一種血管緊張素受體拮抗劑和nep抑制劑的復合物中雜質的分離方法
【專利摘要】本發明提供了一種血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中雜質的分離方法，包括：采用高效液相色譜法對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的藥物組合物進行雜質分離；所述高效液相色譜法中的流動相包括水相和有機相；所述水相包括磷酸鹽緩沖液、三氟乙酸溶液或甲酸溶液；所述有機相包括有機混合物或乙腈，所述有機混合物包括乙腈和甲醇；所述水相和有機相的體積比為(45％～65％)：(55％～35％)。本發明采用高效液相色譜法進行雜質分離，在高效液相色譜過程中選用的流動相包括特定成分的水相和有機相，采用這種流動相能夠有效地分離出血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中的多種雜質。
【專利說明】
一種血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中雜質 的分離方法
技術領域
[0001] 本發明涉及血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物技術領域，尤其涉及一 種血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中雜質的分離方法。
【背景技術】
[0002] 血管緊張素受體阻斷劑（ARBs，血管緊張素 II拮抗劑）能夠通過阻止血管緊張 素 II與其在血管壁上的受體結合，從而導致血壓降低。由于能夠抑制ATI受體，所以此 類拮抗劑可以用于抗高血壓，或者用于治療充血性心衰以及其它適應癥。中性內肽酶（EC 3. 4. 24. 11 ;腦啡肽酶；atriopeptidase ;NEP)為含鋅的金屬蛋白酶，它能夠裂解各種疏水 殘基的氨基端上的肽底物，NEP抑制劑（中性內肽酶抑制劑，NEPi)能夠降低ANP的血漿 水平，因而能夠促尿鈉排泄和具有利尿作用。血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑復合物 ([3- ((1S，3R) -1-聯苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1- 丁基氨甲酰基）丙酸-(S) -3' -甲 基-2'_(戊酰基{2"_(四唑-5-基）聯苯-4'-基甲基}氨基）丁酸]三鈉半五水合物） 是一種具有雙重作用的復合物，具有式I所示的結構：
[0004] 血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑復合物具有廣泛的臨床推廣價值。
[0005] 由于血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物藥物產品從合成起始物料到 終產品，期間每一過程都可能產生雜質，如生產過程中可能帶入起始原料、試劑、中間體和 副產物等雜質，這些雜質對產品質量產生很大影響。因此，為了保證藥物的安全有效，對藥 物中各個雜質的分離具有重要意義。
[0006] 目前，還未見關于血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑復合物中雜質分離的相關 報道。

【發明內容】

[0007] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑復合 物中雜質的分離方法，本發明提供的方法能夠有效的分離血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑 制劑復合物中的多種雜質。
[0008] 本發明提供了一種血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中雜質的分離 方法，包括：
[0009] 采用高效液相色譜法對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的藥物組合物進行 雜質分離；
[0010] 所述高效液相色譜法中的流動相包括水相和有機相；
[0011] 所述水相包括磷酸鹽緩沖液、三氟乙酸溶液或甲酸溶液；
[0012] 所述有機相包括有機混合物或乙腈，所述有機混合物包括乙腈和甲醇；
[0013] 所述水相和有機相的體積比為（45%~65% ) : (55%~35% )。
[0014] 優選的，所述磷酸鹽緩沖液的摩爾濃度為25mmol/L~45mmol/L。
[0015] 優選的，所述三氟乙酸溶液的體積濃度為0. 05%~0. 15%。
[0016] 優選的，所述甲酸溶液的體積濃度為0.05%~0.15%。
[0017] 優選的，所述有機混合物中的乙腈和甲醇的體積比為（50~60) : (50~40)。
[0018] 優選的，所述高效液相色譜法中的水相和有機相的體積比為（50%~60% ): (50%~40% )。
[0019] 優選的，所述高效液相色譜法中的流動相流速為0. 5mL/min~1. 5mL/min。
[0020] 優選的，所述高效液相色譜法中的柱溫為25°C~45°C。
[0021] 優選的，所述高效液相色譜法中的色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷 基硅烷鍵合硅膠。
[0022] 優選的，所述高效液相色譜法中的檢測波長為240nm~260nm。
[0023] 本發明提供的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中雜質的分離方法 采用高效液相色譜法進行雜質分離，在高效液相色譜過程中選用的流動相包括特定成分的 水相和有機相，采用這種流動相能夠有效地分離出血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的 復合物中的多種雜質。實驗結果表明，采用本發明提供的雜質分離方法得到的血管緊張素 受體拮抗劑和NEP抑制劑復合物純品中單種雜質的質量含量< 0. 1 %。
[0024] 此外，本發明提供的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中雜質的分離 方法工藝簡單、重現性好，這種分離方法準確可靠。
【附圖說明】
[0025] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發明的實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據 提供的附圖獲得其他的附圖。
[0026] 圖1為本發明實施例1提供的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物的制 備工藝的流程圖；
[0027] 圖2為本發明實施例1制備得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物 的核磁共振譜圖；
[0028] 圖3為本發明實施例2提供的方法對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合 物中雜質進行分離后得到的色譜圖；
[0029] 圖4為本發明實施例3提供的方法對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合 物中雜質進行分離后得到的色譜圖；
[0030] 圖5為本發明實施例4提供的方法對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合 物中雜質進行分離后得到的色譜圖；
[0031] 圖6為本發明比較例1提供的方法對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合 物中雜質進行分離后得到的色譜圖。
【具體實施方式】
[0032] 下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通 技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范 圍。
[0033] 本發明提供了一種血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中雜質的分離 方法，包括：
[0034] 采用高效液相色譜法對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的藥物組合物進行 雜質分離；
[0035] 所述高效液相色譜法中的流動相包括水相和有機相；
[0036] 所述水相包括磷酸鹽緩沖液、三氟乙酸溶液或甲酸溶液；
[0037] 所述有機相包括有機混合物或乙腈，所述有機混合物包括乙腈和甲醇；
[0038] 所述水相和有機相的體積比為（45 %~65 % ) : (55 %~35 % )。
[0039] 本發明采用高效液相色譜法將血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物進 行雜質分離。在本發明中，所述血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物為[3_((1S， 3R)-1-聯苯-4-基甲基-3-乙氧基羰基-1- 丁基氨甲酰基）丙酸_(S)-3' -甲基-2'-(戊 酰基{2"_(四唑-5-基）聯苯-4' -基甲基}氨基）丁酸]三鈉半五水合物，具有式I所 示的結構：
[0041] 本發明對所述血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物的來源沒有特殊的 限制，可由市場購買獲得，也可按本領域技術人員熟知的方法制備得到，如可按照申請號為 200680001733. 0的中國專利"血管緊張素受體拮抗劑和NEP的抑制劑的藥物組合產品"所 公開的方法制備得到。在本發明的實施例中，所述血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑復 合物的制備方法為：
[0042] 將具有式1所示結構的化合物、纈沙坦和氫氧化鈉進行反應，得到血管緊張素受 體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物：
[0043]
[0044] 在本發明的實施例中，所述式1所示結構的化合物、纈沙坦和氫氧化鈉反應的溫 度為20°C~30°C。在本發明的實施例中，所述式1所示結構的化合物、纈沙坦和氫氧化鈉 反應的時間為l〇h。在本發明的實施例中，所述式1所示結構的化合物、纈沙坦和氫氧化鈉 的摩爾比為1:1:3。在本發明的實施例中，所述式1所示結構的化合物的制備方法為：
[0045] 將具有式2所示結構的化合物和鹽酸進行反應，得到具有式1所示結構的化合 物：
[0046]
[0047] 在本發明的實施例中，所述式2所示結構的化合物和鹽酸反應的溫度為20°C~ 30°C。在本發明的實施例中，所述式2所示結構的化合物和鹽酸反應的時間為2h。在本發 明的實施例中，所述式2所示結構的化合物和鹽酸的摩爾比比為1:3。在本發明的實施例 中，所述式2所示結構的化合物的制備方法為：
[0048] 將具有式3所示結構的化合物和氯化鈣進行反應，得到具有式2所示結構的化合
[0050] 在本發明的實施例中，所述式3所示結構的化合物和氯化鈣反應的溫度為60°C~ 物：
[0049] 70°C。在本發明的實施例中，所述式3所示結構的化合物和氯化鈣反應的時間為2h。在本 發明的實施例中，所述式3所示結構的化合物和氯化鈣的摩爾比為1:1。在本發明的實施例 中，所述式3所示結構的化合物的制備方法為：
[0051] 將具有式4所示結構的化合物和氫氧化鈉在水中進行反應，得到式4所示結構的 化合物：
[0052]
[0053] 在本發明的實施例中，所述式4所示結構的化合物和氫氧化鈉反應的溫度為 20°C~30°C。在本發明的實施例中，所述式4所示結構的化合物和氫氧化鈉反應的時間為 lh。在本發明的實施例中，所述式4所示結構的化合物和氫氧化鈉的摩爾比為1:2。本發明 對式4所示結構的化合物的來源沒有特殊的限制，可由市場購買獲得，也可按照本領域技 術人員熟知的方法制備得到。
[0054] 在本發明的實施例中，所述血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中的雜 質為式a~式〇中的一種或幾種：
[0055]

[0057] 在本發明中，所述高效液相色譜法以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不 同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相栗入裝有固定相的色譜柱，在 柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分離分析。
[0058] 在本發明中，所述高效液相色譜法中的流動相包括水相和有機相。在本發明的實 施例中，所述水相包括磷酸鹽緩沖液、三氟乙酸溶液或甲酸溶液。在本發明的實施例中，所 述磷酸鹽緩沖液的摩爾濃度為25mmol/L~45mmol/L ;在其他的實施例中，所述磷酸鹽緩 沖液的摩爾濃度為30mmol/L~40mmol/L ;在另外的實施例中，所述磷酸鹽緩沖液的摩爾濃 度為32mmol/L~38mmol/L ;在另外的實施例中，所述磷酸鹽緩沖液的摩爾濃度為34mmol/ L~36mmol/L ;在另外的實施例中，所述磷酸鹽緩沖液的摩爾濃度為35mmol/L。
[0059] 在本發明的實施例中，所述三氟乙酸溶液的體積濃度為0. 05%~0. 15% ;在其他 的實施例中，所述三氟乙酸溶液的體積濃度為〇. 08 %~0. 12 %;在另外的實施例中，所述三 氟乙酸溶液的體積濃度為0. 1 %。在本發明的實施例中，所述三氟乙酸溶液為三氟乙酸的水 溶液。
[0060] 在本發明的實施例中，所述甲酸溶液的體積濃度為0. 05%~0. 15% ;在其他的實 施例中，所述甲酸溶液的體積濃度為〇. 08 %~0. 12 %;在另外的實施例中，所述甲酸溶液的 體積濃度為〇. 1%。在本發明的實施例中，所述甲酸溶液為甲酸的水溶液。
[0061] 在本發明中，所述有機相包括有機混合物或乙腈，所述有機混合物包括乙腈和甲 醇。在本發明的實施例中，所述有機混合物中的乙腈和甲醇的體積比為（50~60) : (50~ 40);在其他的實施例中，所述有機混合物中的乙腈和甲醇的體積比為（52~58) :(48~ 42);在另外的實施例中，所述有機混合物中的乙腈和甲醇的體積比為（54~56) :(46~ 44);在另外的實施例中，所述有機混合物中的乙腈和甲醇的體積比為55 :45。
[0062] 在本發明的實施例中，所述高效液相色譜法中的水相和有機相的初始體積比為 (45%~65% ) : (55%~35% );在其他的實施例中，所述高效液相色譜法中的水相和有機 相的初始體積比為（50%~60%) : (50%~40%);在另外的實施例中，所述高效液相色譜 法中的水相和有機相的初始體積比為（52%~58%) : (48%~42%);在另外的實施例中， 所述高效液相色譜法中的水相和有機相的初始體積比為（54%~56%) : (46%~44%); 在另外的實施例中，所述高效液相色譜法中的水相和有機相的初始體積比為50 :50。
[0063] 在本發明的實施例中，所述高效液相色譜法中的流動相流速為0. 5mL/min~ 1. 5mL/min ;在其他的實施例中，所述高效液相色譜法中的流動相流速為0. 8mL/min~ 1. 2mL/min ;在另外的實施例中，所述高效液相色譜法中的流動相流速為lmL/min。
[0064] 在本發明的實施例中，可以采用梯度洗脫的方法使流動相通過色譜柱，所述梯度 洗脫的方法具體為：
[0065] 在0~35min，水相在流動相中的體積含量由45 %~55 %降低到5 %~15 %，有機 相在流動相中的體積含量有45 %~55 %增加到85 %~95% ;
[0066] 在35min~45min，水相在流動相中的體積含量保持5 %~15 %，有機相在流動相 中的體積含量保持85 %~95 %。
[0067] 在其他的實施例中，所述梯度洗脫的方法具體為：
[0068] 在0~35min，水相在流動相中的體積含量由48 %~52 %降低到8 %~12 %，有機 相在流動相中的體積含量有48 %~52 %增加到88 %~92% ;
[0069] 在35min~45min，水相在流動相中的體積含量保持8 %~12 %，有機相在流動相 中的體積含量保持88 %~92 %。
[0070] 在另外的實施例中，所述梯度洗脫的方法具體為：
[0071 ] 在0~35min，水相在流動相中的體積含量由50 %降低到10 %，有機相在流動相中 的體積含量有50 %增加到90% ;
[0072] 在35min~45min，水相在流動相中的體積含量保持10 %，有機相在流動相中的體 積含量保持90 %。
[0073] 在本發明的實施例中，所述高效液相色譜法中的柱溫為25°C~45°C ;在其他的實 施例中，所述高效液相色譜法中的柱溫為30°C~40°C;在另外的實施例中，所述高效液相色 譜法中的柱溫為35 °C。
[0074] 在本發明的實施例中，所述高效液相色譜法中的色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵 合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠；在其他的實施例中，所述高效液相色譜法中的色譜柱填充 劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠。
[0075] 在本發明的實施例中，所述高效液相色譜法中的檢測波長為240nm~260nm ;在其 他的實施例中，所述高效液相色譜法中的檢測波長為245nm~255nm ;在另外的實施例中， 所述高效液相色譜法中的檢測波長為250nm。
[0076] 在本發明的實施例中，所述血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中雜質 的分離方法為：
[0077] 采用高效液相色譜法對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的藥物組合物進行 雜質分離；
[0078] 所述高效液相色譜法中的流動相包括摩爾濃度為35mmol/L的磷酸鹽緩沖液和體 積比為55 :45的乙腈和甲醇的混合液；
[0079] 所述高效液相色譜法中磷酸鹽緩沖液和乙腈和甲醇的混合液的初始體積比為50 : 50 ；
[0080] 所述高效液相色譜法中的流動相流速為lmL/min ;
[0081] 所述高效液相色譜法中的柱溫為35°C ;
[0082] 所述高效液相色譜法中色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；
[0083] 所述高效液相色譜法中的檢測波長為250nm ;
[0084] 采用梯度洗脫的方法使流動相通過色譜柱，所述梯度洗脫的方法具體為：
[0085] 在0~35min，水相在流動相中的體積含量由50 %降低到10 %，有機相在流動相中 的體積含量有50 %增加到90% ;
[0086] 在35min~45min，水相在流動相中的體積含量保持10 %，有機相在流動相中的體 積含量保持90 %。
[0087] 采用本發明提供的方法對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物進行雜 質分離，采用高效液相色譜方法，測試分離后得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑 的復合物純品中的雜質含量；檢測結果為，本發明提供的雜質分離方法得到的血管緊張素 受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物純品中單種雜質的質量含量< 0. 1%，本發明提供的血 管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中雜質分離的方法具有較好的效果。
[0088] 按照《中國藥典》2015年版第四部通則0512高效液相色譜方法，測試本發明提供 的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中雜質分離的方法的重現性，通過統計雜 質保留時間重現性和峰面積重現性結果可知，本發明提供的血管緊張素受體拮抗劑和NEP 抑制劑的復合物中雜質分離的方法具有較好的重現性，方法準確可靠。
[0089] 實施例1
[0090] 按照圖1所示的流程圖制備血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物，圖1 為本發明實施例1提供的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物的制備工藝的流程 圖：
[0091 ] 具有式4所示結構的化合物為市售產品。
[0092] 將10g的具有式4所示結構的化合物和1. 9g的氫氧化鈉在水中在20~30°C下進 行1小時的反應，得到具有式3所示結構的化合物；
[0093] 將10g的具有式3所示結構的化合物和2. 6g的氯化鈣在60~70°C下進行2小時 的反應，得到具有式2所示結構的化合物；
[0094] 將15g的具有式2所示結構的化合物和52g的1N鹽酸在20~30°C下進行2小時 的反應，得到具有式1所示結構的化合物；
[0095] 將10g的具有式1所示結構的化合物、10. 6g的纈沙坦和2. 9g的氫氧化鈉在 20-30°C下進行10小時的反應，得到血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物。
[0096] 按照《中國藥典》2015年版第四部通則0441核磁共振波譜方法對本發明實施例1 制備得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物進行結構檢測，檢測結果如圖2 所示，圖2為本發明實施例1制備得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物的 核磁共振譜圖，由圖2可知，本發明實施例1制備得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制 劑的復合物具有式I所示的結構。
[0097] 實施例2
[0098] 采用高效液相色譜法對本發明實施例1制備得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP 抑制劑的復合物進行雜質分離，所述高效液相色譜法中的色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵 合硅膠，流動相包括摩爾濃度為35mmol/L的磷酸鹽緩沖液（水相）和體積比為55 :45的 乙腈和甲醇的混合液（有機相），磷酸鹽緩沖液和乙腈和甲醇的混合液的初始體積比為50 : 50,流動相的流速為lmL/min，柱溫為35°C，檢測波長為250nm ;采用梯度洗脫的方法使流動 相通過色譜柱，所述梯度洗脫的方法具體為：在0~35min，水相在流動相中的體積含量由 50 %降低到10 %，有機相在流動相中的體積含量有50 %增加到90 %;在35min~45min，水 相在流動相中的體積含量保持10 %，有機相在流動相中的體積含量保持90 %。
[0099] 本發明實施例2對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物進行雜質分離后 得到的色譜圖如圖3所示，圖3為本發明實施例2提供的方法對血管緊張素受體拮抗劑和 NEP抑制劑的復合物中雜質進行分離后得到的色譜圖，由圖3可知，本發明實施例2提供的 方法分離了血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中的LC-Z09雜質（式h所示結構 化合物）、LC-01雜質（式〇所示結構的化合物）、LC-Z01雜質（式a所示結構的化合物）、 LC-Z17雜質（式m所示結構的化合物）、LC-Z02 (式b所示結構的化合物）、LC-Z03 (式c 所示結構的化合物）、LC-Z18 (式n所示結構的化合物）、LC-Z15雜質（式k所示結構的化 合物）、LC-Z04雜質（式d所示結構的化合物）、LC-Z12雜質（式i所示結構的化合物）、 LC-Z06雜質（式f所示結構的化合物）、LC-Z14 (式j所示結構的化合物）、LC-Z08雜質 (式g所示結構的化合物）、LC-Z16雜質（式1所示結構的化合物）、LC-Z05雜質（式e所 示結構的化合物）。
[0100] 按照上述技術方案所述的方法，測試分離后得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP 抑制劑的復合物純品中的雜質含量和收率；檢測結果為，本發明實施例2提供的雜質分離 方法得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物純品中單種雜質的質量含量均 小于0. 1%。
[0101] 按照上述技術方案所述的方法，測試本發明提供的血管緊張素受體拮抗劑和NEP 抑制劑的復合物中雜質分離的方法的重現性，測試結果如表1和表2所示，表1為本發明實 施例2提供的方法雜質保留時間測試結果，表2為本發明實施例2提供的方法雜質峰面積 的測試結果。
[0102] 表1本發明實施例2提供的方法雜質保留時間測試結果
[0103]
[0104] 表2本發明實施例2提供的方法雜質峰面積的測試結果
[0107] 注：表1和表2中，a~〇為相關雜質（式a~式〇所示結構的雜質）；LC_03和 LC-2為主峰；SS為系統適用性溶液
[0108] 由表1和表2可知，本發明實施例2提供的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑 的復合物中雜質分離的方法具有較好的重現性，方法準確可靠。
[0109] 實施例3
[0110] 采用高效液相色譜法對本發明實施例1制備得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP 抑制劑的復合物進行雜質分離，所述高效液相色譜法中的色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵 合硅膠，流動相包括質量濃度為0. 1 %的三氟乙酸水溶液（水相）和質量比為50 :50的乙 腈和甲醇的混合液（有機相），三氟乙酸水溶液和乙腈和甲醇的混合液的初始體積比為55 : 45,流動相的流速為0. 8mL/min，柱溫為25°C，檢測波長為250nm ;采用梯度洗脫的方法使流 動相通過色譜柱，所述梯度洗脫的方法具體為：在0~35min，水相在流動相中的體積含量 由55%降低到5%，有機相在流動相中的體積含量有45%增加到95% ;在35min~45min， 水相在流動相中的體積含量保持5 %，有機相在流動相中的體積含量保持95 %。
[0111] 本發明實施例3對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物進行雜質分離后 得到的色譜圖如圖4所示，圖4為本發明實施例3提供的方法對血管緊張素受體拮抗劑和 NEP抑制劑的復合物中雜質進行分離后得到的色譜圖，由圖4可知，本發明實施例3提供的 方法分離了血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中的LC-Z09雜質（式h所示結構 化合物）、LC-01雜質（式〇所示結構的化合物）、LC-Z01雜質（式a所示結構的化合物）、 LC-Z17雜質（式m所示結構的化合物）、LC-Z02 (式b所示結構的化合物）、LC-Z03 (式c 所示結構的化合物）、LC-Z18 (式n所示結構的化合物）、LC-Z15雜質（式k所示結構的化 合物）、LC-Z04雜質（式d所示結構的化合物）、LC-Z12雜質（式i所示結構的化合物）、 LC-Z06雜質（式f所示結構的化合物）、LC-Z14 (式j所示結構的化合物）、LC-Z08雜質 (式g所示結構的化合物）、LC-Z16雜質（式1所示結構的化合物）、LC-Z05雜質（式e所 示結構的化合物）。
[0112] 按照上述技術方案所述的方法，測試分離后得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP 抑制劑的復合物純品中的雜質含量和收率；檢測結果為，本發明實施例3提供的雜質分離 方法得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物純品中單種雜質的質量含量均 小于0. 1%。
[0113] 按照上述技術方案所述的方法，測試本發明提供的血管緊張素受體拮抗劑和NEP 抑制劑的復合物中雜質分離的方法的重現性，測試結果如表3和表4所示，表3為本發明實 施例3提供的方法雜質保留時間測試結果，表4為本發明實施例3提供的方法雜質峰面積 的測試結果。
[0114] 表3本發明實施例3提供的方法雜質保留時間測試結果
[0116] 表4本發明實施例3提供的方法雜質峰面積的測試結果
[0117]
[0119] 注：a-o為相關雜質；LC-03和LC-2為主峰；SS為系統適用性溶液
[0120] 由表3和表4可知，本發明實施例3提供的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑 的復合物中雜質分離的方法具有較好的重現性，方法準確可靠。
[0121] 實施例4
[0122] 采用高效液相色譜法對本發明實施例1制備得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP 抑制劑的復合物進行雜質分離，所述高效液相色譜法中的色譜柱填充劑為十八烷基硅烷 鍵合硅膠，流動相包括質量濃度為0.1%的甲酸水溶液（水相）和乙腈（流動相），甲酸 水溶液和乙腈的初始體積比為45 :55,流動相的流速為1. 2mL/min，柱溫為30°C，檢測波長 為250nm ;采用梯度洗脫的方法使流動相通過色譜柱，所述梯度洗脫的方法具體為：在0~ 35min，水相在流動相中的體積含量由45 %降低到15 %，有機相在流動相中的體積含量有 55%增加到85%;在351^11~451^11，水相在流動相中的體積含量保持15%，有機相在流動 相中的體積含量保持85 %。
[0123] 本發明實施例4對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物進行雜質分離后 得到的色譜圖如圖5所示，圖5為本發明實施例4提供的方法對血管緊張素受體拮抗劑和 NEP抑制劑的復合物中雜質進行分離后得到的色譜圖，由圖5可知，本發明實施例4提供的 方法分離了血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中的LC-Z09雜質（式h所示結構 化合物）、LC-01雜質（式〇所示結構的化合物）、LC-Z01雜質（式a所示結構的化合物）、 LC-Z17雜質（式m所示結構的化合物）、LC-Z02 (式b所示結構的化合物）、LC-Z03 (式c 所示結構的化合物）、LC-Z18 (式n所示結構的化合物）、LC-Z15雜質（式k所示結構的化 合物）、LC-Z04雜質（式d所示結構的化合物）、LC-Z12雜質（式i所示結構的化合物）、 LC-Z06雜質（式f所示結構的化合物）、LC-Z14 (式j所示結構的化合物）、LC-Z08雜質 (式g所示結構的化合物）、LC-Z16雜質（式1所示結構的化合物）、LC-Z05雜質（式e所 示結構的化合物）。
[0124] 按照上述技術方案所述的方法，測試分離后得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP 抑制劑的復合物純品中的雜質含量和收率；檢測結果為，本發明實施例4提供的雜質分離 方法得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物純品中單種雜質的質量含量均 小于0. 1%。
[0125] 按照上述技術方案所述的方法，測試本發明提供的血管緊張素受體拮抗劑和NEP 抑制劑的復合物中雜質分離的方法的重現性，測試結果如表5和表6所不，表5為本發明實 施例4提供的方法雜質保留時間測試結果，表6為本發明實施例4提供的方法雜質峰面積 的測試結果。
[0126] 表5本發明實施例4提供的方法雜質保留時間測試結果
[0128] 表6本發明實施例4提供的方法雜質峰面積的測試結果
[0130] 注：a-o為相關雜質；LC-03和LC-2為主峰；SS為系統適用性溶液
[0131] 由表5和表6可知，本發明實施例5提供的血管緊張素受體詰抗劑和NEP抑制劑 的復合物中雜質分離的方法具有較好的重現性，方法準確可靠。
[0132] 比較例1
[0133] 采用高效液相色譜法對本發明實施例1制備得到的血管緊張素受體拮抗劑和NEP 抑制劑的復合物進行雜質分離，所述高效液相色譜法中的色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵 合硅膠，流動相包括質量濃度為0. 1%的冰醋酸水溶液（水相）和乙腈（有機相），〇. 1%的 冰醋酸水溶液和乙腈的初始體積比為45 :55,流動相的流速為1. OmL/min，柱溫為35°C，檢 測波長為250nm ;采用梯度洗脫的方法使流動相通過色譜柱，所述梯度洗脫的方法具體為： 在0~35min，水相在流動相中的體積含量由45 %降低到10 %，有機相在流動相中的體積含 量有55 %增加到90 %;在35min~45min，水相在流動相中的體積含量保持10 %，有機相在 流動相中的體積含量保持90 %。
[0134] 本發明比較例1對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物進行雜質分離后 得到的色譜圖如圖6所示，圖6為本發明比較例1提供的方法對血管緊張素受體拮抗劑和 NEP抑制劑的復合物中雜質進行分離后得到的色譜圖，由圖6可知，本發明比較例1提供的 方法分離血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中的雜質，雜質與主峰不能達到基 線分離，分離效果較差。
[0135] 由以上實施例可知，本發明提供了一種血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復 合物中雜質的分離方法，包括：采用高效液相色譜法對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制 劑的藥物組合物進行雜質分離；所述高效液相色譜法中的流動相包括水相和有機相；所述 水相包括磷酸鹽緩沖液、三氟乙酸溶液或甲酸溶液；所述有機相包括有機混合物或乙腈， 所述有機混合物包括乙腈和甲醇；所述水相和有機相的體積比為（45%~65%) : (55%~ 35% )。本發明采用高效液相色譜法進行雜質分離，在高效液相色譜過程中選用的流動相包 括特定成分的水相和有機相，采用這種流動相能夠有效地分離出血管緊張素受體拮抗劑和 NEP抑制劑的復合物中的多種雜質。
【主權項】
1. 一種血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的復合物中雜質的分離方法，包括： 采用高效液相色譜法對血管緊張素受體拮抗劑和NEP抑制劑的藥物組合物進行雜質 分離； 所述高效液相色譜法中的流動相包括水相和有機相； 所述水相包括磷酸鹽緩沖液、三氟乙酸溶液或甲酸溶液； 所述有機相包括有機混合物或乙腈，所述有機混合物包括乙腈和甲醇； 所述水相和有機相的體積比為（45%~65% ) : (55%~35% )。2. 根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的摩爾濃度為 25mmol/L ~45mmol/L〇3. 根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述三氟乙酸溶液的體積濃度為 0· 05%~0· 15%〇4. 根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述甲酸溶液的體積濃度為 0· 05%~0· 15%〇5. 根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述有機混合物中的乙腈和甲醇的 體積比為（50~60) : (50~40)。6. 根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述高效液相色譜法中的水相和有 機相的體積比為（50%~60% ) : (50%~40% )。7. 根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述高效液相色譜法中的流動相流 速為 0· 5mT,/miη ~L 5mL/min〇8. 根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述高效液相色譜法中的柱溫為 25°C~45°C。9. 根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述高效液相色譜法中的色譜柱填 充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠或八烷基硅烷鍵合硅膠。10. 根據權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述高效液相色譜法中的檢測波長 為 240nm ~260nm。
【文檔編號】G01N30/02GK105929031SQ201510958419
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2015年12月18日
【發明人】張磊, 石功名, 張小嬌, 孫丹, 李俊平, 賀耘
【申請人】重慶兩江藥物研發中心有限公司