexpression FIT with AtbHLH38 or AtbHLH39 inArabidopsis-Enhanced Cadmium Tolerance via IncreasedCadmium Sequestration in Roots and Improved Iron Homeostasis of Shoots[J],Plant Physiology,2012,158:790-800)，但至今(jin)尚(shang)未有(you)報(bao)道(dao)披露大豆bHLH轉錄(lu)因(yin)(yin)子基因(yin)(yin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相關應(ying)(ying)用。

技術實現要素：

針對(dui)上述情況，本發明(ming)根(gen)據(ju)同源克(ke)隆(long)的(de)(de)方(fang)法(fa)，從栽(zai)培大豆的(de)(de)根(gen)系中克(ke)隆(long)出一種(zhong)bHLH轉錄因(yin)子基因(yin)GmFER，該基因(yin)對(dui)Cd脅迫(po)有(you)響應。分(fen)離與(yu)克(ke)隆(long)大豆GmFER基因(yin)不僅有(you)利于揭示大豆的(de)(de)抗Cd機制，還可以通過基因(yin)操作的(de)(de)手段(duan)進行微生物(wu)或植(zhi)物(wu)的(de)(de)抗Cd分(fen)子育種(zhong)，以便提(ti)高抗Cd性。

具(ju)體而言，本發明提(ti)供了大豆bHLH轉錄因子基因GmFER，全長972bp，其核苷酸序列(lie)如(ru)SEQ ID NO:1所示(shi)。

本發明還提供了由上述(shu)大豆bHLH轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子基(ji)(ji)因(yin)GmFER編(bian)碼的蛋白，包含323個氨基(ji)(ji)酸(其中從N端第129位(wei)到第185位(wei)的氨基(ji)(ji)酸序(xu)列(lie)為bHLH轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子的保守結構域)，其氨基(ji)(ji)酸序(xu)列(lie)如SEQ ID NO:2所示。

此(ci)外，包含如SEQ ID NO:1所示的(de)(de)核(he)(he)苷酸(suan)序(xu)列(lie)(lie)并且編碼如SEQ ID NO:2所示的(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)序(xu)列(lie)(lie)的(de)(de)多核(he)(he)苷酸(suan)序(xu)列(lie)(lie)以及將如SEQ ID NO:2所示的(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)序(xu)列(lie)(lie)中的(de)(de)一個(ge)(ge)或(huo)多個(ge)(ge)(不多于十個(ge)(ge))氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)殘基(ji)(ji)進(jin)行取代和/或(huo)缺失和/或(huo)添加并且具有轉(zhuan)錄激活功(gong)能、調控植物(wu)抗逆性的(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)序(xu)列(lie)(lie)也(ye)在(zai)本(ben)發明的(de)(de)保護范圍之內。

本發明(ming)還(huan)提供(gong)了包含(han)上(shang)述(shu)大豆bHLH轉錄(lu)因子(zi)基因GmFER的(de)表(biao)達載(zai)體(ti)，所述(shu)表(biao)達載(zai)體(ti)通(tong)過將上(shang)述(shu)大豆bHLH轉錄(lu)因子(zi)基因GmFER插入載(zai)體(ti)而得(de)，所述(shu)載(zai)體(ti)選(xuan)自p424GPD、pBI121、pCXSN、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pAHC25中的(de)任意一種(zhong)。

當使用上(shang)述大豆(dou)bHLH轉錄(lu)(lu)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)子(zi)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)GmFER構(gou)建表達載體時(shi)，在其轉錄(lu)(lu)起始核苷酸前可(ke)(ke)加上(shang)任(ren)何一種組(zu)成型(xing)、組(zu)織特異型(xing)、誘導(dao)型(xing)或(huo)增強型(xing)啟動(dong)子(zi)。為(wei)了便于對轉基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)微(wei)生(sheng)物或(huo)植物進行(xing)(xing)鑒(jian)定及篩(shai)選(xuan)，可(ke)(ke)對所用表達載體進行(xing)(xing)加工，如(ru)加入具有抗(kang)(kang)性的(de)抗(kang)(kang)生(sheng)素(su)標(biao)(biao)記(ji)物(如(ru)卡那霉素(su)標(biao)(biao)記(ji)物、潮霉素(su)標(biao)(biao)記(ji)物等(deng)(deng))、抗(kang)(kang)化(hua)學試劑標(biao)(biao)記(ji)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)(如(ru)抗(kang)(kang)除草劑bar基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)等(deng)(deng))或(huo)可(ke)(ke)產生(sheng)顏(yan)色變化(hua)的(de)酶或(huo)蛋白(如(ru)GUS基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)、GFP基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(yin)等(deng)(deng))等(deng)(deng)。

本(ben)發明還(huan)提(ti)供(gong)了包含(han)上(shang)述大豆(dou)bHLH轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子(zi)基(ji)因(yin)GmFER的工程(cheng)菌(jun)，所述工程(cheng)菌(jun)中的宿主為大腸桿菌(jun)或酵母菌(jun)，通過PEG/LiAc介(jie)導的方法將上(shang)述大豆(dou)bHLH轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子(zi)基(ji)因(yin)GmFER轉(zhuan)入(ru)。

本發明還提供了(le)包(bao)含上述(shu)大(da)(da)豆(dou)(dou)bHLH轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)因子(zi)基(ji)(ji)(ji)因GmFER的轉(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)(ji)因植物(wu)細胞(bao)系(xi)，所述(shu)植物(wu)為煙草，通過農桿菌介導的方法將(jiang)上述(shu)大(da)(da)豆(dou)(dou)bHLH轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)因子(zi)基(ji)(ji)(ji)因GmFER轉(zhuan)(zhuan)入。

本發明還(huan)提供了一對用于擴(kuo)增(zeng)上述(shu)大豆bHLH轉錄因子基因GmFER的(de)引(yin)物(wu)，其中正向引(yin)物(wu)的(de)核苷酸序(xu)列(lie)如(ru)(ru)SEQ ID NO:3所示，反向引(yin)物(wu)的(de)核苷酸序(xu)列(lie)如(ru)(ru)SEQ ID NO:4所示。

本發明還(huan)提供了上(shang)述大(da)豆(dou)bHLH轉錄因子基(ji)因GmFER及(ji)其(qi)(qi)編碼蛋(dan)白和包(bao)含(han)其(qi)(qi)的(de)表達載體在提高酵(jiao)母對Cd的(de)耐(nai)受性中的(de)應用。通過將(jiang)大(da)豆(dou)bHLH轉錄因子基(ji)因GmFER導入(ru)酵(jiao)母中，提高了酵(jiao)母的(de)抗(kang)Cd性。此外，上(shang)述大(da)豆(dou)bHLH轉錄因子基(ji)因GmFER及(ji)其(qi)(qi)編碼蛋(dan)白和包(bao)含(han)其(qi)(qi)的(de)表達載體在提高植物(wu)(優選單(dan)子葉(xie)和雙子葉(xie)植物(wu))對Cd的(de)耐(nai)受性中的(de)應用也在本發明的(de)保護范(fan)圍之(zhi)內。

本發(fa)明提(ti)(ti)(ti)供的(de)(de)大豆bHLH轉錄因(yin)(yin)子基(ji)(ji)因(yin)(yin)GmFER來自大豆(Williams 82品種)，半定量(liang)PCR檢(jian)測結果表(biao)明GmFER基(ji)(ji)因(yin)(yin)主要在大豆的(de)(de)根中表(biao)達。在Cd脅迫后，其表(biao)達量(liang)明顯提(ti)(ti)(ti)高，說(shuo)明該基(ji)(ji)因(yin)(yin)受Cd誘導。在酵(jiao)母中過表(biao)達GmFER基(ji)(ji)因(yin)(yin)能夠提(ti)(ti)(ti)高酵(jiao)母對Cd的(de)(de)耐受性(xing)，并能提(ti)(ti)(ti)高轉GmFER基(ji)(ji)因(yin)(yin)煙草對Cd的(de)(de)耐受性(xing)。因(yin)(yin)此，GmFER基(ji)(ji)因(yin)(yin)可以作為目的(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)導入植(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(包括單子葉和(he)雙子葉植(zhi)(zhi)物(wu)(wu))，從(cong)而提(ti)(ti)(ti)高植(zhi)(zhi)物(wu)(wu)對Cd的(de)(de)耐受性(xing)，具(ju)有較高的(de)(de)應用價值。

附圖說明

圖1為(wei)大豆bHLH轉錄因(yin)子基因(yin)GmFER編碼蛋白與(yu)其(qi)他(ta)植物bHLH結構域的氨基酸序列多重比對(dui)結果，其(qi)中：GmFER-like來(lai)自(zi)大豆，LjbHLH21來(lai)自(zi)百脈根，MtbHLH來(lai)自(zi)蒺藜(li)苜蓿(xu)，AtFER來(lai)自(zi)擬(ni)南芥，AtbHLH來(lai)自(zi)擬(ni)南芥。

圖(tu)2為(wei)GmFER的進化樹(shu)分析(xi)圖(tu)，其中：GmFER-like(Glycine max,XP_003541980.1)；LjbHLH21(Lotus japonicus,ACN21647.1)；MtbHLH(Medicago truncatula,XP_003606331.1)；AtFER-like(Arabidopsis thaliana,NP_850114.1)；AtbHLH(Arabidopsis thaliana,AAM10938.1)；VvFER-like(Vitis vinifera,XP_002272647.1)；SlbHLH(Solanum lycopersicum,NP_001234654.1)；ZmbHLH(Zea mays,DAA38198.1)；BnbHLH(Brassica napus,CAD54298.1)；VvbHLH35(Vitis vinifera,XP_002263999.1)。

圖3為(wei)GmFERmRNA在葉、莖和根中表達(da)豐度(du)的半定量(liang)PCR檢測結(jie)果(guo)。

圖4為采用100μM的CdCl₂處理(li)不同時間后對GmFERmRNA表達(da)影響的半(ban)定量PCR檢(jian)測(ce)結(jie)果。

圖(tu)5為酵母表達載體(ti)的構建示意圖(tu)，其中(zhong)：A為p424GPD空載體(ti)物(wu)理圖(tu)譜(pu)；B為p424GPD::GmFER植物(wu)表達載體(ti)物(wu)理圖(tu)譜(pu)。

圖6為GmFER基因對于酵母對Cd的耐受性的影響的檢測結果。

圖7為pCXSN::GmFER植物表達(da)載體示意圖。

圖8為轉基因煙草在CdCl₂脅迫下的根(gen)長生長情況，其(qi)中：WT表(biao)示野生型煙草，T表(biao)示轉基(ji)因煙草。

具體實施方式

以下(xia)將結合附圖和(he)具體實施(shi)例(li)(li)來(lai)說(shuo)(shuo)明(ming)本發明(ming)的(de)技術(shu)方案(an)。應當理解(jie)的(de)是(shi)，這些實施(shi)例(li)(li)僅(jin)用(yong)于舉例(li)(li)說(shuo)(shuo)明(ming)本發明(ming)，而非以任何(he)方式限制本發明(ming)的(de)范圍(wei)。除非另有說(shuo)(shuo)明(ming)，下(xia)列實施(shi)例(li)(li)中(zhong)所使(shi)用(yong)的(de)術(shu)語(yu)具有本領域(yu)普通技術(shu)人員通常(chang)理解(jie)的(de)含義，未注(zhu)明(ming)的(de)實驗方法均可按(an)照(zhao)(zhao)常(chang)規(gui)(gui)方法進行，例(li)(li)如(ru)參(can)照(zhao)(zhao)J.薩姆布魯克(Sambrook J.)和(he)D.W.拉塞爾(Russell D.W.)著《分子克隆實驗指(zhi)南》(科學(xue)出(chu)版社，2005)或者按(an)照(zhao)(zhao)生物試劑生產廠商的(de)使(shi)用(yong)說(shuo)(shuo)明(ming)中(zhong)記載的(de)條件。另外，下(xia)列實施(shi)例(li)(li)中(zhong)所使(shi)用(yong)的(de)儀器、材料、試劑均可通過常(chang)規(gui)(gui)商業手段獲得。

實(shi)施例1：大豆bHLH轉錄因子(zi)基因GmFER的克(ke)隆(long)。

利用(yong)生物信息學(xue)和常規聚合酶鏈式反應(PCR)相結合的(de)方法克隆大豆GmFER基因的(de)DNA序列，具(ju)體方法如下(xia)所(suo)述：

以Williams 82品種大豆的根系作為實驗材料，采用SV Total RNAlysis試劑盒(Promega公司，美國)提取總RNA。按照TaKaRa公司提供的方法，采用PrimeScript^TM逆轉(zhuan)錄酶(mei)合成(cheng)(cheng)出cDNA，并(bing)以其作為模板進行PCR擴增，PCR擴增過(guo)程中使用的一對引(yin)物(wu)P1(如SEQ ID NO:3所示，由(you)上海生物(wu)工程公司合成(cheng)(cheng))和(he)P2(如SEQ ID NO:4所示，由(you)上海生物(wu)工程公司合成(cheng)(cheng))則根據NCBI中已(yi)知的GmFER序(xu)列進行設計與(yu)合成(cheng)(cheng)：

P1：5’-ATGGATGTTCACGAAGACACACTCA-3’；

P2：5’-TCAAGCAGGAAAAGATGCCACGAAT-3’。

通過RT-PCR方法擴增，獲得GmFER基因完整的開放閱讀框(ORF)片段。25μlPCR反應體系如下：含MgCl₂的(de)10×PCR緩沖液2.5μl，正向、反向引物(wu)各1.0μl(10μM)，dNTP(10mM)1.0μl，cDNA樣品2.0μl，Ex-Taq酶(寶生物(wu)工(gong)程(大連)有限(xian)公(gong)司(si))0.25μl，雙(shuang)蒸水17.5μl。PCR反應條(tiao)件：95℃預變性(xing)5min；95℃變性(xing)30s，58℃復性(xing)45s，72℃延伸1min，30個循(xun)環后，72℃延伸10min。將(jiang)擴(kuo)增(zeng)得到的(de)大約(yue)800bp的(de)DNA片(pian)段進(jin)行瓊脂糖(tang)凝(ning)(ning)膠(jiao)電泳分(fen)離，采用凝(ning)(ning)膠(jiao)回(hui)(hui)收(shou)試劑盒(he)(杭州愛思進(jin)生物(wu)技(ji)術有限(xian)公(gong)司(si))并(bing)按(an)照試劑盒(he)中提供的(de)方(fang)案進(jin)行回(hui)(hui)收(shou)，并(bing)克隆(long)到pEASY-T1(Clontech)載體上(shang)，進(jin)行測序(xu)分(fen)析(由上(shang)海invitrogen公(gong)司(si)完成)，測序(xu)結果和NCBI中的(de)GmFER基因序(xu)列完全相同。

實施例2：GmFER轉錄本(ben)的(de)時空(kong)分(fen)布以及Cd脅(xie)迫對GmFER基(ji)因(yin)表(biao)達的(de)影響(xiang)。

利用半定量(liang)PCR的(de)(de)方法(fa)(fa)，檢測GmFER在大豆植(zhi)株中(zhong)的(de)(de)組(zu)織分布情況，并采取(qu)以下措(cuo)施保(bao)證檢測結果的(de)(de)可(ke)靠(kao)性：利用擴(kuo)增級別DNase I消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)提取(qu)的(de)(de)總(zong)RNA中(zhong)可(ke)能(neng)存在的(de)(de)少量(liang)的(de)(de)基因(yin)組(zu)DNA的(de)(de)污染，為了(le)(le)檢測基因(yin)組(zu)DNA是否(fou)消(xiao)(xiao)(xiao)除干凈，可(ke)以取(qu)出(chu)一(yi)部分用DNase I消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)的(de)(de)總(zong)RNA樣(yang)品進行(xing)常規(gui)PCR反應。當發現沒有擴(kuo)增條帶(dai)產生時(shi)，再進行(xing)反轉(zhuan)錄步驟，同時(shi)為了(le)(le)進一(yi)步驗證實時(shi)定量(liang)PCR擴(kuo)增的(de)(de)條帶(dai)是否(fou)就是GmFER，將PCR產物切膠(jiao)回(hui)收進行(xing)測序。具體方法(fa)(fa)為：取(qu)大豆不同生長時(shi)期根、莖(jing)、葉、花和(he)莢(jia)等(deng)材料提取(qu)總(zong)RNA為模(mo)板，半定量(liang)PCR的(de)(de)引物為P1和(he)P2。

以大豆激動蛋白(GmActin)cDNA作為(wei)內參(can)，半(ban)定量PCR引物P3(如(ru)SEQ ID NO:5所(suo)示(shi)，由上海生(sheng)物工程公(gong)司合成)和P4(如(ru)SEQ ID NO:6所(suo)示(shi)，由上海生(sheng)物工程公(gong)司合成)的核苷酸序列如(ru)下：

P3(actin-F)：5’-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3’；

P4(actin-R)：5’-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3’。

先(xian)取(qu)1μg總RNA，加入擴(kuo)增級別DNase I(Sigma公司(si)，美(mei)國)，于(yu)室溫(wen)放置(zhi)30min以(yi)(yi)除去基(ji)因組DNA的污染，然后(hou)加入停止緩沖液(50mM EDTA)，于(yu)70℃加熱(re)10min變(bian)性(xing)DNase I和RNA，然后(hou)采(cai)用寶生物(wu)工(gong)程(大連(lian))有限(xian)公司(si)的反(fan)(fan)(fan)轉(zhuan)(zhuan)錄試劑盒并(bing)按照試劑盒中(zhong)說明(ming)書記載的方法進(jin)行反(fan)(fan)(fan)轉(zhuan)(zhuan)錄，每個樣(yang)品取(qu)1μg總RNA，于(yu)42℃反(fan)(fan)(fan)應1h，于(yu)70℃加熱(re)10min后(hou)取(qu)出(chu)，置(zhi)于(yu)冰上，以(yi)(yi)使反(fan)(fan)(fan)轉(zhuan)(zhuan)錄酶失(shi)活，最后(hou)取(qu)1μl反(fan)(fan)(fan)轉(zhuan)(zhuan)錄產物(wu)進(jin)行半(ban)定(ding)量PCR擴(kuo)增，檢測結果如圖3所(suo)示，從中(zhong)可以(yi)(yi)看出(chu)GmFER基(ji)因主要在大豆根系中(zhong)表達。

為了研究GmFER基因對Cd脅迫的響應，采用半定量PCR的方法檢測GmFER基因在Cd脅迫下的表達模式。將三葉期大豆以100μM的CdCl₂處理0h、1h、3h和(he)24h，以(yi)未做任何處理的三葉期大豆作為對照，然(ran)后(hou)采用與上述(shu)相同(tong)的方(fang)法檢測(ce)大豆根(gen)系(xi)中(zhong)GmFER基因(yin)的表(biao)達(da)情(qing)況，同(tong)樣以(yi)大豆的actin(激動蛋白)cDNA作為內參(can)，以(yi)P1和(he)P2作為引物，檢測(ce)結果如圖4所示，從(cong)中(zhong)可(ke)以(yi)看(kan)出，在Cd脅迫后(hou)，大豆根(gen)系(xi)中(zhong)GmFER的表(biao)達(da)量表(biao)現出先下(xia)降后(hou)上升(sheng)的趨勢(shi)。

實施(shi)例3：包含GmFER基因的(de)酵母(mu)表達載(zai)體的(de)構建以(yi)及(ji)轉基因酵母(mu)對Cd的(de)耐受性檢測。

(1)酵母(mu)表達載(zai)體的構建：

以GmFERcDNA全長序(xu)列(lie)為模板，在(zai)含有(you)酶(mei)切位(wei)(wei)點的正向引(yin)物(wu)(wu)P5(如(ru)SEQ ID NO:7所示(shi)(shi)，由上(shang)海生物(wu)(wu)工程(cheng)公(gong)司合(he)成)和反向引(yin)物(wu)(wu)P6(如(ru)SEQ ID NO:8所示(shi)(shi)，由上(shang)海生物(wu)(wu)工程(cheng)公(gong)司合(he)成)的引(yin)導下(xia)，PCR擴增5’端添加(jia)BamHI識(shi)別位(wei)(wei)點、3’端添加(jia)SmaI識(shi)別位(wei)(wei)點的GmFERcDNA全長序(xu)列(lie)，引(yin)物(wu)(wu)的核(he)苷酸序(xu)列(lie)如(ru)下(xia)：

P5：5′-CGCGGATCCATGGATGTTCACGAAGACACACTCA-3′(帶下劃線(xian)的堿基(ji)為限制內切酶BamHI識別位點)；

P6：5′-TCCCCCGGGTCAAGCAGGAAAAGATGCCACGAAT-3′(帶下劃線的(de)堿基為(wei)限(xian)制內切(qie)酶SmaI識別(bie)位點)。

反應結束后，對PCR擴增產物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化972bp的目的片段，將其用BamHI和SmaI酶切后，與經相同酶雙酶切的載體p424GPD采用T₄DNA連接酶于4℃連接過夜(20μl反應體系含1×T₄DNA連接酶緩沖液，p424GPD片段0.03pmol，GmFER片段0.3pmol，T₄DNA連接酶350U)。

將連接產物轉化大腸(chang)桿菌DH5α感受態細(xi)胞(轉化方法參照《分(fen)子克隆(long)實驗指(zhi)南(nan)》第二版，1992，科(ke)學出版社，第55～56頁)，將轉化后的(de)(de)大腸(chang)桿菌DH5α細(xi)胞懸液(ye)涂布在含有(you)80mg/L氨芐青霉素(su)的(de)(de)平(ping)板上，將對抗氨芐青霉素(su)的(de)(de)陽性克隆(long)進行(xing)擴增并提取質粒，采取酶切和測序的(de)(de)方法驗證連接的(de)(de)正確性，得到酵母表(biao)達載(zai)體(ti)p424GPD::GmFER(如圖5所示)。

(2)PEG/LiAc法介導的(de)酵母轉(zhuan)化(hua)與(yu)篩選鑒(jian)定：

采用PEG/LiAc法轉化酵母細胞W303B，涂布在缺色氨酸(-Trp)的SD固體培養基上，于30℃培養3d，從培養平板中挑取單克隆進行PCR檢測，采用引物P1和P2，25μl PCR反應體系如下：含MgCl₂的(de)10×PCR緩沖(chong)液2.5μl，正向、反(fan)向引物各(ge)1.0μl(10μM)，dNTP 1.0μl(10mM)，基因(yin)組DNA模(mo)板1.0μl，雙(shuang)蒸水18.5μl，以及Ex-Taq酶(寶(bao)生物工程(大連)有限公司(si))0.25μl。擴(kuo)增(zeng)反(fan)應條件如下(xia)：95℃預變性4min，95℃變性30s，62℃復性50s，72℃延伸1min，35次循環后，72℃延伸min。將擴(kuo)增(zeng)產物進行凝膠電泳(yong)，在鑒定(ding)的(de)9個單(dan)克隆中有3個陽性轉p424GPD::GmFER的(de)單(dan)克隆，得到含有p424GPD::GmFER的(de)酵母菌株。

(3)基因功能分析：

把含有p424GPD::GmFER表達載體的酵母及帶有空載體p424GPD的酵母分別以1％的接種量接種于100ml缺色氨酸(-Trp)的SD液體培養基中培養過夜，直至OD600＝1，用SD(-Trp)液體培養基進行稀釋至OD600＝0.1、0.01、0.001，分別滴在含有50μMCdCl₂和不含有CdCl₂的SD(-Trp)固體(ti)培(pei)養(yang)基(ji)上，于30℃培(pei)養(yang)3d，觀察菌落的生長情況，其結果(guo)如(ru)圖6所示。

從圖6中可以看出，在含有50μM CdCl₂的培養基上，含有p424GPD::GmFER表達載體的酵母明顯比帶有空載體p424GPD的酵母生長得好，帶空載體p424GPD的酵母菌株在含有50μM CdCl₂的培養基上幾(ji)乎(hu)不能(neng)生長(chang)。由(you)此可見，GmFER基因能(neng)夠提高酵母對Cd的耐受性(xing)。將GmFER基因作為(wei)目的基因導入(ru)植物(包括單子葉和雙子葉植物)也可以(yi)提高植物對Cd的耐受性(xing)，具有較(jiao)高的應用價(jia)值。

實施例4：包含GmFER基因(yin)的(de)植物表達載(zai)體的(de)構(gou)建以(yi)及轉基因(yin)煙草對(dui)Cd的(de)耐受性檢測。

(1)植物表達載體的構建：

以GmFERcDNA全長序列(lie)為模板，通(tong)(tong)過(guo)P和(he)P2進行PCR擴(kuo)增(zeng)。反應結束(shu)后，對PCR擴(kuo)增(zeng)產物進行1.0％瓊脂(zhi)糖凝膠電泳檢測，回(hui)收并純化972bp的目的片段(duan)，通(tong)(tong)過(guo)TA克隆的方法，把GmFER的ORF連接到植物表達(da)載體pCXSN。

將連接產(chan)物轉(zhuan)化大腸桿菌(jun)DH5α感(gan)受態細胞(bao)(轉(zhuan)化方(fang)法(fa)參照《分子克隆實驗(yan)指(zhi)南》第二版(ban)，1992，科學出版(ban)社，第55～56頁)，將轉(zhuan)化后(hou)的(de)(de)(de)大腸桿菌(jun)DH5α細胞(bao)懸液涂布在含(han)(han)有(you)80mg/L卡那霉毒(du)(du)的(de)(de)(de)平板(ban)上，將卡那霉毒(du)(du)的(de)(de)(de)陽性克隆進行擴增并提取質粒，采(cai)取測序(xu)的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)驗(yan)證連接的(de)(de)(de)正確性，得(de)到植物表達載(zai)體pCXSN::GmFER(如圖7所(suo)示)。采(cai)用凍融轉(zhuan)化法(fa)將此載(zai)體轉(zhuan)化根癌農桿菌(jun)EH105，得(de)到含(han)(han)有(you)pCXSN::GmFER的(de)(de)(de)農桿菌(jun)菌(jun)株(zhu)。

(2)農桿菌介導的煙草轉化與(yu)篩選鑒定：

從培養平板中挑取單個農桿菌菌落，在2ml YEB培養基(含有50mg/L卡那霉素、30mg/L利福平)中培養過夜；以1％的接種量接種于100ml YEB培養基(含有50mg/L卡那霉素、30mg/L利福平)中培養過夜，6000rpm離心收集菌體，用侵染培養基重新懸浮，菌液濃度調整至OD₆₀₀約為0.5，作為侵染菌液。采用葉圓盤轉化法，用無菌刀片將無菌煙草試管苗葉片切成4～6mm的葉盤，葉盤外植體在OD₆₀₀約0.5的(de)(de)(de)pCXSN::GmFER農桿菌(jun)侵(qin)染溶液中(zhong)感(gan)染10min，取出(chu)后(hou)用(yong)無(wu)菌(jun)濾(lv)紙(zhi)吸干表(biao)面(mian)液體，放入含有(you)共培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)液(MS基(ji)(ji)(ji)本(ben)(ben)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)加(jia)6-芐(xia)氨(an)基(ji)(ji)(ji)嘌呤(ling)1.0mg/L、萘(nai)乙酸0.1mg/L、蔗糖30g/L，pH＝5.8)的(de)(de)(de)濾(lv)紙(zhi)上黑暗條件(jian)下，25℃共培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)2天(tian)。經共培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)2天(tian)的(de)(de)(de)葉盤(pan)用(yong)含有(you)500mg/L的(de)(de)(de)羧(suo)芐(xia)青霉素水(shui)溶液洗滌3次，用(yong)無(wu)菌(jun)濾(lv)紙(zhi)吸干表(biao)面(mian)液體轉(zhuan)(zhuan)入篩(shai)選(xuan)分化(hua)(hua)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)中(zhong)，25℃光(guang)照培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)。轉(zhuan)(zhuan)化(hua)(hua)體的(de)(de)(de)篩(shai)選(xuan)在(zai)篩(shai)選(xuan)分化(hua)(hua)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(MS基(ji)(ji)(ji)本(ben)(ben)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)加(jia)6-芐(xia)氨(an)基(ji)(ji)(ji)嘌呤(ling)1.0mg/L、萘(nai)乙酸0.1mg/L、卡(ka)那(nei)(nei)霉素80mg/L、羧(suo)芐(xia)青霉素400mg/L、蔗糖30g/L，pH＝5.8)中(zhong)進(jin)行。待葉片邊緣長出(chu)叢生(sheng)再(zai)生(sheng)芽至2～3cm時，用(yong)解(jie)剖刀將再(zai)生(sheng)芽切下，并(bing)轉(zhuan)(zhuan)入生(sheng)根培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)(MS基(ji)(ji)(ji)本(ben)(ben)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)基(ji)(ji)(ji)加(jia)卡(ka)那(nei)(nei)霉素50mg/L、蔗糖20g/L，pH＝5.8)中(zhong)培(pei)(pei)(pei)養(yang)(yang)(yang)(yang)25天(tian)。轉(zhuan)(zhuan)化(hua)(hua)細胞再(zai)生(sheng)的(de)(de)(de)植株具有(you)卡(ka)那(nei)(nei)霉素抗性，為正常綠色植株，獲得轉(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)(ji)因植株。

提取pCXSN::GmFER轉基因煙草基因組DNA，以基因組DNA為模板進行PCR反應。將擴增產物進行凝膠電泳，并回收PCR產物進行測序。為了進一步鑒定轉基因植株，提取通過基因組檢測為陽性的轉pCXSN::GmFER煙草葉片總RNA，用1μg葉片總RNA經反轉錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)按試劑盒的方法反轉錄得到的cDNA為模板，PCR引物為實例4中的引物P1和P2，25μl PCR反應體系含2.5μl含MgCl₂的(de)10×PCR緩沖(chong)液、正、反向(xiang)10μM的(de)引物(wu)(wu)各1.0μl、1.0μl 10mM的(de)dNTP(脫氧核(he)苷酸混合物(wu)(wu))、1.0μl cDNA模板和18.5μl雙蒸水，以及0.25μl rTaq酶(寶生物(wu)(wu)工(gong)程(大連)有(you)限公司)。擴增反應(ying)條件如(ru)下：95℃預變性4min，95℃30s，55℃50s，72℃1min，33次循(xun)環，72℃延伸10min。將(jiang)擴增產物(wu)(wu)進(jin)行凝膠電(dian)泳，獲得GmFER基因進(jin)行正常表達的(de)轉(zhuan)基因植(zhi)株。

(3)基(ji)因(yin)功能分(fen)析：

將轉基因煙草T0代種子及野生型種子在濾紙上進行萌發，28℃的光照培養箱中培養，10天后，取出大小生長一致的轉GmFER基因陽性煙草苗與對照煙草苗，將其分別轉移至含有50μM CdCl₂的濾紙(zhi)上，在28℃的光照培養(yang)箱中培養(yang)，處理(li)4天(tian)后，測量根長，其結果如圖8所示。結果顯示，GmFER基因(yin)在煙(yan)草(cao)中的過(guo)量表(biao)達能夠提高煙(yan)草(cao)轉(zhuan)基因(yin)植株對Cd脅迫的抗性。